Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l'imagerie et immunohistochimie

Cette procédure utilise du tissu rétinien de souris pour démontrer comment stabiliser le tissu neural délicat afin de préserver l’intégrité structurelle. Au cours de plusieurs étapes de coloration immunohistochimique, nucléez d’abord l’œil, retirez la cornée et séparez la rétine de la sclère. Faites des incisions dans l’œilleton rétinien pour aplatir le tissu.

Fixez ensuite la rétine à une membrane renforcée par un anneau en utilisant un transfert d’aspiration sans manipulation directe pour préserver l’intégrité du tissu. Transférez maintenant l’anneau sur une plaque multi-puits pour la coloration. Nos résultats montrent que cette technique peut être utilisée efficacement dans les tissus vivants et fournit un substrat supérieur pour l’imagerie des protéines synaptiques par rapport aux métaux existants de manipulation de la rétine disséquée.

Ces techniques permettent le transfert de tissus délicats avec un minimum de manipulation physique. Cela réduira les risques de distorsion et de dommages. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque nous avons eu besoin d’enregistrer à partir de tissu monté à plat chez RD une souris, un modèle de dégénérescence rétinienne, et cette rétine de souris est extrêmement mince et fragile en raison d’une perte cellulaire importante causée par la mutation Chief.

Un postdoctorant de notre laboratoire se joindra à moi pour faire la démonstration de la procédure. Tout d’abord, nucléez les yeux d’une souris anesthésiée et transférez les yeux dans une solution de sonnerie tamponnée en tas oxygénés. Pour enlever la cornée, tenez l’œil au niveau du limbe avec une pince, puis découpez un chemin circulaire le long de l’ora serrata.

Retirez la lentille à l’aide d’une pince pour les injections en bolus et les enregistrements électrophysiologiques. Utilisez une pince à bord mélangé pour enlever autant de vitré que possible. Stabilisez maintenant l’œilleton en tenant fermement la sclérotique à l’aide d’une pince.

Placez une deuxième paire de pinces entre la rétine et l’œilleton. Déplacez lentement la pince autour de la circonférence. Coupez le nerf optique entre la rétine et l’œilleton et retirez l’œilleton avec des ciseaux.

Faites des incisions de la périphérie de la rétine jusqu’au nerf optique. Alternativement, pour utiliser toute la rétine, faites des incisions de la périphérie à mi-chemin du nerf optique pour raccourcir le support. Retirez la partie excédentaire avec un tour.

Polissez ensuite les surfaces rugueuses avec du papier de verre fin. Retirez les pieds sous l’anneau. Coupez l’extrémité étroite d’une pipette en plastique.

Transférez ensuite le tissu avec un peu de solution sur la membrane. Retirez progressivement la solution tout en étalant la rétine et dépliez le tissu. Fixez maintenant la rétine à la membrane avec les cellules ganglionnaires vers le haut.

Coupez l’embout de maintien d’une seringue d’un millilitre et placez-la directement sous le tissu. Tirez sur le piston à un volume d’environ 0,3 millilitre pour emboîter physiquement le tissu dans la membrane. Tirez des pipettes capillaires en boro silicate en utilisant une résistance d’environ un méga.

Cassez ensuite doucement l’extrémité de chaque pipette patch. Ensuite, ajoutez 0,3 microlitre de solution de coloration en stock à 10 microlitres de solution de sonnerie tamponnée en tas. Placez maintenant la membrane dans la chambre d’enregistrement imprégnée d’une solution de sonnerie tamponnée chaude et oxygénée.

Positionnez la pipette contenant le colorant contre la membrane limitante interne à l’aide d’un manipulateur micrométrique. Avancez davantage la pipette pour qu’elle pénètre dans la membrane limitante interne. Injectez ensuite la solution de coloration dans le ou les multiples endroits ciblés.

Attendez maintenant 10 minutes pour que le tissu se remette de l’injection tout en le regardant sous éclairage par épifluorescence. Si vous le souhaitez, transférez l’insert dans une boîte de culture à fond de verre, en le plaçant côté rétine vers le bas. Ajoutez une goutte de solution en tas pour garder l’échantillon humide.

Placez également trois points de graisse sous vide autour du périmètre de l’anneau en plastique pour fixer fermement l’insert à la boîte de culture. Transférez la boîte sur la platine du microscope après la fixation, immergez la membrane dans les solutions de gradient de saccharose. Excisez la membrane de l’anneau d’insertion en plastique.

Retirez autant de solution que possible avec des lingettes Kim et placez-la sur param avec la rétine vers le haut. Transférez le paraforme avec le tissu dans la chambre du cryostat et ajoutez une goutte de milieu OCT. Utilisez le dispositif de congélation rapide pour accélérer la congélation.

Détachez l’échantillon congelé et retournez-le. Coupez maintenant l’excédent d’OCT congelé. Laissez environ deux millimètres autour de l’échantillon sur trois côtés et à quelques millimètres du côté, qui sera fixé au support.

Couvrez le côté rétinien exposé avec une goutte d’OCT en laissant la zone attachée libre. Congelez la membrane contenant le tissu rétinien. Placez une goutte d’OCT sur un anneau de support froid.

Insérez immédiatement l’échantillon congelé dans la goutte. Coupez des sections de 10 à 20 microns à moins 19 degrés Celsius et positionnez-les sur des lames d’adhérence en polylysine chaudes. Placez les diapositives avec les sections attachées sur une plate-forme chauffante à 41 degrés Celsius pendant deux à trois minutes dans l’obscurité.

Conservez ensuite les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Cette expérience illustre une caractérisation simple et rapide du système vasculaire rétinien en tant que réseau élaboré de vaisseaux sanguins qui s’étendent sur plusieurs couches rétiniennes. En combinant un chargement en bolus d’isosélectine avec un marquage par immersion de sulfamide rumine, les tissus vivants peuvent être visualisés et scannés presque immédiatement dans la rétine, les vaisseaux sanguins peuvent être marqués de la couche superficielle à la couche profonde.

Contrairement à une membrane limitative relativement bien diffusible, la SRH est sélective et ne pénètre pas bien à travers la membrane limitante interne. La fixation au carbimide présente plusieurs avantages par rapport à la fixation conventionnelle au paraformaldéhyde lors du marquage des protéines synaptiques, par exemple, après une courte période de fixation par coloration immunofluorescente au carbimide pour le marqueur synaptique. La PSD 95 dans l’IPL avait un aspect ponctué brillant compatible avec la distinction des synapses individuelles.

En revanche, lors de l’utilisation d’un fixateur d’aldéhyde paraforme conventionnel, l’identification des composants synaptiques est moins claire. Des résultats similaires ont été obtenus dans les coupes de cryostat rétinien. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de monter un tissu délicat sur cette membrane et de la façon d’appliquer une coloration chimique cyto à la préparation qu’un maître.

Il vous faudra 15 minutes pour fixer la rétine au filtre.