Ingénierie à base de fibrine constructions de tissu de myofibroblastes et application des contraintes et de déformation à Provoquer Organisation cellulaire et collagène (Re)

L’objectif global de cette procédure est de créer des constructions à base de fibrine qui peuvent être utilisées pour étudier la réorganisation cellulaire et du collagène. Pour ce faire, on isole d’abord des cellules saphènes veineuses humaines du tissu du donneur et on les développe en culture. La deuxième étape consiste à coller des bandes velcro sur des membranes flexibles.

Au fond de six plaques de puits pour créer un espace carré au centre, qui contiendra la construction. Ensuite, un mélange de cellules de fibrinogène et de billes marquées par fluorescence est ajouté à l’espace entre les bandes velcro et on le laisse polymériser pour former un gel. La dernière étape consiste à conditionner les cellules et à induire la formation d’une matrice orientée en appliquant soit une déformation cyclique uniaxiale à la construction, soit en relâchant une déformation statique.

En coupant le gel de fibrine des tiges velcro dans une seule direction. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui décrivent les changements dans la réorganisation cellulaire et du collagène en surveillant les constructions au fil du temps à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du remodelage du collagène relatives à la vitesse de formation et de réorientation du collagène par différents types de cellules.

Pour commencer, acquérez du tissu de donneur humain à partir de la saana magna veineuse conformément aux directives pour l’utilisation secondaire du matériel. Ensuite, isolez les cellules saphènes veineuses humaines ou CSV H du tissu en suivant le protocole de Schnell et al, et stockez-les dans de l’azote liquide. Au besoin, élargissez les cellules en plaçant un flacon contenant 250 000 CSV H à décongélation rapide dans une fiole T 75 contenant 15 millilitres de croissance préchaude.

Milieu composé de 440 millilitres de DMEM avancé et de 50 millilitres de sérum fœtal bovin. Cinq millilitres de 100 X pen streptocoque et cinq millilitres de 200 millimolaires L de surabondance max. Changez le milieu de croissance tous les deux à trois jours pendant environ deux semaines jusqu’à ce que les cellules confluent.

Une fois confluentes, récoltez et divisez les cellules jusqu’au passage. Neuf. Utiliser la trypsine jusqu’à ce qu’il y ait un nombre suffisant de cellules pour l’expérience prévue. Environ 1,5 million de cellules sont nécessaires pour chaque construction.

Lorsqu’un nombre adéquat de cellules a été cultivé, récoltez-les à 90 % de fluidité, puis suspendez les cellules dans des milieux de croissance à 15 millions de cellules par millilitre. Placez-les sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Préparez la colle silicone en mélangeant l’élastomère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un.

Utilisez cette colle pour fixer des bandes de sept millimètres sur trois millimètres prises du côté souple du velcro à la membrane flexible des plaques de cellules flexibles. Pour former une forme de croix avec un centre ouvert, faites sécher la colle silicone pendant une nuit dans un four à 60 degrés Celsius pour assurer un durcissement de la colle. Ensuite, stérilisez la plaque en ajoutant cinq millilitres d’éthanol à 70 % dans chaque puits et laissez incuber pendant 30 minutes à température ambiante.

Rincez les puits trois fois avec du PBS stérile. Retirez ensuite le PBS des puits et les bandes velcro. Placez la plaque découverte sous la lampe UV d’une hotte de culture tissulaire pendant 30 minutes pour stériliser les surfaces.

Une fois terminé, couvrez l’assiette et conservez-la stérile jusqu’à utilisation. Ensuite, préparez le milieu d’ingénierie tissulaire en ajoutant 130 milligrammes d’acide allique, deux phosphates à 500 millilitres de milieu de croissance pendant les sept premiers jours de culture. En outre, ajoutez un milligramme par millilitre d’acide aminocaproïque epsilon pour empêcher la fibrine de se dégrader, dissolvez le fibrinogène à une concentration de 10 milligrammes de protéines réelles par millilitre de milieu d’ingénierie tissulaire complété par de l’acide aminocaproïque en mélangeant doucement.

Puis stérile. Filtrez la solution de fibrinogène à travers un filtre à seringue de 0,22 micron et conservez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. Ensuite, préparez la solution de thrombine en diluant la thrombine mère à une concentration finale de 10 unités internationales par millilitre dans un milieu d’ingénierie tissulaire complété par de l’acide aminocaproïque et conservez-la sur de la glace jusqu’à utilisation.

Ensuite, 100 microlitres de suspension cellulaire préparée plus tôt dans un micro tube de centrifugation pour chaque construction tissulaire qui sera fabriquée. Centrifugez les cellules à 350 fois G pendant sept minutes, puis jetez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres de la solution de thrombine et ajoutez quatre microlitres, des microsphères de polystyrène fluorescent bleu à utiliser comme marqueurs de référence internes. Ensuite, aspirez 50 microlitres de la solution de fibrinogène dans une pointe de pipette.

Augmentez le volume de la pipette à 100 microlitres, puis pipetez la solution de 50 microlitres de fibrinogène dans le tube de centrifugation. Avec le mélange de thrombine et de cellules, mélangez doucement la thrombine et le fibrinogène en prélevant le mélange de 100 microlitres pour éviter la formation de bulles. Une fois que la solution est bien mélangée, pipetez le mélange de gel dans et entre les bandes velcro, nous sommes rapidement comme le temps typique de gélien pour les gels de fibrine, une fois mélangés est de l’ordre de 20 secondes, incubez les constructions pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié tamponné à 5 % de dioxyde de carbone pour leur permettre de se gélifier.

Ajoutez ensuite six millilitres de milieu d’ingénierie tissulaire avec de l’acide aminocaproïque dans chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur. Remplacez le support tous les deux à trois jours pendant les sept premiers jours. Après une semaine, retirez le supplément d’acide aminocaproïque du milieu et continuez à cultiver les gels avec le milieu d’ingénierie tissulaire.

Toujours en l’échangeant tous les deux à trois jours au cours des cinq premiers jours en culture, permettez aux constructions de se compacter et de se réorganiser sous une contrainte statique formant des fibres de collagène, biaxialement en raison des contraintes de fibres pour induire la réorganisation du collagène dans une seule direction dans des conditions statiques. Tout d’abord, cultivez les cellules pendant une semaine supplémentaire au jour 12, coupez la construction tissulaire de deux bandes velcro dans une seule direction. Cela provoquera une tension dans la direction opposée lorsque la fibrine se compactera.

Alternativement, pour le chargement cyclique, placez les plaques sur un ensemble de poteaux de chargement dans une plaque de base à cellules flexibles, équipée d’un joint le sixième jour, les poteaux de chargement soutiendront la membrane flexible des puits et permettront à la base des poteaux d’être abaissée pour créer une tension dans une seule direction. Ensuite, configurez le protocole logiciel pour appliquer une déformation cyclique à la construction. Le programme présenté ici est pour une déformation intermittente ressemblant à une onde sinusoïdale, forçant la construction de zéro à 5 % de déformation à un hertz pendant des périodes de trois heures, alternant avec trois heures de repos.

Avec le programme préparé, allumez la pompe à vide et démarrez le programme. Le contrôleur régulera l’intensité du vide dans le système, qui tire sur les membranes autour des poteaux de support pour appliquer une contrainte cyclique aux constructions conformément au programme. Exécutez le programme pendant une semaine en prenant soin de changer le milieu tous les deux à trois jours après une semaine de conditionnement induire une réorganisation du collagène en tournant le poteau rectangulaire de 90 degrés pour changer la direction de la tension pendant trois jours.

Pour visualiser le remodelage actif du collagène en temps réel, ajoutez le suivi cellulaire orange. Ajouter une concentration de quatre micromolaires pour colorer le cytoplasme et CNA 35 OG 4 88. Ajoutez une concentration d’une micromolaire pour visualiser les fibres de collagène.

Ces sondes n’interfèrent pas avec la viabilité cellulaire ou la formation de collagène. Ensuite, incubez les cellules pendant une heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirez la plaque de culture de l’incubateur et transportez-la vers un microscope confocal à balayage laser pour visualiser les cellules et le collagène.

Prenez des images des gels à la surface et jusqu’à environ 60 microns dans l’échafaudage afin de visualiser les changements d’organisation à ces niveaux au fil du temps. Remettez ensuite la plaque dans la configuration de conditionnement mécanique à l’intérieur de l’incubateur. Répétez cette procédure tous les quelques jours pour suivre la progression de la réorganisation cellulaire en réponse aux stimuli.

Les microsphères fluorescentes ajoutées au mélange de fibrinogène avant la polymérisation sont piégées dans le réseau de fibrine et fonctionnent bien comme marqueurs de référence pour assurer la visualisation de la même zone à différents points temporels lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions statiques et se fixent aux quatre poteaux. Aucune orientation réelle de la fibre ou cellulaire n’est visible trois jours après la coupe de deux des connexions de poteau de fibre. La tension axiale unie causée par la contraction a aligné les fibres de collagène indiquées en vert.

Les cellules saphènes veineuses humaines qui ont été contraintes cycliquement dans une seule direction pendant une semaine sont montrées ici à la surface de la construction et à 60 microns dans le gel. Lorsque la direction de la tension a été tournée de 90 degrés, la réponse cellulaire après trois jours s’est avérée plus rapide à la surface qu’au cœur du tissu. Une fois l’ingénierie maîtrisée, ces constructions tissulaires à base d’IF peuvent être réalisées en deux heures environ.