La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d'ions concentrations dans Streptococcus pneumoniae Utilisation des colorants fluorescents

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser des colorants fluorescents pour surveiller les changements dans la dynamique de la membrane et les concentrations d’ions intracellulaires dans un système bactérien. Ceci est réalisé en incubant d’abord les bactéries pendant leur phase de croissance avec le fluor d’intérêt jusqu’à ce qu’il se soit équilibré à travers leurs membranes. Ensuite, les bactéries sont traitées avec l’agent de leur choix et leur fluorescence est surveillée.

Les résultats peuvent montrer des changements dans la dépolarisation membranaire, l’intégrité de la membrane et les concentrations d’ions intracellulaires en fonction des changements observés dans la fluorescence des colorants indicateurs. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques d’électrophysiologie conventionnelles comme le patch clamping qui est utilisé dans les systèmes eucaryotes est que les changements dans la dynamique de la membrane et les concentrations d’ions intracellulaires peuvent maintenant être surveillés chez les bactéries à l’aide de la fluorescence. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il faut un certain effort pour optimiser les concentrations de colorant.

Conditions de charge et paramètres de détection Commençons par les cellules bactériennes. Juste granulé dans une solution de lavage, remettez d’abord le granulé en suspension dans au moins un millilitre de PBS pour 100 millions d’UFC par millilitre, ce qui est suffisant pour cinq échantillons. Transférez un millilitre des cellules lavées dans un microtube à centrifuger et ajoutez 25 microlitres d’un filtre à une molaire.

Une solution mère de glucose stérilisée incube ensuite les cellules dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Le glucose ajouté peut varier en fonction de l’expérience. Après 15 minutes, ajoutez cinq microlitres de dépérissement de 50 micromolaires et 10 microlitres de solution PI.

Mélangez soigneusement les cellules en les pipetant plusieurs fois de haut en bas. Divisez ensuite cette suspension cellulaire en cinq puits d’échantillonnage d’une plaque transparente à 96 puits. Chargez la plaque dans un kit de lecture de plaques préchauffé pour la détection du dépérissement NP.

Surveillez maintenant l’équilibre du dépérissement sur les membranes cellulaires en prenant des mesures une fois par minute pendant 30 à 40 minutes jusqu’à ce que la lecture se stabilise à sa valeur d’avant traitement. Ensuite, éjectez la plaque et ajoutez l’agent expérimental de votre choix. Remettez immédiatement la plaque dans le lecteur et continuez à surveiller le dépérissement et la fluorescence PI pendant la durée souhaitée.

Lorsque vous préparez le tampon de chargement pour cette procédure, assurez-vous de le vortex brièvement avant d’ajouter PBS et Probenecid. Après avoir ajouté ces solutions, vortexez-le à nouveau et enveloppez-le dans du papier d’aluminium dans un millilitre de suspension à deux cellules x. Ajouter un millilitre de deux x tampon de chargement.

C’est suffisant pour 10 échantillons. Incuber le mélange dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 75 minutes, à l’abri de la lumière Tout au long de tous ces tests. Il peut être nécessaire d’ajuster la concentration du colorant et le temps d’incubation pour optimiser le test et le niveau de détection de fluorescence de base, en fonction de l’espèce bactérienne spécifique et d’autres variables du système expérimental.

Après l’incubation, lavez les cellules trois fois pour chaque lavage. Granulez les cellules à 2 400 G pendant 10 minutes et mettez-les en suspension dans deux millilitres de PBS contenant un x pronique. Après les trois lavages, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes.

Cela permet à l’œstrologie à l’intérieur de la bactérie d’hydrolyser les groupes esters du colorant, rendant le colorant actif dans la cellule. Ensuite, les cellules éliminent le snat et le suspendent dans deux millilitres de PBS contenant un x probénécide. Si nécessaire, le glucose peut maintenant être rajouté pour redynamiser les bactéries, charger 200 microlitres de cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits pour chaque échantillon et charger la plaque dans un lecteur de préchauffage dans un échantillon.

Eh bien, établissez d’abord une lecture de référence aux longueurs d’onde appropriées et à raison d’une lecture par seconde pendant une minute. Retirez ensuite la plaque et ajoutez environ cinq microlitres du traitement de votre choix. À cela.

Eh bien, pipetez rapidement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger le traitement et remettez immédiatement la plaque dans le lecteur. Continuez à prendre des mesures pendant le temps souhaité. Pour analyser les données, calculez le rapport des valeurs fluorescentes pour chaque point temporel en divisant la valeur, un par la valeur deux, et tracez les valeurs du rapport sur un graphique.

En préparation, créez une gamme de cinq ou six tampons à haute teneur en potassium avec des valeurs de pH de 6,5 à 8,0. Comme dans la procédure précédente, utilisez un vortex pour préparer les deux tampons de charge à partir d’un lavage de culture en phase logarithmique moyenne et concentrez les cellules. Remplacez ensuite le SNAT par deux millilitres de BS pour faire une suspension à quatre cellules x.

Combinez un millilitre de la suspension à quatre cellules x avec un millilitre du tampon de chargement deux x. Incuber maintenant les cellules dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 40 minutes. Protégez-le de la lumière.

Maintenant, lavez les cellules trois fois. Granulez les cellules comme indiqué précédemment. Rajoutez quatre millilitres de PBS contenant deux x prop Bénin et un millimolaire de glucose et répétez la centrifugation après les trois lavages.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant encore cinq minutes. Pour déterminer le filtre de fluorescence de fond, stérilisez environ 500 microlitres de la suspension bactérienne énergisée pour éliminer les bactéries. Transférez ensuite 200 microlitres du filtrat dans une plaque à 96 puits et mesurez l’absorption de ce puits pendant une minute.

Pour obtenir une courbe d’étalonnage in vivo, faites tourner 500 microlitres de watts ALI des cellules chargées et énergisées et de la réanimation. Suspendez-les dans une série de tampons à haute teneur en potassium de pH différent à chaque échantillon, ajoutez 20 micromolaires de risine. Cela équilibre le pH intracellulaire des cellules avec le pH du tampon environnant.

Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, transférez les échantillons sur la plaque à 96 puits du lecteur de plaques. Mesurez la fluorescence de chaque échantillon pendant quelques minutes afin d’établir une lecture d’étude pour chacun. Puits.

Pour analyser ces données, soustrayez les valeurs de fluorescence de fond, puis calculez le rapport des valeurs de fluorescence en divisant la valeur. Un par deux, tracez les valeurs de rapport pour chaque tampon de pH afin de créer la courbe d’étalonnage permettant de mesurer les changements de pH intracellulaire. Chargez des échantillons de 200 microlitres de cellules énergisées dans une plaque et mesurez la fluorescence toutes les cinq secondes pendant cinq minutes.

Simultanément, ajoutez 10 micromolaires CCCP à un échantillon tout en ajoutant les agents d’intérêt aux autres échantillons. Le CCCP est un contrôle positif aligné dans le temps pour diminuer le pH intracellulaire. Remettez immédiatement la plaque dans le lecteur et continuez à mesurer la fluorescence toutes les cinq secondes pendant 10 minutes.

Comme contrôle supplémentaire, ajoutez 20 micromolaires NI garrison à tous les échantillons pour équilibrer le pH des bactéries à celui du tampon pendant cinq minutes supplémentaires. Lors de l’exploration de la polarité de la membrane, les bactéries doivent être incubées avec du décodage pendant environ 40 minutes pour permettre au colorant de s’équilibrer sur la membrane. Ceci est indiqué par la diminution constante de la fluorescence qui se stabilise.

L’IP n’a pas besoin d’équilibrage, mais avec le dépérissement, il est utile pour surveiller la rupture de la membrane. En même temps que la polarité, la dépolarisation et la rupture de la bactérie sont indiquées par une augmentation de l’intensité fluorescente des deux colorants pendant moins de 2h00 du matin, le rapport de deux signaux fluorescents est calculé et une augmentation ou une diminution de ce rapport correspond au calcium intracellulaire. Pour la PBFI, le potassium intracellulaire est mesuré par des rapports de fluorescence.

L’hydrogène intracellulaire est mesuré à l’aide des rapports de fluorescence B-C-E-C-F am. Lors de l’ajout de l’ion calcium iono quatre mycine calcium s’écoule dans la cellule, provoquant une augmentation du rapport de fluorescence. L’ajout de valmy a l’effet inverse, provoquant l’écoulement du potassium hors de la cellule, ce qui est indiqué par une diminution du rapport de fluorescence.

B-C-E-C-F permet de mesurer le pH intracellulaire : les premières courbes d’étalonnage sont effectuées dans divers tampons de pH connu. Une diminution du rapport de fluorescence du colorant correspond à une diminution du pH. C’est ce que l’on voit avec l’ajout du proton de force CCCP, la ligne noire, et après l’ajout d’un dissipateur de force motrice de protons, la ligne bleue.

La deuxième flèche montre l’ajout de nissin, qui équilibre les concentrations d’hydrogène intracellulaires et extracellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la dépolarisation membranaire, l’intégrité de la membrane et les concentrations intracellulaires d’ions dans les cellules bactériennes. Vous devriez également être en mesure d’utiliser ce protocole comme point de départ pour étudier d’autres propriétés et cellules bactériennes.