Chronique à long terme

L'objectif général de cette procédure est d'établir une infection chronique persistante à long terme des voies respiratoires par Pseudomonas aeruginosa chez la souris. Cela est réalisé en cultivant d'abord la souche bactérienne sélectionnée de Pseudomonas aeruginosa. La deuxième étape consiste à incorporer les bactéries dans de petites billes d'agar en mélangeant les bactéries avec de l'agar et de l'huile minérale à 50 degrés Celsius, puis en refroidissant le mélange à quatre degrés Celsius sous agitation lente et continue.

Ensuite, l'huile minérale est éliminée par plusieurs lavages avec du PBS, et un aliquot des billes d'agar est homogénéisé et ensemencé sur des boîtes de gélose. Pour déterminer la teneur bactérienne, la dernière étape consiste à injecter quelques microlitres de la suspension de billes d'agar dans la trachée de souris afin d'induire une infection pulmonaire chronique à Pseudomonas aeruginosa. Finalement, le liquide de lavage broncho-alvéolaire et les poumons peuvent être récupérés à différents moments après le défi et ensemencés sur des boîtes de gélose afin de détecter le pourcentage de souris chroniquement infectées et la charge bactérienne dans les voies respiratoires des souris survivantes. Le principal avantage de ces méthodes utilisant des billes d'agar par rapport aux méthodes existantes est qu'elles permettent une infection chronique stable à long terme chez un pourcentage élevé de souris, entraînant une persistance d'une charge bactérienne stable jusqu'à un mois.

Les méthodes AGA créent dans le poumon de la souris un environnement microaérobie permettant aux bactéries de croître sous forme de microcolonies. De façon similaire à la croissance dans le mucus des patients atteints de mucoviscidose, ces méthodes peuvent aider les chercheurs à répondre à des questions essentielles concernant la pathogenèse de la mucoviscidose et d'autres maladies respiratoires, ainsi qu'à tester de nouvelles thérapies contre les infections pulmonaires chroniques à Pseudomonas aeruginosa. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour induire une infection chronique par d'autres pathogènes, y compris Burkholderia dolosa ou Staphylococcus aureus. Des co-infections avec différents pathogènes ou des expériences de compétition sont également possibles. La démonstration de la procédure sera effectuée par Pheno, postdoctorante, et Camil Riva, doctorante dans mon laboratoire. Trois jours avant l'infection des souris, ensemencer une boucle pleine de Pseudomonas aeruginosa à partir de la souche congelée à −80 °C sur une boîte de gélose au tryptone-soja, puis incuber à 37 °C pendant la nuit.

Le lendemain, prélevez une colonie unique inoculée dans cinq millilitres de bouillon tryptone soja et incubée à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans un incubateur agité à 200 tr/min. Le lendemain matin, diluez un petit aliquot de la culture bactérienne de nuit dans du tampon phosphate salin à raison de un à 50. Mesurez ensuite la densité optique à 600 nanomètres.

Ensuite, diluez la culture bactérienne de nuit en ajoutant deux OD de la suspension bactérienne dans un nouveau tube contenant 20 millilitres de TSB frais incubé à 37 degrés Celsius pendant environ trois à quatre heures en phase logarithmique dans un incubateur agité à 200 tr/min jusqu'à l'obtention d'un total de 10 à 50 OD. Une fois que Pseudomonas aeruginosa a atteint la phase logarithmique, récupérez les cellules bactériennes par centrifugation à 2 700 × g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Après cela.

Resuspendez le culot bactérien dans un millilitre de PBS stérile et vortexez soigneusement pour le resuspendre complètement. Ensuite, mélangez un millilitre de la suspension bactérienne avec neuf millilitres de TSA liquide prééquilibré à 50 degrés Celsius. Ajoutez ce mélange à l'huile minérale lourde préchauffée à 50 degrés Celsius.

Agiter immédiatement pendant six minutes à température ambiante. L'agitation doit produire un vortex visible dans l'huile. Refroidir ensuite le mélange à quatre degrés Celsius, en agitant à la vitesse minimale pendant 35 minutes.

Ensuite, laisser reposer sur glace pendant 20 minutes supplémentaires. Par la suite, transférer les billes d'agar dans des tubes Falcon de 50 millilitres et centrifuger à 2 700 × g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez soigneusement l'huile minérale et lavez le culot de billes d'agar avec du PBS stérile. Répétez la procédure six fois après trois lavages. Les billes peuvent être centrifugées par gravité au lieu d'utiliser la centrifugeuse après le dernier lavage.

Ressuspendre les billes d'agar dans 20 à 30 millilitres de PBS de manière aseptique et homogénéiser 0,5 millilitre des billes. Ensuite, diluer 100 microlitres des billes homogénéisées dans 900 microlitres de PBS stérile, puis effectuer six dilutions sérielles jusqu'à 10 à la puissance moins six selon un rapport de un pour dix.

Ensuite, réaliser une série de dilutions sur les boîtes de TSA, y compris l'échantillon non dilué. Diluer l'échantillon jusqu'à 10 à la puissance moins six et incuber les boîtes à 37 degrés Celsius. Mesurer le diamètre des billes à l'aide d'un microscope optique inversé sur plusieurs champs.

Le diamètre des billes doit être compris entre 100 et 200 micromètres avant le défi chez les souris. Compter le nombre d'unités formant des colonies sur les boîtes de gélose TSA afin de déterminer le nombre d'UFC par millilitre dans la suspension de billes d'agar. Ensuite, ajuster le volume des billes d'agar à deux à quatre fois 10 à la puissance sept UFC par millilitre pour obtenir un inoculum optimal de un à deux fois 10 à la puissance six dans 50 microlitres.

Placer une souris mâle âgée de six à huit semaines, préalablement anesthésiée avec de la kétamine et de la xylazine, en position dorsale sur un tapis chauffant, puis désinfecter son pelage avec de l'éthanol à 70 %. Exposer la trachée par une incision cutanée verticale. Ensuite, utiliser une pince pour séparer les muscles recouvrant la trachée.

Ensuite, prélevez jusqu'à 50 microlitres de suspension de billes d'agar à l'aide d'une seringue d'un millilitre. Puis, intubez la trachée avec un cathéter et fixez la seringue d'un millilitre contenant la suspension de billes d'agar au cathéter. Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour permettre l'implantation des billes dans le poumon.

Ensuite, fermer l'incision à l'aide de clips de suture. Dans cette étape, placer la souris euthanasiée en position supine et désinfecter son pelage avec de l'éthanol à 70 %.

Ensuite, exposer la trachée et la cage thoracique par une incision cutanée verticale. Puis, exposer les poumons en coupant le diaphragme. Insérer un fil de suture sous la trachée à l’aide de pinces et intuber la trachée avec un cathéter.

Ensuite, tirez sur les deux extrémités du fil de suture pour fixer le cathéter à la trachée, et non le fil autour de la trachée. Prélevez maintenant un millilitre de milieu de culture cellulaire à l’aide d’une seringue d’un millilitre et fixez-la au cathéter. Enfoncez le piston de la seringue pour laver les poumons, récupérez immédiatement le liquide et stockez-le dans un tube de 15 millilitres.

Répétez cette étape trois fois avec un volume total de trois millilitres de milieu, puis conservez le liquide de lavage bronchoalvéolaire sur de la glace en vue de la collecte et de l'analyse des poumons. Prélève les poumons de la souris. Rince-les dans du PBS stérile.

Ensuite, séparez les lobes. Placez-les dans un tube à fond rond contenant deux millilitres de PBS stérile et conservez sur de la glace. Homogénéisez aseptiquement les poumons de manière successive.

Diluez l'homogénat dans du PBS selon un rapport de un à dix. Ensuite, effectuez des dilutions sérielles, y compris l'échantillon non dilué, sur des boîtes de gélose TSA et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Prélevez le liquide de lavage broncho-alvéolaire sur la glace et diluez-le avec la solution de Turk selon un rapport de un à deux sous un microscope optique inversé.

Compter le nombre total de cellules dans une chambre de numération de Burker pour la numération différentielle. Centrifuger le liquide de lavage broncho-alvéolaire à 330 ×g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre le culot à une concentration d'un million de cellules par millilitre dans un milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Placer les lames de microscope et les filtres dans les fentes appropriées du cytocentrifugeur, les filtres en carton étant orientés vers le centre.

Introduisez 150 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés du cytosine et effectuez une centrifugation cyto à 300 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, un dépôt de cellules doit être observé ; après coloration, un décompte différentiel peut être réalisé au microscope. Cette figure montre l'évolution temporelle de l'infection chronique par Pseudomonas aeruginosa avec la souche de référence PA O1 et RP 73.

Souche clinique pour chaque point temporel. Les histogrammes représentent le pourcentage de mortalité induite par la bactériémie en rouge et de survie en gris, ou le pourcentage d'animaux ayant éliminé l'infection en blanc, et ceux capables d'établir une infection chronique en vert. La souche clinique *Pseudomonas aeruginosa* RP73 est plus efficace pour établir une infection chronique comparée à la souche de laboratoire PAO1.

Les souris survivantes ont été euthanasiées aux moments indiqués et les poumons ont été prélevés, homogénéisés et cultivés sur des boîtes de TSA afin de déterminer la charge bactérienne. Les courbes de croissance des souches P oh one et RP 73 dans les poumons de souris montrent que la quantité de bactéries trois jours après l'infection est plus élevée pour P oh one par rapport à RP 73. Ensuite, à partir du septième jour, lorsque l'infection chronique est établie, la charge bactérienne se stabilise entre 10⁴ et 10⁵ UFC par poumon pour les deux souches. Après sept jours d'infection chronique avec la souche clinique RP 73, le recrutement des cellules inflammatoires dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire a été évalué.

Le nombre de leucocytes totaux est considérablement plus élevé chez les souris infectées par RP 73 par rapport aux souris non infectées. Les cellules les plus représentées sont les neutrophiles, indiquant une réponse importante du système immunitaire inné à l'infection chronique. Dans la case ci-dessous, des flèches indiquent des neutrophiles et un macrophage tels qu'observés sur une goutte déposée sur une lame après cyto-centrifugation.

On observe ici une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine sur des coupes histologiques de poumons de souris après sept jours d'infection chronique avec des billes de la souche clinique rp. 73. Des billes indiquées par des flèches peuvent être observées dans la lumière bronchique ainsi que de microcolonies de cellules bactériennes. Dans les zones infectées, les bronches et le parenchyme pulmonaire se caractérisent par un recrutement massif de cellules inflammatoires.

Alors que les voies respiratoires d'une souris non infectée étaient dépourvues de cellules inflammatoires, le diamètre et la concentration finale des BES sont des détails très importants. Pour obtenir un bon résultat, il est essentiel de garder à l'esprit que la taille est influencée par la vitesse de rotation pendant la phase de refroidissement, et que la quantité initiale de bactéries peut affecter la dilution finale des billes. En outre, le choix d'une souche appropriée de pseudomonas, provoquant une faible mortalité chez les souris et un pourcentage élevé d'infection chronique, permettra de minimiser le nombre de souris utilisées.

Après l'infection des souris, un décompte bactérien est effectué. En outre, une analyse de la réponse inflammatoire peut être réalisée, incluant le décompte total et différentiel des cellules, le dosage viral dans le liquide bronchique, l'analyse des cytokines, le dosage de la myéloperoxydase et une analyse histologique, afin d'étudier la réponse à l'infection bactérienne. N'oubliez pas que le travail avec des pathogènes opportunistes comme Pseudomonas exige toujours des précautions, telles que le port de gants, la manipulation des bactéries sous hotte de sécurité biologique et l'utilisation de techniques stériles.

Le développement de modèles animaux appropriés a permis la mise à l'essai préclinique de nouvelles molécules antibactériennes et anti-inflammatoires. Cette étape est cruciale pour les futures interventions thérapeutiques contre les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique ou d'autres maladies respiratoires.