Évaluer la réponse Myogenic et vasoactivité dans les artères mésentériques Résistance Utilisation myographie de pression

L'objectif général de cette procédure est de déterminer l'effet d'un agent pharmacologique ou d'un état pathologique sur le tonus vasculaire induit par la pression dans les petites artères mésentériques de résistance. Cela est réalisé en isolant d'abord l'arcade mésentérique à partir d'un modèle murin. La deuxième étape consiste à disséquer les artères de résistance de quatrième ordre.

Les étapes suivantes sont la canulation, la pressurisation et l'incubation de la préparation artérielle. Dans le PSS, la dernière étape consiste à évaluer l'intégrité physiologique de la préparation artérielle, ce qui se manifeste par l'apparition spontanée d'un tonus vasculaire et une réponse réversible appropriée à un vasoconstricteur et à un vasodilatateur. Enfin, la constriction induite par la pression peut être mesurée.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic de l'hypertension, de l'hypotension ou d'un dysfonctionnement vasculaire. Cette technique identifie en effet les mécanismes clés sous-jacents aux changements induits par la pression dans le tonus vasculaire, qui constitue un déterminant essentiel de la résistance vasculaire, de la perfusion et de la pression artérielle. Ce protocole sera démontré par le Dr Jja, chercheur postdoctoral dans notre laboratoire.

Commencez cette procédure en insérant une canule en verre dans un porte-pipette micro et en fixant le porte-pipette micro à une chambre de perfusion afin de préparer la chambre de perfusion. Rincez-la avec de l'eau Milli Q, puis avec la solution de dissection pendant cinq minutes chacune. Ensuite, chargez la chambre avec deux millilitres de solution de dissection.

Ensuite, remplir soigneusement toute la canule et le tube raccordé sans générer de bulles. Préparer deux sutures, chacune avec un nœud simple, à l’aide de pinces contondantes sous le microscope de dissection. Utiliser les pinces de dissection pour charger les deux canules avec les nœuds de suture partiellement fermés, légèrement éloignés de l’extrémité.

Ensuite, réalisez une laparotomie médiane sur un rat anesthésié, de la région pelvienne jusqu'au sternum, en effectuant d'abord une incision dans la peau, puis une incision dans la couche musculaire sous-jacente. Il faut prendre soin de ne pas endommager les organes intra-abdominaux. Liez séparément les deux extrémités afin d'éviter toute fuite de chyme et de matières fécales, et ainsi prévenir une contamination de la solution bain extracellulaire.

Ensuite, sectionner l'extrémité proximale de l'intestin près du porus et l'extrémité distale, près de la jonction iléocæcale. Puis pratiquer une incision sur le mésentère à sa base, près des vaisseaux sanguins d'alimentation. Ensuite, transférer l'ensemble du lit mésentérique de l'intestin grêle dans un bécher de 50 millilitres contenant une solution de dissection glacée et incuber pendant cinq minutes.

Ensuite, rincez-le avec une solution de dissection fraîche pour éliminer le sang. Maintenant, fixez l'extrémité proximale de l'intestin du côté droit dans une boîte recouverte de sardine, puis étendez le reste de l'intestin selon un trajet en sens inverse des aiguilles d'une montre. Fixez le segment pour étaler le mésentère et exposer les vaisseaux sanguins sous un microscope stéréo à zoom.

Dissez les artères mésentériques petites de troisième et quatrième ordre parallèlement à l'intestin grêle en retirant d'abord toutes les graisses environnantes près de la branche de deuxième ordre. Ensuite, disséquez la veine et isolez l'artère présentant un point de branchement en forme de V. Veillez à ne pas percer le segment sélectionné.

Ensuite, isolez une section de quatre à cinq millimètres de l'artère qui est parallèle à l'intestin grêle. Coupez toutes les branches de cinquième ordre qui pénètrent dans l'intestin grêle légèrement en amont de leur point d'origine et conservez un fragment. Ces fragments serviront de sites de fixation pour transférer les segments artériels dans une chambre de perfusion, puis guider leur canulation.

Ensuite, couper les segments artériels en effectuant deux incisions au-delà des branches de cinquième ordre de chaque côté de l'artère et les transférer dans la chambre de perfusion. Cannuler une extrémité des vaisseaux sur une micropipette en verre en tenant l'extrémité du segment artériel avec des pinces de dissection. Faire glisser la suture partiellement fermée préalablement chargée sur l'extrémité cannulée et la fixer fermement.

Ensuite, fixez une seringue de 10 millilitres chargée de solution de dissection au robinet à trois voies relié à cette canule. Soulevez doucement la seringue. La force de gravité exercée sur la solution permettra d'éliminer le sang intravasculaire par l'extrémité ouverte du vaisseau.

Après avoir retiré le sang intra-artériel, fermez le robinet. Attachez maintenant l'extrémité distale des vaisseaux à une deuxième canule en verre en approchant soigneusement l'autre canule aussi près que possible de l'extrémité non ligaturée du segment artériel. Faites glisser le fil de suture chargé précédemment et partiellement fermé sur l'extrémité canulée et fixez-le fermement.

Il faut faire attention de ne pas tirer sur les segments artériels et s'assurer que les robinets à trois voies fixés aux deux canules sont fermés. Transférez la chambre de perfusion sur la platine du microscope inversé équipé d'un système d'enregistrement vidéo en direct. Ensuite, reliez le robinet à trois voies de la canule liée à l'extrémité proximale du segment artériel à un dispositif servo-commandé de régulation de pression.

Veillez à ce que le robinet de la deuxième canule reste fermé afin de maintenir une pression intraluminale stable. Ensuite, reliez le tube d'aspiration au tube de perfusion et le port d'aspiration au port de perfusion de la chambre. Commencez à perfuser le vaisseau avec du PSS chaud à l’aide du réchauffeur de solution en ligne unique, à un débit de deux millilitres par minute.

À l’aide d’une pompe péristaltique, activez le vide tout en maintenant la température du PSS dans la chambre proche de 37 degrés Celsius. Augmentez progressivement la pression intraluminale de 20 à 100 millimètres de mercure. Vérifiez la présence de fuites au niveau du vaisseau en utilisant le réglage automatique de pression du régulateur de pression.

Ensuite, évaluer la présence de courbures sur le segment artériel tout en maintenant la pression à 100 millimètres de mercure. À l’aide du levier à vis, déplacer la canule afin de redresser le segment artériel, sans étirer excessivement les segments artériels. Puis réduire la pression à 70 millimètres de mercure pour imiter la pression in vivo dans l’arcade mésentérique, et laisser le segment artériel se stabiliser et développer un tonus myogénique.

Dans cette procédure, observer l'artère avec un objectif 10 x au microscope équipé d'une caméra vidéo monochrome. Brancher l'appareil. Mesurer le diamètre luminal à l'aide d'un numériseur de trames vidéo et d'un système de détection en temps réel des bords.

Ensuite, enregistrez le diamètre du vaisseau et surveillez le développement du tonus myogénique. Après cela, réduisez la pression à 20 millimètres de mercure et laissez le diamètre se stabiliser. Puis augmentez la pression intraluminale par paliers successifs, tels que 20, 40, 60, 80 et 100, et laissez l'artère atteindre un diamètre stable à chaque pression.

Étape suivante, répétez la réponse au changement de pression dans une solution saline PSS sans calcium contenant 0,39 millimolaire d'EGTA et 0,1 millimolaire de nitroprussiate de sodium, comme indiqué par le tracé. Le diamètre des artères mésentériques petites de rats diminue spontanément lorsqu'elles sont soumises à une pression de 70 millimètres de mercure. L'ajout de 1 micromolaire d'acétylcholine augmente le diamètre jusqu'à une valeur proche du diamètre initial. L'ajout de 1 micromolaire de phényléphrine dans le bain tissulaire diminue le diamètre artériel, et cette figure montre que l'incubation des artères mésentériques petites dans une solution PSS sans calcium augmente le diamètre artériel. Le diamètre d'un segment artériel unique sous pression dans divers milieux de perfusion est indiqué dans ce tableau.

Ici, le diamètre artériel est enregistré en continu tout en augmentant progressivement la pression intraluminale en présence de PSS et de PSS sans calcium. Voici les courbes du diamètre artériel obtenu à chaque étape de pression, et l'histogramme du tonus myogénique obtenu à chaque étape de pression est affiché ici désactivé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer le comportement myogénique des petites artères de résistance.

Grâce à cette technique, vous pouvez réaliser des procédures supplémentaires telles que la disruption endothéliale et la perméabilisation artérielle. Ces deux procédures permettent de répondre à des questions supplémentaires concernant le rôle de l'endothélium et du calcium dans la régulation du tonus vasculaire des petites artères de résistance.