Name: Caractéristiques des précipitations formées polyéthylène Microgels glycol sont commandés par le poids moléculaire des réactifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Découvrez la formation de microgels de polyéthylène glycol par photopolymérisation en précipitation. Cette méthode permet de contrôler le diamètre et le gonflement selon le poids moléculaire pour des applications en administration de médicaments et en ingénierie tissulaire.

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Le financement de ce projet a été assuré par le biais du NSF CBET Award 1061834. Les auteurs tiennent à remercier CIBA pour un échantillon de photoinitiateur.

1. Préparation de solutions pour la fabrication de microgels
<ol>
	<li>Avant de commencer la réaction de précipitation, préparez les solutions nécessaires et réchauffez-les à 37 °C. Les solutions requises comprennent 0,5 % de photoinitiateur, 1,5 M Na2SO4, une solution tampon, une solution de diacrylate de PEG (PEG-DA) à 200 mg/ml et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Remarque : Acryler tous les précurseurs de PEG conformément aux méthodes publiées et les conserver à -20 °C sous argon jusqu’à12 utilisation.</li>
	<li>Peser le photoinitiateur et le dissoudre dans du H2O désionisé (DI) pour une solution à 0,5 % (p/v). Il est important de protéger la solution de l’exposition aux rayons UV.
	<ol>
		<li>Après dissolution complète, filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Cette solution peut être préparée à l’avance et conservée à 4 °C dans l’obscurité. Remarque : Réduisez le temps d’agitation à environ 1 heure en chauffant la solution à 40 °C pendant l’agitation.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour 1x PBS, ajoutez 1 pastille de PBS à 1 L DI H2O et filtrez à travers un filtre de 0,22 μm. Le PBS peut être préparé à l’avance et stocké à 4 °C.</li>
	<li>Mesurer 39,4 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH = 7,4) et ajouter 612 μl de triéthanolamine (TEOA) et 260 μl d’acide chlorhydrique 6 M (HCl). Remarque : TEOA est très visqueux ; préchauffer TEOA à 37 °C avant le pipetage.
	<ol>
		<li>Ajustez le pH du tampon de manière à ce qu’il soit d’environ 7,7 et filtrez à travers un filtre de 0,22 μm (pH final ~7,8). La solution tampon peut être mise à l’échelle, préparée à l’avance et stockée à 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparez la solution de PEG-DA avant de commencer la réaction à chaque fois ; une diminution de la réactivité a été observée si la solution est stockée. Pesez le PEG-DA et ajoutez le tampon PBS/TEOA/HCl à la concentration finale de 200 mg/ml. Remarque : Ajoutez le tampon lentement pour contrôler soigneusement la concentration de PEG, car le PEG gonfle dans la solution. 
	Remarque : Cette solution est hautement personnalisable. Les options de personnalisation des microgels comprennent : la modification du poids moléculaire de départ du PEG pour modifier les propriétés des microgels, l’utilisation d’un précurseur de PEG dégradable pour fabriquer des microgels dégradables, le filtrage stérile de toutes les solutions pour les microgels biologiquement stériles, l’achèvement du processus de formation dans une hotte à flux laminaire, et enfin l’ajout de groupes fonctionnels à la surface en les incorporant dans la solution PEG.</li>
	<li>Peser Na2SO4 et dissoudre dans DI H2O pour une solution de 1,5 M. Pour de meilleurs résultats, la solution de sulfate de sodium doit également être préparée juste avant le début de la réaction.
	<ol>
		<li>Chauffer et agiter la solution jusqu’à ce que Na2SO4 soit complètement dissous. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm si nécessaire.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fabrication de microgels
<ol>
	<li>Placez 127,5 μl de tampon PBS/TEOA/HCl, 10 μl de photoinitiateur à 0,5 % et 25 μl de solution PEG à 200 mg/ml dans les tubes où les microgels seront formés, généralement des tubes de microcentrifugation de 2 ml.
	<ol>
		<li>Chauffer ces tubes avec la solution 1,5 M Na2SO4 à 37 °C.</li>
		<li>Mélangez les tubes pendant le chauffage. Remarque : Ce protocole de microgel peut être mis à l’échelle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pour encapsuler des molécules dans les microgels, ajoutez la molécule souhaitée (par exemple de l’ovalbumine) au tampon PBS/TEOA/HCl, au photoinitiateur et à la solution PEG. Après la réticulation, la molécule sera piégée dans le réseau de microgels.</li>
	<li>Complétez chaque réaction de microgel une à la fois. Prenez le premier tube et ajoutez 87,5 μl de 1,5 M Na2SO4.</li>
	<li>Mélanger le tube par pipetage 3 à 5 fois ; ou attendre 30 sec. Après le mélange, la concentration de sel sera uniformément répartie et la solution doit être claire.</li>
	<li>Placez le tube sous la lumière UV et réticulez pendant 30 secondes. Après la réticulation, il devrait y avoir une couche trouble sur le dessus de la solution, cette couche contient les microgels. Voir la figure 1 pour le schéma de réaction.</li>
	<li>Ajouter 750 μl de PBS pour former une pastille lors de la centrifugation et bien mélanger.</li>
	<li>Lavez les microgels 5 fois en les centrifugant pendant 2 minutes à 4 000 x g pour former une pastille et en remplaçant le surnageant par du PBS. Remarque : Ne dérangez pas la pastille de microgel pendant le remplacement du tampon, il se peut qu’il ne soit pas possible d’éliminer tout le surnageant.</li>
</ol>
3. Taille et polydispersité du microgel
<ol>
	<li>Pipette de 30 μl de microgels à partir de la pastille formée par centrifugation dans 1 ml de DI H2O. Pour de meilleurs résultats, sonicez la solution de microgel dans un sonicateur à bain-marie pendant 1 heure (50-60 Hz et 1,4 A) ou mélangez vigoureusement pour suspendre les microgels.</li>
	<li>Pipetez 15 μl de la solution de microgel sur une lame en verre propre et placez la lamelle #1.5 sur le dessus. Retournez la lame et le couvercle sur un mouchoir de laboratoire et appuyez sur la lame pour éliminer l’excès de solution et vous assurer que les microgels sont en une seule couche.</li>
	<li>Capturez plusieurs images des microgels à l’aide d’un objectif à huile DIC 100X. En règle générale, 5 images sont prises par échantillon et 3 échantillons par lot sont recommandés pour un total de 15 images. Remarque : aucune variation d’un lot à l’autre n’a été observée à ce jour.</li>
	<li>Mesurez les microgels pour obtenir un diamètre représentatif.</li>
	<li>Calculez l’IDP à l’aide de l’équation volumique suivante dans laquelle N est le nombre total de microgels et Vi est le volume de microgel i.</li>
</ol>
4. Densité des microgels
<ol>
	<li>Préparer des solutions de dextran 7, 6, 5, 4, 3 et 1 (p/v) % dans DI H2O pour déterminer la densité du microgel. Ces densités ont été calculées à 1,022, 1,020, 1,018, 1,016, 1,014 et 1,010 g/cm3, respectivement.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de solution de dextran à 7 % dans un tube à centrifuger de 15 ml.
	<ol>
		<li>Pipetez lentement 1 ml de solution de dextran à 6 % pour former une couche distincte au-dessus du dextran à 7 %.</li>
		<li>Attendre 5 min puis ajouter 1 ml de la solution à 5 %.</li>
		<li>Continuez jusqu’à ce que toutes les solutions de dextran soient stratifiées par ordre décroissant de concentration de dextran.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Superposez soigneusement les microgels au-dessus de la solution de dextran à 1 %.</li>
	<li>Centrifuger le gradient pendant 10 min à 4 000 x g et 5 °C. La position du microgel après centrifugation a permis de calculer facilement la masse volumique13.</li>
</ol>
5. Gonflement à l’équilibre du microgel
<ol>
	<li>Pour mesurer la masse gonflée (Ms) des microgels, définie comme la masse après gonflement à l’équilibre (48 heures), lavez d’abord les microgels 5x en DIH 2O et gonflez pendant au moins 48 heures dans des tubes de microcentrifugation pré-pesés.</li>
	<li>Centrifuger les microgels pendant 10 min à 4 000 x g.</li>
	<li>Retirer tout surnageant et consigner la masse humide. Utilisez des méthodes de filtrage pour vous assurer que tout excès d’eau est éliminé afin d’obtenir des résultats plus précis.</li>
	<li>Congeler les microgels à -80 °C puis lyophiliser à masse constante pour obtenir la masse sèche (Mj).</li>
	<li>Calculez la teneur en eau des microgels en % d’eau = (Ms - Mj) / Mj x 100.</li>
	<li>Déterminer la teneur en polymère comme suit : % polymère = 100 - % d’eau.</li>
	<li>Effectuez une analyse statistique de toutes les données à l’aide de SAS avec ANOVA à n voies et du test post-hoc de Tukey. Les différences sont notées à p<0,05.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les propriétés physiques des microgels PEG ont été examinées pour détecter les changements dans les conditions de polymérisation. Pour cette réaction de précipitation, une solution tampon, une solution de diacrylate de PEG à 20 % (p/v) (MW 3 000, 4 600 ou 6 000 Da) et un photoinitiateur ont été mélangés et réchauffés à 37 °C. L’ajout de 1,5 M Na2SO4, un sel kosmotrophe qui augmente les interactions entre les molécules d’eau, a provoqué une précipitation momentanée du PEG lors de son ajout. Cet effet...

Par définition, les microgels sont des hydrogels de n’importe quelle forme avec un diamètre équivalent d’environ 0,1-100 μm1. En raison de leur taille et de leurs caractéristiques, les microgels polymères constituent un outil polyvalent pour faire progresser l’administration de médicaments et les systèmes d’ingénierie tissulaire. Alors que les hydrogels en vrac sont largement utilisés comme échafaudages d’ingénierie tissulaire et véhicules d’administration de médicaments avec un grand succès2-4, un passage récent au contrôle à micro-échelle des échafaudages offre une occasion unique pour les microgels d’être utilisés comme matériaux de base pour la construction d’échafaudages. De plus, les microgels ont un rapport surface/volume élevé pour les interactions cellulaires et, en solution, ont une faible viscosité, ce qui les rend idéaux pour les injections. Enfin, les microgels peuvent être formés à l’aide de nombreux polymères par diverses méthodes en fonction des caractéristiques souhaitées des microgels, ce qui les rend hautement personnalisables pour une variété d’applications.
Les techniques de production de microgels comprennent les polymérisations en suspension, en émulsion, en dispersion ou par précipitation. Les polymérisations en émulsion et en suspension nécessitent généralement des solvants organiques et des tensioactifs ou des stabilisants pour former les microgels. La nature de ces méthodes permet d’obtenir une distribution granulométrique très dispersée5. Les réactions de dispersion et de précipitation rendent les particules avec une polydispersité plus faible6 ; Cependant, les particules formées par polymérisation par dispersion nécessitent toujours l’utilisation d’agents stabilisants6. Les microgels formés par les réactions de précipitation sont uniques en ce sens qu’ils forment des particules de taille et de forme uniformes sans l’utilisation de stabilisants ou de tensioactifs. La formation de microgels est obtenue lorsque les chaînes de polymères en croissance se séparent de la phase continue par précipitation enthalpique ou entropique7. La polymérisation par précipitation se fait souvent à des températures élevées qui peuvent être abaissées par l’utilisation de sels kosmotrophes, qui diminuent la solubilité du polymère dans lesolvant8. Ce travail se concentre sur les microgels formés à partir de poly(éthylène glycol) (PEG) par une réaction de précipitation photopolymérisée dans des conditions biologiquement compatibles, avec des variations pour modifier les propriétés des microgels et encapsuler des molécules pour des applications d’administration de médicaments.
Des études antérieures avec des hydrogels PEG montrent que les conditions de polymérisation influencent grandement les propriétés physiques et mécaniques des hydrogels, à savoir la teneur en eau de l’hydrogel et le module de compression3,9. Ces matériaux réticulés sont intéressants car la relation entre les propriétés structurelles et physiques décrites par Flory10 peut être utilisée pour adapter l’hydrogel réticulé à des applications spécifiques. Ces principes sont similaires pour les microgels. Les microgels de PEG formés par précipitation se sont avérés avoir un potentiel pour la médecine régénérative11, mais des recherches plus approfondies sur les propriétés des microgels étaient nécessaires pour améliorer leur répertoire pour de futures applications biomédicales. Ce rapport décrit la procédure de fabrication de microgels par réaction de précipitation et de modification des caractéristiques, telles que le diamètre des microparticules, l’indice de polydispersité (PDI), la densité et l’enflure, qui seraient importantes pour développer davantage ces matériaux pour l’administration de médicaments ou la médecine régénérative.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>MP Biomedical</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine (TEOA)</td><td>J.T. Baker</td><td>9468-01</td><td>Préchauffer à 37 &deg ; C avant le pipetage</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>BDH Aristar</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de sodium</td><td>J.T. Baker</td><td>3891-01</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine (OVA)</td><td>Invitrogen</td><td>34782</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1 500</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16241</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3 000</td><td>Fluka</td><td>03997-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4 000</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4 600</td><td>Sigma</td><td>373001-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6 000</td><td>Fluka</td><td>03394-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 10 000</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>TCI</td><td>D1449</td><td></td></tr></tbody></table>

caractéristiques des précipitations formées polyéthylène microgels glycol sont commandés par le poids moléculaire des réactifs

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

Ce travail décrit la formation de microgels de poly(éthylène glycol) (PEG) via une réaction de précipitation photopolymérisée. Les réactions de précipitation offrent plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles de fabrication de microsphères. Contrairement aux techniques d’émulsion, de suspension et de dispersion, les microgels formés par précipitation ont une forme et une taille uniformes, c’est-à-dire un faible indice de polydispersité, sans utilisation de solvants organiques ou de stabilisants. Les conditions douces de la réaction de précipitation, les propriétés personnalisables des microgels et la faible viscosité des injections les rendent applicables à des fins in vivo. Contrairement à d’autres techniques de fabrication, les caractéristiques des microgels peuvent être modifiées en changeant le poids moléculaire du polymère de départ. L’augmentation du poids moléculaire de départ du PEG, l’augmentation du diamètre du microgel et du taux de gonflement. D’autres modifications sont suggérées, telles que l’encapsulation de molécules lors de la réticulation des microgels. Des adaptations simples aux blocs de construction des microgels PEG sont explorées pour des applications futures des microgels en tant que véhicules d’administration de médicaments et échafaudages d’ingénierie tissulaire.

La taille des microgels dépend des conditions de polymérisation. La figure 2A illustre l'augmentation du diamètre des microgels avec le poids moléculaire initial du PEG et la durée de réticulation. Des images représentatives de microgels utilisées pour la mesure de taille, pour divers poids moléculaires et réticulés pendant 30 secondes, sont présentées dans les figures 2C-G. Pour le PEG ayant un poids moléculaire de 3 000 Da, le diamètre moyen des microgels est passé de 1,65±0,26 à 2,20±...

Ce travail décrit la formation de microgels de poly(éthylène glycol) (PEG) via une réaction de précipitation photopolymérisée. L’augmentation du poids moléculaire du PEG, l’augmentation du diamètre du microgel et du taux de gonflement. Des adaptations simples à la réaction de précipitation des microgels PEG sont explorées pour des applications futures des microgels en tant que véhicules d’administration de médicaments et échafaudages d’ingénierie tissulaire.

Caractéristiques des précipitations formées polyéthylène Microgels glycol sont commandés par le poids moléculaire des réactifs

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Le but général de cette procédure est de former des microgels de polyéthylène glycol au moyen d'une réaction de précipitation photo-polymérisée, afin de les utiliser comme vecteurs de délivrance de médicaments et comme supports pour l'ingénierie tissulaire. Cette opération s'effectue tout d'abord en préparant les réactifs, notamment un photoinitiateur, des tampons, la triéthylamine et une solution de PEG DL, puis en les portant à 37 degrés Celsius. La deuxième étape consiste à placer les réactifs dans un tube microcentrifuge et à les mélanger par vortexage, tout en maintenant une température de 37 degrés Celsius.Ensuite, on mélange du sulfate de sodium et on expose la solution à une lumière UV afin d'induire la réticulation pendant 30 secondes. Après la réticulation, une couche trouble apparaît à la surface de la solution et contient les microgels. La dernière étape consiste à ajouter du PBS au mélange, puis à centrifuger afin d'obtenir un culot.En fin de compte, la microscopie et la diffusion dynamique de la lumière sont utilisées pour mesurer la taille des microgels, tandis que la densité est déterminée à l’aide d’un gradient de densité de dextrine. De plus, le degré de gonflemen

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Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D

Découvrez la formation de microgels de polyéthylène glycol par photopolymérisation en précipitation. Cette méthode permet de contrôler le diamètre et le gonflement selon le poids moléculaire pour des applications en administration de médicaments et en ingénierie tissulaire.

Caractéristiques des précipitations formées polyéthylène Microgels glycol sont commandés par le poids moléculaire des réactifs

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