Isolement de glandes multicellulaires viables à partir de tissus de la plante carnivore, Nepenthes

Le but de la méthode présentée est d'obtenir des glandes uniques et pures à partir de tissu végétal frais pour une analyse moléculaire. Cela est réalisé en récoltant d'abord un piège à insectes de la plante Nepenthes. Le tissu est ensuite fixé directement sur une plateforme de micro-échantillonnage placée sur de la glace afin de maintenir le tissu au frais.

Au cours de la procédure de micro-échantillonnage, les glandes sont isolées de manière précise et transférées dans un tube PCR avant de réaliser une analyse par PCR quantitative sur le matériel récolté. En fin de compte, la technologie mécanique de micro-échantillonnage est utilisée pour obtenir des glandes uniques et pures à partir de plantes napes afin de fournir rapidement et de manière micro-invasive un tissu spécifique pour des analyses moléculaires ultérieures. Les plantes carnivores sont des spécialistes parmi la flore car elles sont capables de digérer des protéines animales.

Notre connaissance sur le fonctionnement de ce processus au niveau moléculaire est encore limitée. Un bon modèle pour aborder cette question est l'association d'images de l'appendice génial, car il possède des organes distincts, des images qui produisent des glandes contribuant aux processus digestifs. Dans l'appendice.

Ces glandes se trouvent à l'intérieur des images en bas. Pour l'analyse moléculaire, il est nécessaire d'isoler ces structures larges et plates, ayant un diamètre d'environ 100 à 200 micromètres, directement à partir de tissu frais. Pour rendre la tâche plus difficile, les glandes sont recouvertes par une capuche protectrice.

Présentant une structure similaire à celle d'un abri pour voiture, ce système nécessite des observations tridimensionnelles lors de l'échantillonnage, ainsi qu'un outil capable de se déplacer délicatement dans les trois dimensions. Nous avons constaté que les techniques actuelles de microdissection ne permettaient pas de résoudre nos problèmes. Un laser, par exemple, s'est révélé inefficace en raison de la forte teneur en eau du tissu végétal.

Par conséquent, nous avons décidé d'utiliser une nouvelle technique de microdissection mécanique appelée aika, spécifiquement conçue pour isoler des parties de tissus ou même des cellules uniques au sein de structures tridimensionnelles. Cette technique repose sur un microscope stéréo ou un microscope à somme, auquel est intégré un micro-manipulateur 3D disposé de manière à pouvoir facilement atteindre des objets très plats ou très élevés. L'ensemble se déplace conjointement avec le microscope comme un pilier. Pour les prélèvements sur les plantes, nous utilisons fréquemment des microcapillaires.

Cependant, dans le cas du verre d'appendice, nous avons constaté que la pince micro-actuée par effet piézoélectrique fonctionne de manière plus efficace pour notre procédure. En ce qui concerne l'appendice, la plateforme a été modifiée. Un petit plateau VXY supporte un récipient rempli de glace suffisamment grand pour contenir à la fois l'échantillon de tissu avec son support et l'endroit où la glande sera déposée.

La glace fait en sorte que les processus de gradation au sein du tissu soient ralentis au point qu'il est possible de reconnaître l'état moléculaire d'origine du tissu. La procédure suivante a été établie à partir de la partie inférieure d'une image. Un fragment d'environ un à deux centimètres carrés est excisé, puis aplati.

Le tissu est ensuite fixé sur une lame au moyen d'un ruban adhésif double face. Cet échantillon de tissu est recouvert d'eau exempte d'ARN et reste humide pendant le processus de prélèvement. L'échantillon est ensuite positionné de manière à ce que les glandes et les capuchons protecteurs soient orientés vers le côté du manipulateur.

L'angle entre l'échantillon et l'outil doit être ajusté de manière à ce que les glandes soient à plat. À l'aide d'un plateau universel, l'inclinaison peut être ajustée selon deux axes et corrigée facilement sous le microscope. Le plateau métallique maintient l'échantillon au frais sous le microscope.

Les glandes sont bien distinctes. La fluorescence permet de reconnaître facilement le contour de la glande ainsi que celui du capuchon protecteur. L'échantillon est observé à l'aide d'un filtre FSE pour l'isolement des glandes.

Pour l'extraction d'ARN, un filtre UV est utilisé. Un positionnement très précis de la pince microchirurgicale est essentiel pour l'isolement de la glande. Il est recommandé de manipuler l'outil en mode basse vitesse.

Avec la pince microchirurgicale, on approche une glande et on place les branches à ses limites à l’aide du joystick ; la pince microchirurgicale est alors délicatement fermée. La glande est ensuite soulevée du tissu environnant. Après une isolation précise, la cavité intacte apparaît, mettant en évidence le tissu vasculaire sous-jacent.

La glande isolée est ensuite transférée dans le tube de PCR et déposée dans le tampon préparé. Pour valider cette méthode, l'expression du gène codant pour la protéine courte de la patte d'atome, TAP, qui est sécrétée dans la goutte de fluide, a été déterminée ; le gène peut être amplifié directement à partir des glandes sans extraction préalable d'ADN génomique. Il suffit d'ajouter le mélange de réaction PCR au tissu isolé.

La série d'expériences a impliqué des glandes provenant de plantes Nepenthes ayant subi différents traitements, ainsi que des échantillons prélevés sur leurs tissus épidermiques environnants. Pour chaque expérience, l'ARN total a été extrait. L'ARNm obtenu a été rétrotranscrit en ADN complémentaire correspondant par transcription inverse, puis utilisé pour la réaction de PCR ultérieure.

Pour amplifier la séquence génique d'intérêt, une PCR en temps réel a été utilisée afin de comparer le niveau d'expression de TLP dans les glandes et l'épiderme de nepenthes. Les résultats montrent que le niveau de transcrit TLP est plus élevé dans les glandes sécrétrices par rapport au tissu épidermique, tant chez Nepenthes allotta que chez Nepenthes miis, comme visualisé par un rapport tissu épidermique sur tissu glandulaire inférieur à un, afin de tester si le contact avec les proies pouvait induire l'expression génique. Les niveaux de transcrit TLP et des images non traitées ont été comparés à des images après alimentation avec Drosophila melanogaster, suite à la capture de proies.

Le tissu épidermique présentait ici une expression plus élevée de TLP. Le niveau d'expression transcriptionnelle de TLP dans les glandes et le tissu épidermique, ainsi qu'une image traitée de Nepenthes miis, ont été comparés. La surexpression de TLP dans les deux types de tissus indique que la production de protéines du liquide des urnes peut effectivement être induite par les proies.

Les résultats de PCR suggèrent que l'alimentation modifie efficacement l'expression de TLP dans les deux types de tissus et peut modifier le rapport d'expression entre glande et épiderme. Nous avons mis au point une méthode efficace pour récolter du tissu d'appendice FA exempt de contaminants et isoler une quantité suffisante d'ARNm pour réaliser des expériences d'expression génique. Grâce à cette nouvelle méthode que nous avons développée, il est non seulement possible d'étudier la transcriptomique dans les glandes de l'appendice, mais également d'aborder la métabolomique ainsi que la protéomique.