Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l'imagerie et immunohistochimie

Cette procédure utilise un tissu rétinien de souris pour démontrer comment stabiliser un tissu nerveux délicat afin de préserver son intégrité structurelle. Au cours de plusieurs étapes de coloration immunohistochimique, commencez par énucléer l’œil, retirez la cornée et séparez la rétine de la sclère. Effectuez des incisions dans la cupule oculaire rétinienne pour aplatir le tissu.

Ensuite, fixez la rétine sur une membrane renforcée munie d'un anneau à l'aide d'un transfert par aspiration, sans manipulation directe, afin de préserver l'intégrité du tissu. Transférez maintenant l'anneau dans une plaque multi-puits pour la coloration. Nos résultats montrent que cette technique peut être utilisée efficacement sur des tissus vivants et offre un substrat supérieur à l'imagerie des protéines synaptiques par rapport aux méthodes existantes de manipulation de la rétine disséquée.

Ces techniques permettent le transfert de tissus délicats avec une manipulation physique minimale. Cela réduira le risque de distorsion et de dommages. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque nous avons dû effectuer des enregistrements sur des tissus montés à plat dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne (RD), dont la rétine est extrêmement mince et fragile en raison de la perte cellulaire importante provoquée par la mutation Chief.

Un postdoctorant de notre laboratoire m'accompagnera pour démontrer la procédure. Tout d'abord, énucléer les yeux d'une souris anesthésiée et transférer les yeux dans une solution de Ringer tamponnée et oxygénée. Pour retirer la cornée, maintenir l'œil au niveau du limbe à l’aide de forceps, puis effectuer une incision circulaire le long de l’ora serrata.

Extraire la lentille avec une pince pour les injections en bolus et les enregistrements électrophysiologiques. Utiliser une pince à bord mixte pour retirer le plus de vitré possible. Maintenant, stabiliser la cupule oculaire en tenant fermement la sclère avec la pince.

Placer une deuxième paire de forceps entre la rétine et la cupule oculaire. Déplacer lentement les forceps autour de la circonférence. Couper le nerf optique entre la rétine et la cupule oculaire, puis retirer la cupule oculaire à l’aide de ciseaux.

Effectuez des incisions depuis la périphérie rétinienne jusqu'au nerf optique. En alternative, pour utiliser toute la rétine, pratiquez des incisions depuis la périphérie jusqu'à mi-chemin du nerf optique afin de raccourcir le porte-objet. Retirez la partie excédentaire à l'aide d'un tour.

Ensuite, polissez les surfaces rugueuses avec du papier de verre fin. Retirez les pieds situés sous l'anneau. Coupez l'extrémité étroite d'une pipette en plastique.

Ensuite, transférez le tissu avec un peu de solution sur la membrane. Retirez progressivement la solution tout en étalant la rétine et en dépliant le tissu. Fixez maintenant la rétine sur la membrane avec les cellules ganglionnaires orientées vers le haut.

Coupez l'extrémité de maintien d'une seringue d'un millilitre et placez-la directement sous le tissu. Tirez doucement sur le piston jusqu'à un volume d'environ 0,3 millilitre pour emprisonner physiquement le tissu dans la membrane. Tirez quelques pipettes capillaires en borosilicate en utilisant une résistance d'environ un mégaohm.

Ensuite, cassez délicatement la pointe de chaque pipette de patch. Ajoutez ensuite 0,3 microlitre de la solution mère de colorant is-sélectine à 10 microlitres de la solution de Ringer tamponnée heaps. Placez maintenant la membrane dans la chambre d’enregistrement perfusée avec de la solution de Ringer tamponnée heaps chauffée et oxygénée.

Positionner la pipette contenant le colorant contre la membrane limitante interne à l'aide d'un micromanipulateur. Faire avancer davantage la pipette afin de pénétrer la membrane limitante interne. Ensuite, injecter la solution de coloration dans un ou plusieurs emplacements ciblés.

Attendez maintenant 10 minutes pour permettre au tissu de se remettre de l'injection, en l'observant sous éclairage à fluorescence en épifluorescence. Si désiré, transférez l'insert dans une boîte de culture à fond en verre, en le plaçant côté rétine vers le bas. Ajoutez une goutte de solution heap pour maintenir l'échantillon humide.

Également, placer trois points de graisse à vide autour du périmètre de l'anneau en plastique pour fixer fermement l'insert à la boîte de culture. Transférer la boîte sur la platine du microscope après la fixation, immerger la membrane dans les solutions de gradient de saccharose. Découper la membrane à partir de l'anneau en plastique de l'insert.

Retirez autant de solution que possible à l’aide de lingettes Kim et placez-la sur un porte-objet avec la rétine vers le haut. Transférez le paraforme avec le tissu dans la chambre du cryostat et ajoutez une goutte de milieu OCT. Utilisez l’appareil de congélation rapide pour accélérer la congélation.

Détachez l'échantillon congelé et retournez-le. Coupez maintenant l'excès d'OCT congelé. Laissez environ deux millimètres autour de l'échantillon sur trois côtés et quelques millimètres du côté qui sera fixé au porte-échantillon.

Couvrez le côté rétinien exposé avec une goutte de OCT en laissant la zone attachée libre. Congelez la membrane contenant le tissu rétinien. Déposez une goutte de OCT sur un anneau support froid.

Insérez immédiatement l'échantillon congelé dans la goutte. Coupez des sections de 10 à 20 micromètres à moins 19 degrés Celsius et placez-les sur des lames d'adhésion au polylysine tièdes. Placez les lames avec les sections fixées sur une plateforme chauffante à 41 degrés Celsius pendant deux à trois minutes à l'abri de la lumière.

Ensuite, conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Cette expérience illustre une caractérisation rapide et simple de la vascularisation rétinienne en tant que réseau complexe de vaisseaux sanguins s'étendant sur plusieurs couches rétiniennes. En combinant une injection en bolus d'iso-sélectine avec un marquage par immersion dans la sulfa-roumine, les tissus vivants peuvent être visualisés et analysés presque immédiatement dans la rétine, et les vaisseaux sanguins peuvent être marqués depuis la couche superficielle jusqu'à la couche profonde.

Contrairement aux molécules relativement bien diffusibles, la SRH sélectine ne traverse pas efficacement la membrane limitante interne. La fixation au carbimide présente plusieurs avantages par rapport à la fixation classique au paraformaldéhyde lors de l'étiquetage des protéines synaptiques ; par exemple, après une courte période de fixation au carbimide, la coloration immunofluorescente du marqueur synaptique PSD-95 dans la couche plexiforme interne présentait un aspect ponctué brillant, compatible avec la distinction des synapses individuelles.

En revanche, lorsqu'on utilise un fixateur classique au paraformaldéhyde, l'identification des composants synaptiques est moins nette. Des résultats similaires ont été obtenus sur des sections rétiniennes en cryostat. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment monter un tissu délicat sur cette membrane et comment appliquer une coloration cytochimique à la préparation finale.

Il vous faudra 15 minutes pour fixer la rétine sur le filtre.