Caractéristiques des précipitations formées polyéthylène Microgels glycol sont commandés par le poids moléculaire des réactifs

Le but général de cette procédure est de former des microgels de polyéthylène glycol au moyen d'une réaction de précipitation photo-polymérisée, afin de les utiliser comme vecteurs de délivrance de médicaments et comme supports pour l'ingénierie tissulaire. Cette opération s'effectue tout d'abord en préparant les réactifs, notamment un photoinitiateur, des tampons, la triéthylamine et une solution de PEG DL, puis en les portant à 37 degrés Celsius. La deuxième étape consiste à placer les réactifs dans un tube microcentrifuge et à les mélanger par vortexage, tout en maintenant une température de 37 degrés Celsius.

Ensuite, on mélange du sulfate de sodium et on expose la solution à une lumière UV afin d'induire la réticulation pendant 30 secondes. Après la réticulation, une couche trouble apparaît à la surface de la solution et contient les microgels. La dernière étape consiste à ajouter du PBS au mélange, puis à centrifuger afin d'obtenir un culot.

En fin de compte, la microscopie et la diffusion dynamique de la lumière sont utilisées pour mesurer la taille des microgels, tandis que la densité est déterminée à l’aide d’un gradient de densité de dextrine. De plus, le degré de gonflement est calculé en mesurant les masses humide et sèche des microgels. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que les techniques d’émulsion, de suspension et de dispersion, est que les microgels formés par réaction de précipitation présentent un indice de polydispersité faible, sans utilisation de solvants organiques ou d’agents stabilisants ; les conditions douces de la réaction de précipitation, les propriétés personnalisables des microgels et leur faible viscosité pour les injections les rendent adaptés aux applications NVivo.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire et de la médecine régénérative, comme la fabrication de supports présentant à la fois une taille uniforme et un indice de polydispersité faible. Les implications de cette technique peuvent s'étendre vers la thérapie de délivrance de médicaments, car les facteurs de croissance présents dans les médicaments peuvent être facilement encapsulés. Pour commencer, peser 500 milligrammes de l'amorceur photo et l'ajouter à 100 millilitres d'eau déionisée afin d'obtenir une solution à 0,5 %.

Protégez la solution contre la lumière UV et chauffez-la à 40 degrés Celsius en agitant constamment pendant environ une heure afin de dissoudre complètement l'initiateur photochimique. Après dissolution complète, filtrez stérilement la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,22 micron et stockez-la à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à son utilisation. Ensuite, préchauffez la triéthylamine à 37 degrés Celsius pour réduire sa viscosité.

Ensuite, ajoutez 612 microlitres de ce mélange ainsi que 260 microlitres d'acide chlorhydrique à six molaire à 39,4 millilitres de PBS et ajustez le pH à 7,8 de manière stérile. Filtrez la solution finale à l’aide d’un filtre de 0,22 micron et conservez-la à 37 degrés Celsius jusqu’à son utilisation. Selon la méthode décrite par Sony à tous acro lte, préparez les précurseurs de PEG selon les protocoles publiés et stockez le produit fini à moins 20 degrés Celsius sous Argon. Puis, juste avant utilisation, préparez un millilitre d’une solution de diacrylate de Peg à 200 milligrammes par millilitre en ajoutant lentement 0,8 millilitre de PBS contenant du triéthanolamine et de l’acide chlorhydrique à 200 milligrammes de diacrylate de Peg.

Également, juste avant l'expérience, peser 213 milligrammes de sulfate de sodium et les dissoudre dans un millilitre d'eau déionisée. Pour préparer une solution à 1,5 molaire, chauffer la solution à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis vortexer la solution jusqu'à ce qu'elle soit complètement dissoute. Une fois dissoute, filtrer à 37 degrés Celsius la solution finale de sulfate de sodium et la solution de PEG diacrylate à travers des filtres de 0,22 micron.

Combiner 127,5 microlitres de PBS avec du triéthylamine et de l'acide chlorhydrique, 10 microlitres du photo-initiateur à 0,5 % et 25 microlitres de la solution de Peg diacrylate à 200 milligrammes par millilitre dans un tube microcentrifuge de 1,6 millilitre. Ajouter ensuite les molécules souhaitées pour encapsulation.

Chauffer ces tubes ainsi que la solution de sulfate de sodium 1,5 molaire à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite 87,5 microlitres de la solution de sulfate de sodium 1,5 molaire préalablement chauffée dans le premier tube contenant la solution de PEG, et mélanger le tube en aspirant et en expulsant la solution trois à cinq fois à l’aide d’une pipette. Après le mélange, la concentration en sel sera uniformément répartie et la solution devrait devenir limpide.

Placer le tube sous la lumière UV et réticuler pendant 30 secondes après la réticulation. Une couche trouble doit apparaître au-dessus de la solution contenant les microgels. Ensuite, ajouter 750 microlitres de PBS dans le tube et mélanger soigneusement la solution par vortexage.

Ensuite, centrifuger le mélange à 4 000 × g pendant deux minutes afin de former un culot. Une fois le culot formé, éliminer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot et resuspendre les microgels dans du PBS frais. Laver les microgels un total de cinq fois avec du PBS frais, en effectuant une centrifugation entre chaque lavage.

Après le dernier lavage, éliminer le surnageant et prélever au pipet 30 microlitres de microgels à partir du culot dans un millilitre d'eau déionisée. Ensuite, soniquer la solution de microgels dans un bain ultrasonore pendant une heure à une fréquence de 50 à 60 hertz et une puissance de 1,4 ampère. Puis, pipeter 15 microlitres de la solution de microgels sur une lame de verre propre traitée à l'acide et poser une lamelle traitée à l'acide numéro 1,5 par-dessus.

Retournez la lame sur un essuie-tout de laboratoire et appuyez doucement sur la lame pour éliminer l'excès de solution et vous assurer que les microgels forment une seule couche. Ensuite, à l'aide d'un microscope optique, capturez plusieurs images des microgels en utilisant un objectif à immersion huile DIC 100 x. Mesurez les microgels afin d'obtenir un diamètre représentatif.

Calculez l'indice de polydispersité à l'aide de l'équation basée sur le volume indiquée ici, dans laquelle N représente le nombre total de microgels et VI le volume du microgel. Afin de mesurer la densité moyenne des microgels, préparez tout d'abord des solutions de dextrine à 7, 6, 5, 4, 3 et 1 % dans de l'eau déionisée ; les densités des solutions de dextrine sont indiquées ici. Ensuite, ajoutez deux millilitres de la solution de dextrine à 7 % dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Ensuite, pipeter lentement deux millilitres de la solution de dextrine à 6 % afin de former une couche distincte au-dessus de la dextrine à 7 %. Après cinq minutes, ajouter deux millilitres de la couche suivante composée de dextrine à 5 %, et continuer ainsi jusqu'à ce que chaque concentration de dextrine soit superposée par ordre décroissant de concentration en dextrine. Puis déposer soigneusement les microgels au-dessus de la solution de dextrine à 1 %, et centrifuger le gradient à cinq degrés Celsius à 4 000 fois la gravité pendant 10 minutes.

Ensuite, visualisez la position des microgels et calculez la densité des microgels en fonction de leur position entre les couches. Pour mesurer la masse gonflée des microgels, prétarez d'abord un tube de microcentrifugation, puis ajoutez un millilitre de microgels. Lavez les microgels cinq fois avec de l'eau désionisée, en rinçant entre chaque lavage.

Centrifuger l'échantillon pendant 10 minutes à 4 000 ×g afin de former un culot des microgels après le dernier lavage. Les resuspendre dans de l'eau déionisée et laisser gonfler pendant au moins 48 heures. Après 48 heures, centrifuger les microgels gonflés pendant 10 minutes à 4 000 ×g, puis éliminer tout le surnageant.

Ensuite, peser l'échantillon et noter la masse humide. Une fois la masse humide exacte obtenue, congeler les microgels à moins 80 degrés Celsius, puis les lyophiliser afin d'éliminer l'eau et d'obtenir la masse sèche. Une fois toute l'eau sublimée, calculer la teneur en eau et en polymère dans les microgels à l'aide des équations indiquées ici, où MS représente la masse humide des microgels et MD la masse sèche.

Le diamètre moyen des microgels de PEG formés à l'aide de différentes masses moléculaires de PEG à 20 % est indiqué ici. L'augmentation de la durée d'exposition aux UV a également eu un effet sur le diamètre des microgels. À mesure que la durée d'exposition aux UV augmentait, les diamètres des trois formulations présentées ici augmentaient également.

La densité mesurée par gradients de dextrine diminue avec l'augmentation de la masse moléculaire des molécules précurseurs de PEG. Ceci est également confirmé par le graphique du pourcentage de teneur en eau, où un PEG de masse moléculaire plus élevée s'est révélé contenir une plus grande quantité d'eau par gramme de polymère. Enfin, afin de montrer que les microgels pouvaient être chargés avec une protéine marquée fluorescentemment, une albumine a été ajoutée au mélange avant la polymérisation et s'est retrouvée piégée à l'intérieur des sphères.

Des concentrations croissantes de la protéine marquée au fluorochrome ont augmenté l'indice de polydispersité des sphères, mais la taille moyenne est restée constante. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de chauffer toutes les solutions à 37 degrés Celsius et de bien vortexer et micro-gélifier afin de rompre les éventuels agrégats pendant le lavage et la préparation des lames pour l'imagerie. Après cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être réalisées pour l'encapsulation de médicaments afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'effet de la libération du médicament.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer des microgels de PEG-DA dans des conditions douces par des réactions de précipitation.