Name: Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour limagerie et immunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Apprenez une préparation de rétine wholemount optimisée pour la neurosciences et l'immunohistochimie chez la souris. Cette méthode préserve l'intégrité tissulaire pour l'imagerie des protéines synaptiques.

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Ce travail a été soutenu par la subvention NIH R01-EY020535 (B.T.S), la Fondation internationale pour la recherche sur la rétine et la Fondation Karl Kirchgessner (B.T.S).

Dans toutes les procédures expérimentales, les animaux ont été traités conformément aux réglementations de la déclaration ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et conformément aux protocoles approuvés par le Weill Cornell Medical College. Les animaux ont été euthanasiés par le dioxyde de carbone et ont ensuite subi une luxation du col de l’utérus.
1. Dissection de la rétine entière
<ol>
	<li>Une fois la souris euthanasiée, énucléez ses yeux et placez-les dans une solution de Ringer oxygénée tamponnée à HEPES (Tableau 1).</li>
	<li>Retirez la cornée en coupant dans un chemin circulaire le long de l’ora serrata avec de petits ciseaux, en tenant l’œil au niveau du limbe avec une pince. Retirez l’objectif avec une pince.</li>
	<li>Retirez autant de vitré que possible à l’aide d’une pince à bord émoussé. Cette étape est importante pour les injections de bolus et les enregistrements électrophysiologiques ; Il n’est pas nécessaire pour effectuer l’immunohistochimie seule.</li>
	<li>Détachez la rétine de l’œilleton en positionnant la pince entre la rétine et l’œilleton, en déplaçant lentement la pince sur la circonférence. Stabilisez l’œilleton en tenant fermement la sclérotique à l’aide d’une deuxième paire de pinces. Coupez le nerf optique à l’endroit entre la rétine et l’œilleton pour faciliter la séparation de la rétine de l’œilleton.</li>
	<li>La rétine peut être disséquée en morceaux (par exemple, des quartiers) ou utilisée dans son ensemble. Pour couper en morceaux, utilisez des ciseaux pour faire des incisions de la périphérie de la rétine jusqu’au nerf optique. Alternativement, pour utiliser toute la rétine, faites des incisions de la périphérie à mi-chemin du nerf optique. Les incisions aideront à faire une préparation plate.</li>
</ol>
2. Montage sur un insert de membrane PTFE hydrophile
<ol>
	<li>Préparez la membrane comme décrit ci-dessous. Lors d’enregistrements physiologiques ou d’expériences d’injection de colorant, raccourcissez le support à l’aide d’un tour ou d’une scie à main de sorte que l’anneau restant ait une hauteur de 1 mm. 
	Remarque : Les inserts de la plaque de culture peuvent être non modifiés ou modifiés (Figure 1A). Le choix de la configuration est dicté par le but de l’expérience. Pour l’immunomarquage, un insert non modifié convient.</li>
	<li>Polissez les surfaces rugueuses avec du papier de verre fin (grain 300 ou plus).</li>
	<li>(Facultatif) Retirez les pieds sous l’anneau avec des ciseaux.</li>
	<li>Pour éliminer les débris, rincez ou sonicez la membrane dans de l’eau distillée pendant 2 à 3 minutes.</li>
	<li>Montez le tissu sur la membrane (Figure 1A). Placez le tissu avec un peu de solution sur la membrane à l’aide d’une pipette de transfert en plastique. Coupez l’extrémité étroite de la pipette si nécessaire, pour éviter que l’échantillon de tissu n’adhère à la pipette pendant le transfert.</li>
	<li>Fixez la rétine avec les cellules ganglionnaires (GC) vers le haut : sur la membrane, retirez progressivement la solution tout en étalant la rétine et en dépliant les plis à l’aide d’une pince.</li>
	<li>Sur le côté opposé de la membrane, placez une seringue vide (1 ml) directement sous le tissu. Appliquez l’aspiration en tirant sur le piston jusqu’à un volume de 0,2 à 0,3 ml. Augmentez la surface d’aspiration en coupant l’embout de maintien de la seringue avant l’utilisation. Le tissu ne nécessite pas de traitement supplémentaire pour l’adhérence, car il est physiquement enchevêtré dans la membrane.</li>
</ol>
3. Injection en bolus d’isolectine Alexa 488
<ol>
	<li>Préparez des pipettes patch et une solution de coloration. Tirez des pipettes patch en verre capillaire borosilicaté avec un extracteur Flaming/Brown, avec une résistance de ~1 MΩ. Cassez doucement la pointe de la pipette.</li>
	<li>Préparez la solution de coloration en ajoutant 0,3 μl de solution mère d'isolectine Alexa 488 à 10 μl de la solution de Ringer tamponnée HEPES décrite à l'étape 1.2.</li>
	<li>Transférez l’échantillon vers la configuration de patch-clamp pour l’injection (Figure 1C). Placez la membrane avec le tissu attaché dans la chambre d'enregistrement imprégnée d'une solution de Ringer chauffée (37 °C) et oxygénée par HEPES.</li>
	<li>Placez la pipette contenant le colorant contre la membrane limitante interne (ILM, Figure 2A). À l’aide d’un micromanipulateur, avancez davantage la pipette contre l’ILM jusqu’à ce qu’elle le pénètre. Injectez la solution de coloration avec une pression de 10-20 psi pendant 1 seconde à l’aide d’un picospritzer. Un ou plusieurs endroits peuvent être ciblés pour l’injection (figure 2B). Si un picospritzer n’est pas disponible, une seringue de 10 ml peut être utilisée pour délivrer une pression d’air positive pour l’injection.</li>
	<li>Incuber le tissu injecté pendant 10 min. Pendant l’incubation, le tissu injecté peut être visualisé sous un éclairage d’épifluorescence.</li>
	<li>Après l’étiquetage, la préparation peut être transmise à un microscope pour l’imagerie. Transférez l’insert dans une boîte de culture à fond de verre, en plaçant la rétine vers le bas (Figure 1C).</li>
	<li>Ajoutez une goutte de solution HEPES pour garder l’échantillon humide.</li>
	<li>Placez 2-3 points de graisse sous vide autour du périmètre de l’anneau en plastique pour fixer fermement l’insert au fond de la boîte de culture.</li>
	<li>Transférez la parabole sur la platine du microscope.</li>
</ol>
4. Fixation du paraformaldéhyde et du carbodiimide
<ol>
	<li>Fixez l’échantillon en transférant l’insert dans le fixateur pendant 15 min. Des temps de fixation plus longs ou plus courts peuvent être utilisés, en fonction de l’application. Les deux fixateurs peuvent être utilisés efficacement pour fixer la GFP, l’isolectine ou les hydrazides fluorescents Alexa (par exemple, utilisés pour remplir les cellules dans les enregistrements patch-clamp). 
	Remarque : Pour la fixation, des solutions de carbodiimide à 4 % ou de paraformaldéhyde à 4 % peuvent être utilisées. Pour maintenir l’adhérence, la fixation doit être effectuée après que le tissu a déjà été attaché à la membrane. Le tissu peut être fixé immédiatement après le montage, ou après un enregistrement physiologique et/ou une injection en bolus.</li>
	<li>Rincer le tissu dans un tampon phosphate (PB) pendant 30 min. Après cela, le tissu peut être traité soit en tant que montage entier (étape 5), soit coupé en sections verticales, puis traité (étapes 6 et 7).</li>
</ol>
5. Immunocoloration des Wholemounts rétiniens
<ol>
	<li>Dans une boîte à 24 puits (Figure 1D), bloquez les morceaux rétiniens sur la membrane pendant 1 heure dans une solution de coloration.</li>
	<li>Diluer les anticorps primaires anti-PSD-95 de souris à 1:300 dans la solution de coloration et appliquer pendant 48 heures à température ambiante dans l’obscurité. Ajouter ~100-150 μl de solution d’anticorps dans chaque puits avec le tissu. Pour éviter le dessèchement, remplissez les puits inutilisés avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Rincer 20 min dans PB, 3x.</li>
	<li>Incuber pendant 24 heures dans l’anticorps secondaire anti-souris Alexa 568 dissous 1:500 dans la solution de coloration.</li>
	<li>Rincer 20 min dans PB, 3x.</li>
	<li>Placez l’insert avec le tissu coloré dans une boîte de Pétri standard de 3 cm remplie de solution de PB. Avec de petits ciseaux, découpez la partie de la membrane contenant la rétine de l’anneau.</li>
	<li>Transférez la rétine sur la membrane sur une lame de rétine vers le haut. Retirez le PB, ajoutez le support de montage. Placez de petits morceaux d’une vitre brisée entre la diapositive et les lunettes pour éviter une compression importante et des dommages à la rétine. Placez la lamelle.</li>
	<li>Scellez la lamelle avec du vernis à ongles. Conservez les diapositives dans l’obscurité, dans un réfrigérateur.</li>
</ol>
6. Section verticale de tissus montés sur membrane
<ol>
	<li>Après la fixation, immergez le tissu sur la membrane dans les solutions de gradient de saccharose de 10 %, 20 % et 30 % de saccharose pendant 30 min, 1 heure et toute la nuit, respectivement. L’étape de nuit est effectuée à 4 °C au réfrigérateur, toutes les autres étapes à température ambiante.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, retirez la membrane avec le tissu de l’anneau d’insertion en plastique.</li>
	<li>Placez la membrane coupée sur Parafilm avec la rétine vers le haut et retirez autant de solution que possible avec des lingettes Kimwipes.</li>
	<li>Placez le Parafilm avec le tissu dans la chambre du cryostat et ajoutez une goutte de milieu OCT. Utilisez le dispositif de congélation rapide pour accélérer la congélation.</li>
	<li>Détachez l’échantillon congelé et retournez-le.</li>
	<li>Laissez environ 2 mm autour de l’échantillon sur trois côtés et laissez 5 à 6 mm du côté qui sera fixé au support.</li>
	<li>Couvrez le côté rétinien exposé (côté membrane) avec une goutte d’OCT. Laissez la zone d’attache libre.</li>
	<li>Congelez la membrane avec du tissu rétinien. L’échantillon est maintenant prêt à être placé sur un support de coupe.</li>
	<li>Placez une goutte d’OCT sur un anneau de support froid. Insérez immédiatement l’échantillon congelé dans la goutte.</li>
	<li>Coupez des sections de 10 à 20 μm d’épaisseur, en réglant la température du cryostat à -19 °C. Utilisez des lames d’adhérence en polysinus chaudes (à température ambiante). Laissez les lames avec les sections attachées sur une plate-forme chauffante pendant ~2-3 min (41 °C) dans l’obscurité pour assurer une bonne adhérence des sections.</li>
	<li>Mettez les lames dans une boîte de rangement et conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>
7. Immunocoloration des coupes rétiniennes
<ol>
	<li>Sortez les lames avec les sections du congélateur. Laissez-les rester à température ambiante pendant 1 min pour éliminer le condensat.</li>
	<li>Encerclez les sections avec un bloqueur de liquide pour créer une barrière pour une incubation ultérieure.</li>
	<li>Placez les lames dans la boîte d’incubation. Couvrez le fond de la boîte avec de l’eau pour éviter l’évaporation de la solution d’anticorps.</li>
	<li>Rincer avec du PB pendant 5 min.</li>
	<li>Préparez les mêmes solutions de coloration et suivez les étapes de l’étape 5. L’incubation avec l’anticorps primaire dure la nuit et celle de l’anticorps secondaire 1 heure. N’utilisez pas de verre brisé entre la lamelle et la glissière.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La biocompatibilité élevée et la transparence des solutions de la membrane PTFE hydrophile sont avantageuses lorsqu'on travaille avec des tissus vivants. Cette préparation a été utilisée avec succès dans des travaux antérieurs pour l’enregistrement par patch-clamp des réponses lumineuses8-10. Ici, nous montrons comment cette approche peut être adoptée pour l’analyse structurale de la rétine entière.
La technique de chargement en bolus peut être utilisée efficacement pour le marquage...

La réalisation d’une immunohistochimie dans des tissus intacts délicats présente un risque d’endommagement lors de la manipulation et du transfert. Cela peut se produire soit dans des tranches de cerveau, soit dans d’autres tissus minces, tels que la rétine dégénérée. De plus, certaines méthodes de fixation tissulaire peuvent être avantageuses pour l’immunomarquage des structures neuronales, mais entraînent une stabilité structurelle compromise, empêchant leur utilisation. Un exemple particulier de cela est la fixation à base de carbodiimide, qui est supérieure pour colorer les récepteurs et les hormones1 à 7, mais qui est généralement évitée en raison de l’instabilité du tissu fixé.
Ici, nous décrivons une procédure qui utilise une membrane PTFE hydrophile pour soutenir structurellement les tissus délicats, fixés ou non, pour une variété de techniques de coloration. La membrane de support permet de manipuler les tissus délicats avant et après la fixation, ce qui permet plusieurs étapes de traitement tout en minimisant le risque de lésions tissulaires. Dans l’ensemble, cette méthode simple pour préserver l’intégrité des tissus offre la possibilité d’utiliser des techniques qui pourraient autrement être évitées. En tant que telle, cette approche pourrait également être utilisée avec succès pour la préparation d’une grande variété de tissus tels que des tranches de cerveau qui deviennent fragiles à la suite de procédures de tranchage.

<table><tbody><tr><td>Insert de culture cellulaire Millicell, 12 mm, PTFE hydrophile (Biopore), 0,4 &mu ; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>dissection</td></tr><tr><td>Forceps, Dumont #55, inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>dissection</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Système de microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Verre capillaire</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Tire-pipette flamant/brun Sutter</td><td>Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture à fond de verre</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert graduées jetables</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits, 24 puits</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture, #1</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Lames d’adhérence polysinus</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueur de liquide</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT moyen</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm film de laboratoire</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning graisse sous vide poussé</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td>anticorps</td></tr><tr><td>Donkey anti-souris Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>anticorps Isolectine Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Carbodiimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole optimisé pour la rétine wholemount préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Travailler avec des tissus délicats peut être un facteur de complication lors de la réalisation d’une évaluation immunohistochimique. Ici, nous présentons une méthode qui utilise une membrane en PTFE hydrophile soutenue par un anneau pour fournir un soutien structurel aux tissus vivants et fixés pendant le traitement immunohistochimique, ce qui permet l’utilisation d’une variété de protocoles qui causeraient autrement des dommages au tissu. Tout d’abord, cela est démontré avec le chargement en bolus de marqueurs fluorescents dans le tissu rétinien vivant. Cette méthode permet une visualisation rapide des structures ciblées, tandis que le support de la membrane maintient l’intégrité du tissu pendant l’injection et permet un transfert facile de la préparation pour une imagerie ou un traitement ultérieur.
Deuxièmement, une procédure de coloration des anticorps dans les tissus fixés au carbodiimide est décrite. Bien que la fixation du paraformaldéhyde soit plus courante, la fixation du carbodiimide fournit un substrat supérieur pour la visualisation des protéines synaptiques. Une limitation du carbodiimide est que le tissu fixé qui en résulte est relativement fragile ; Cependant, ce problème est surmonté grâce à l’utilisation de la membrane de support. Le tissu rétinien est utilisé pour démontrer ces techniques, mais elles peuvent être appliquées à tout tissu fragile.

Deux expériences représentatives sont illustrées ici et tirent parti de l'utilisation d'une membrane de PTFE hydrophilisée pour supporter la rétine en montage entier pendant les procédures de coloration. La première expérience décrit une méthode rapide et simple de caractérisation de la vascularisation rétinienne, un réseau complexe de vaisseaux sanguins s'étendant à travers plusieurs couches rétiniennes (Figure 2). Cette approche combine un marquage en bolus par l'isolectine avec une étiquetage par imme...

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Cette procédure utilise un tissu rétinien de souris pour démontrer comment stabiliser un tissu nerveux délicat afin de préserver son intégrité structurelle. Au cours de plusieurs étapes de coloration immunohistochimique, commencez par énucléer l’œil, retirez la cornée et séparez la rétine de la sclère. Effectuez des incisions dans la cupule oculaire rétinienne pour aplatir le tissu.Ensuite, fixez la rétine sur une membrane renforcée munie d'un anneau à l'aide d'un transfert par aspiration, sans manipulation directe, afin de préserver l'intégrité du tissu. Transférez maintenant l'anneau dans une plaque multi-puits pour la coloration. Nos résultats montrent que cette technique peut être utilisée efficacement sur des tissus vivants et offre un substrat supérieur à l'imagerie des protéines synaptiques par rapport aux méthodes existantes de manipulation de la rétine disséquée.Ces techniques permettent le transfert de tissus délicats avec une manipulation physique minimale. Cela réduira le risque de distorsion et de dommages. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque nous avons dû effectuer des enregistrements sur des tissus montés à plat dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne (RD), dont la rétine est extrêmement mince et fragile en raison de la perte cellulaire importante provoquée par la mutation Chief.Un postdoctorant de notre laboratoire m'accompagnera pour démontrer la procédure. Tout d'abord, énucléer les yeux d'une souris anesthésiée et transférer les yeux dans une solution de Ringer tamponnée et oxygénée. Pour retirer la cornée, maintenir l'œil au niveau du limbe à l’aide de forceps, puis effectuer une incision circulaire le long de l’ora serrata.Extraire la lentille avec une pince pour les injections en bolus et les enregistrements électrophysiologiques. Utiliser une pince à bord mixte pour retirer le plus de vitré possible. Maintenant, stabiliser la cupule oculaire en tenant fermement la sclère avec la pince.Placer une deuxième paire de forceps entre la rétine et la cupule oculaire. Déplacer lentement les forceps autour de la circonférence. Couper le nerf optique entre la rétine et la cupule oculaire, puis retirer la cupule oculaire à l’aide de ciseaux.Effectuez des incisions depuis la périphérie rétinienne jusqu'au nerf optique. En alternative, pour utiliser toute la rétine, pratiquez des incisions depuis la périphérie jusqu'à mi-chemin du nerf optique afin de raccourcir le porte-objet. Retirez la partie excédentaire à l'aide d'un tour.Ensuite, polissez les surfaces rugueuses avec du papier de verre fin. Retirez les pieds situés sous l'anneau. Coupez l'extrémité étroite d'une pipette en plastique.Ensuite, transférez le tissu avec un peu de solution sur la membrane. Retirez progressivement la solution tout en étalant la rétine et en dépliant le tissu. Fixez maintenant la rétine sur la membrane avec les cellules ganglionnaires orientées vers le haut.Coupez l'extrémité de maintien d'une seringue d'un millilitre et placez-la directement sous le tissu. Tirez doucement sur le piston jusqu'à un volume d'environ 0,3 millilitre pour emprisonner physiquement le tissu dans la membrane. Tirez quelques pipettes capillaires en borosilicate en utilisant une résistance d'environ un mégaohm.Ensuite, cassez délicatement la pointe de chaque pipette de patch. Ajoutez ensuite 0,3 microlitre de la solution mère de colorant is-sélectine à 10 microlitres de la solution de Ringer tamponnée heaps. Placez maintenant la membrane dans la chambre d’enregistrement perfusée avec de la solution de Ringer tamponnée heaps chauffée et oxygénée.Positionner la pipette contenant le colorant contre la membrane limitante interne à l'aide d'un micromanipulateur. Faire avancer davantage la pipette afin de pénétrer la membrane limitante interne. Ensuite, injecter la solution de coloration dans un ou plusieurs emplacements ciblés.Attendez maintenant 10 minutes pour permettre au tissu de se remettre de l'injection, en l'observant sous éclairage à fluorescence en épifluorescence. Si désiré, transférez l'insert dans une boîte de culture à fond en verre, en le plaçant côté rétine vers le bas. Ajoutez une goutte de solution heap pour maintenir l'échantillon humide.Également, placer trois points de graisse à vide autour du périmètre de l'anneau en plastique pour fixer fermement l'insert à la boîte de culture. Transférer la boîte sur la platine du microscope après la fixation, immerger la membrane dans les solutions de gradient de saccharose. Découper la membrane à partir de l'anneau en plastique de l'insert.Retirez autant de solution que possible à l’aide de lingettes Kim et placez-la sur un porte-objet avec la rétine vers le haut. Transférez le paraforme avec le tissu dans la chambre du cryostat et ajoutez une goutte de milieu OCT. Utilisez l’appareil de congélation rapide pour accélérer la congélation.Détachez l'échantillon congelé et retournez-le. Coupez maintenant l'excès d'OCT congelé. Laissez environ deux millimètres autour de l'échantillon sur trois côtés et quelques millimètres du côté qui sera fixé au porte-échantillon.Couvrez le côté rétinien exposé avec une goutte de OCT en laissant la zone attachée libre. Congelez la membrane contenant le tissu rétinien. Déposez une goutte de OCT sur un anneau support froid.Insérez immédiatement l'échantillon congelé dans la goutte. Coupez des sections de 10 à 20 micromètres à moins 19 degrés Celsius et placez-les sur des lames d'adhésion au polylysine tièdes. Placez les lames avec les sections fixées sur une plateforme chauffante à 41 degrés Celsius pendant deux à trois minutes à l'abri de la lumière.Ensuite, conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Cette expérience illustre une caractérisation rapide et simple de la vascularisation rétinienne en tant que réseau complexe de vaisseaux sanguins s'étendant sur plusieurs couches rétiniennes. En combinant une injection en bolus d'iso-sélectine avec un marquage par immersion dans la sulfa-roumine, les tissus vivants peuvent être visualisés et analysés presque immédiatement dans la rétine, et les vaisseaux sanguins peuvent être marqués depuis la couche superficielle jusqu'à la couche profonde.Contrairement aux molécules relativement bien diffusibles, la SRH sélectine ne traverse pas efficacement la membrane limitante interne. La fixation au carbimide présente plusieurs avantages par rapport à la fixation classique au paraformaldéhyde lors de l'étiquetage des protéines synaptiques ; par exemple, après une courte période de fixation au carbimide, la coloration immunofluorescente du marqueur synaptique PSD-95 dans la couche plexiforme interne présentait un aspect ponctué brillant, compatible avec la distinction des synapses individuelles.En revanche, lorsqu'on utilise un fixateur classique au paraformaldéhyde, l'identification des composants synaptiques est moins nette. Des résultats similaires ont été obtenus sur des sections rétiniennes en cryostat. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment monter un tissu délicat sur cette membrane et comment appliquer une coloration cytochimique à la préparation finale.Il vous faudra 15 minutes pour fixer la rétine sur le filtre.

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