Identification d'une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est de faciliter l’identification des événements d’énucléation avec une sous-population aurn d’érythroblastes. La première étape consiste à créer une population enrichie en événements de nucléation. Ceci est accompli par culture d’érythropoïèse in vitro, soit à long terme à partir de cellules de moelle osseuse de faible densité isolées des fémurs, du tibia et des os pelviens d’une souris non stressée, soit à court terme.

En commençant par les cytes de la rate d’une souris préalablement soumise à une phlébotomie afin de monter l’érythropoïèse de stress. Les cellules cultivées à l’étape finale de la culture sont fixées, imprégnées et colorées avec les marqueurs fluorescents d’intérêt. Ces cellules sont analysées sur un cytomètre en flux d’imagerie, puis analysées pour identifier les cellules subissant l’énucléation dans la population de cellules nucléantes, la signalisation et l’identification des composants cytosquelettiques qui régulent et médient le processus d’énucléation.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie fluorescente est que le nombre nettement plus important de cellules nucléantes peut être observé et analysé en peu de temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’érythropoïèse, telles que les mécanismes moléculaires impliqués dans la nucléation des érythroblastes. Pour différencier les cellules érythroïdes des cellules de moelle osseuse de faible densité, commencez par ajouter un millilitre de milieu de culture dans un tube de cytométrie en flux stérile.

Ensuite, fixez une aiguille de calibre 25 par cinq huitièmes de pouce à une seringue à tuberculine et rincez doucement le milieu de culture frais à travers les fémurs et le tibia récoltés à quelques reprises dans le tube de cytométrie en flux. Après avoir ajusté le volume de suspension cellulaire à cinq millilitres avec IMDM, superposez soigneusement sur cinq millilitres de milieu de séparation cellulaire à gradient de densité de 1,083 gramme par millilitre dans un tube de 15 millilitres. Transférez le tout jusqu’à la marque des deux millilitres dans un nouveau tube de 15 millilitres et lavez la couche leucocytaire collectée avec des poux de milieu de culture frais, les globules rouges dans trois millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant cinq minutes à température ambiante après avoir lavé les cellules dans le milieu de culture et suspendu la pastille dans la même plaque, les cellules dans une plaque de culture cellulaire à six puits à une concentration de cinq fois 10e des cinquièmes cellules par puits jusqu’à un volume final de 2,5 millilitres dans un milieu de croissance et incuber les cellules à 37 degrés Celsius cinq jours après la mise en plaque de la culture.

Comptez le nombre d’érythroblastes dans chaque puits de la plaque de culture d’origine, puis transférez chaque puits dans des tubes coniques individuels correspondants de 15 millilitres. Après avoir fait tourner les cellules, aspirez les surnageants et remettez les granules en suspension dans un milieu de croissance frais contenant uniquement de l’érythropoïétine à une concentration de deux fois 10 des cinquièmes cellules par millilitre. Ensuite, aspirez le surnageant d’une plaque de cellules MS cinq et ajoutez les cellules érythroïdes dans les puits.

Deux jours plus tard, remplacer le surnageant par un milieu de croissance frais sans cytokines et érythroblastes provenant de cytes PLE de faible densité. Utilisez le piston d’une seringue de cinq millilitres pour faire macérer la rate à travers une passoire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres. Lavez la passoire cellulaire avec un milieu de croissance et ajustez le volume final de suspension cellulaire à cinq millilitres.

Ensuite, après avoir séparé les couches cellulaires par gradient de densité comme nous venons de le démontrer, lavez les globules rouges et lavez les cytes dans sept millilitres de milieu de culture. Ensuite, Resus suspend la pastille dans un milieu de croissance complété par des cytokines et incube les cellules à une à cinq fois 10 à six cellules dans un volume final d’un millilitre par puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain.

Transférez les cellules dans des puits contenant des cellules MS cinq adhérentes comme décrit précédemment et analysez-les après six à huit heures, collectez les érythroblastes des puits de culture et fixez-les dans 500 microlitres de formaldéhyde à 3,7 % dans PBS Resus, en suspendant la pastille avec un pipetage doux. Après 15 minutes, faites tourner les cellules à 2000 GS pendant 20 secondes dans une micro-centrifugeuse, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres de PBS. Après avoir fait tourner les cellules dans la micro-centrifugeuse, aspirez à nouveau le surnageant et placez les cellules sur de la glace pendant au moins 15 minutes.

Mettez moins 20 degrés Celsius, les solutions d’acétone stockées sur de la glace. Ensuite, remettez rapidement en suspension et faites tourner les cellules dans une série de lavages à l’acétone comme indiqué après le lavage du tampon de télécopie, incubez les granules cellulaires dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps approprié pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, après avoir lavé à nouveau les cellules dans le tampon de télécopie, mettez à nouveau en suspension les pastilles soutenues dans 60 microlitres de tampon de télécopie contenant cinq drac et analysez les échantillons sur un cytomètre de flux d’imagerie recueillant au moins 10 000 événements par échantillon expérimental.

Ensuite, commencez l’analyse en sélectionnant les cellules en fonction de leur rapport d’aspect en fond clair, du rapport entre la longueur de leur axe mineur et de leur axe principal et de leur zone en fond clair, qui est indicative de leur taille. Les événements dont la valeur de la zone en fond clair est inférieure à 20 et supérieure à 200 sont principalement des débris et des agrégats de cellules, respectivement, et sont exclus de l’analyse. Ensuite, analysez les cellules individuelles en fonction de leur valeur pour le paramètre de gradient RMS, qui indique la netteté de l’image, créez une deuxième porte contenant les cellules dont la valeur RMS de gradient est supérieure au 50e centile afin de sélectionner les images prises bien au point.

Porte suivante, les cellules en fonction de leur taille mesurée par leur surface en fond clair et de leur positivité pour le marqueur érythroïde TER un 19 mesurée par le colorant fluorescent TER un 19 Les cellules du paramètre de pixel moyen très faible ou très élevé pour TER 19 sont respectivement des agrégats de cellules non érythroïdes ou restants et sont exclues de l’analyse à l’étape suivante. Les cellules sont sélectionnées en fonction de l’intensité de leur rapport d’aspect DR cinq, du rapport entre l’axe mineur et l’axe majeur de leur noyau et de l’intensité de leur expression d d cinq. DR cinq cellules négatives, principalement des cellules énucléées telles que les réticulocytes et les globules rouges, et les cellules avec un faible rapport d’aspect de cinq.

La plupart du temps, les doublets sont exclus de la démarche d’analyse. Ils traînent cinq cellules positives à l’ADN, qui sont pour la plupart des érythroblastes à ce stade. Ces érythroblastes sont ensuite analysés en fonction de leur zone TER 19, qui indique la taille de la cellule et de leur surface de pixel moyenne TER 19 ou de la densité de l’expression de TER 19, qui indique la luminosité de leur coloration TER 19.

Les érythroblastes orthochromatiques sont reconnus comme de petites cellules TER un 19 de haut. Enfin, une sous-population d’érythroblastes orthochromatiques est caractérisée par leur faible rapport d’aspect en fond clair et leur delta sentu XY TUR one 19 élevé. DR cinq, défini par la distance entre le centre du réticulocyte 19 positif TUR naissant et le centre du noyau positif DR cinq, ainsi que l’anticorps contre son 19 et la coloration d’ADN DRAAK cinq.

Les cellules sont généralement également colorées pour identifier la localisation de l’actine f pendant l’érythroblaste et la nucléation. Il convient de noter que la progression de l’énucléation peut être visualisée sous forme de cellules avec un rapport d’aspect décroissant. C’est-à-dire des cellules qui deviennent de plus en plus allongées et avec une augmentation delta OID xy TUR un 19 traînée cinq sont observées.

L’actine F se concentre au niveau du sillon de clivage pendant la nucléation, puis se dissipe une fois le noyau extrudé. D’autres protéines et structures d’intérêt peuvent également être colorées avec les anticorps appropriés ou des marqueurs fluorescents pour permettre l’imagerie de leurs rôles lors de l’énucléation. Par exemple, la formation de microtubules polarisés peut être visualisée dans les érythroblastes orthochromatiques de type sauvage avant une nucléation, mais pas dans les érythroblastes traités à la colchicine.

L’inhibition de la polymérisation de la tubuline par la colchicine diminue la polarisation cellulaire, comme démontré par la mesure du paramètre delta OID XYB FDR cinq entre le centre du corps cellulaire observé dans le canal Brightfield et le centre de la coloration nucléaire obtenue avec DR cinq. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie à fluorescence peuvent être réalisées pour répondre aux questions concernant les interactions entre différents types de cellules impliquées dans l’érythropoïèse telles que celles observées dans les îlots érythroblastiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les événements d’énucléation dans une population enrichie en érythroblastes.