Name: Chronique à long terme Pseudomonas aeruginosa Infection des voies respiratoires chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Découvrez la méthode des billes d'agar pour établir une infection chronique à Pseudomonas aeruginosa chez la souris. Cette technique permet de maintenir une charge bactérienne stable jusqu'à un mois.

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Recherche dans le laboratoire de Bragonzi a été financé par la Fondation italienne de la fibrose kystique (CFaCore) et de l&#39;UE-F7-2009-223670. Une partie de ce travail a été réalisé dans ALEMBIC, un laboratoire de microscopie de pointe, et l&#39;histopathologie de la souris a été réalisée dans l&#39;Unité d&#39;anatomie pathologique (San Raffaele Scientific Institute).

Une. Préparer les bactéries Infection chronique (trois et deux jours avant souris Challenge) <ol><li> Sélectionnez le P. approprié aeruginosa souche à tester. </li><li> Inoculer une anse de P. aeruginosa d&#39;un -80 ° C culture mère à une plaque Trypticase Soy Agar (TSA) et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Choisissez une seule colonie et inoculer dans 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) dans un tube de 15 ml enfichable plafonné et incuber à 37 ° C pendant une nuit dans un incubateur à agitation à 200 rpm. </li></ol> 2. Intégrer les bactéries dans les perles Agar pour l&#39;infection chronique (un jour avant l&#39;infection) <ol><li> Prendre une petite aliquote de culture d&#39;une nuit de bactéries, dilué à 1:50 dans du tampon phosphate salin (PBS) et mesurer la densité optique (DO) à 600 nm. </li><li> Diluer la culture bactérienne nuit en ajoutant 2 OD dans un nouveau tube de pression coiffé contenant 20 ml de TSB frais. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant environ 3 -4 h à identifier la phase dans un incubateur à agitation à 200 rpm, jusqu&#39;à un total de 10-15 OD est atteint. </li><li> Entre-temps, préparer la TSA, TSB faite avec de 1,5% d&#39;agar, dans un autoclave et équilibrer à 50 ° C dans un bain d&#39;eau. Equilibrer 150 ml de preautoclaved huile minérale lourde dans un erlenmeyer à 50 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Une fois P. aeruginosa atteint la phase de journal, de recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 2700 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot bactérien dans 1 ml de PBS stérile et à fond vortex pour remettre en suspension le culot totalement. </li><li> Mélanger 1 ml de suspension bactérienne avec 9 ml de TSA liquide pré-équilibré à 50 ° C. </li><li> Ajouter les 10 ml TSA-P. aeruginosa mélange à l&#39;huile minérale lourde (préchauffé à 50 ° C) et immédiatement en remuant pendant 6 min à température ambiante. L&#39;agitation doit produire un vortex visible dans l&#39;huile. </li><li> Refroidir le mélange à 4 ° C, sous agitation au minimum spEED pendant 35 min (Figure 1). </li><li> Placez le mélange agar-perles d&#39;huile dans la glace pendant 20 minutes supplémentaires. </li><li> Transférer l&#39;agar-perles en tubes de 50 ml Falcon et centrifuger à 2700 g pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Enlever précision huile minérale et laver avec du PBS stérile six fois, comme décrit à l&#39;étape 2.11. Après trois lavages, les billes peuvent être rassemblées en un culot par gravité au lieu d&#39;utiliser la centrifugeuse. Après le dernier lavage, remettre en suspension les perles d&#39;agar-20 à 30 ml dans du PBS. </li><li> Prélever une partie aliquote des billes (environ 0,5 ml) et d&#39;homogénéiser de façon aseptique. </li><li> Prenez 100 pi de perles homogénéisés et diluer dans 900 pi de PBS stérile. Diluer en série 01:10 jusqu&#39;à 10 -6. </li><li> Plate dilution en série sur des plaques de TSA, y compris un échantillon non dilué jusqu&#39;à 10 -6 et incuber les plaques à 37 ° C. </li><li> Mesurer le diamètre de bourrelet à l&#39;aide d&#39;un microscope optique inversé dans plusieurs domaines. Le diamètre du cordon doit être comprise entre 100-200 um ( <strong&gt; Figure 1). </li><li> Stocker les perles nuit à 4 ° C. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la préparation de billes et de la souris infection agar. P. aeruginosa cellules sont remises en suspension dans 1 ml de PBS et on a ajouté à 9 ml de TSA liquide (50 ° C). Ce mélange est ajouté à 150 ml d&#39;huile minérale lourde, à 50 ° C dans un ballon et on agite à grande vitesse pendant 6 min à température ambiante. Lorsque le ballon est refroidi à 4 ° C avec une agitation lente pendant 35 min, la gélose se solidifie créer des perles, et les bactéries présentes dans le mélange sont incorporés dans les perles d&#39;agar-agar. Détail d&#39;un bourrelet de gélose contenant des cellules bactériennes est signalée (A). Après avoir retiré l&#39;huile minérale avec plusieurs lavages à l&#39;aide de PBS stérile, la suspension d&#39;agar-perles est prêt fou l&#39;inoculation dans les poumons de souris par une injection intra-trachéale (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . 3. Souris Défi avec l&#39;agar-perles Déclaration éthique: ce protocole et d&#39;expérimentation suivent les directives du comité de protection des animaux et de l&#39;éthique de l&#39;Institut scientifique San Raffaele. <ol><li> Comptez le nombre d&#39;unités formant colonie (UFC) sur les plaques de TSA pour déterminer le nombre de CFU / ml dans la suspension d&#39;agar-billes. Diluer l&#39;agar-perles avec du PBS stérile à 2-4 x 10 7 UFC / ml pour atteindre un inoculum optimale de 1-2 x 10 6 à 50 pi. </li><li> Anesthésier C57Bl/6NCr (20 à 22 g, âgées de 6-8 semaines) chez la souris mâle avec de la kétamine (50 mg / ml) et de xylazine (5 mg / ml) dans du NaCl à 0,9% sont administrés à un volume de 0,002 ml / g de poids corporel par injection intra-péritonéale. NOTE: L&#39;anesthésie est considérée ADEQluer lorsque l&#39;animal reste toujours tranquillement, est insensible aux stimuli externes, et a coeur et taux respiratoires. </li><li> Placez la souris en position couchée. Désinfecter le manteau de la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Exposer la trachée par une coupe verticale de la peau et intuber la trachée avec un stérile, souple 22 G 0,9 mm x 25 mm cathéter IV, maintenir l&#39;attention de retirer le stylet tout en se déplaçant vers le bas dans la trachée. Insérer le cathéter n&#39;est pas trop profondément dans la trachée. S&#39;arrêter avant de la carène (bifurcation). </li><li> Prendre immédiatement un volume de 50 ul de la suspension de billes d&#39;agar par une seringue de 1 ml et l&#39;attacher au cathéter. Poussez doucement le piston de la seringue, permettant aux perles à implanter dans le poumon. Fermer l&#39;incision en utilisant des agrafes. </li><li> Placez l&#39;animal sur un coussin chauffant jusqu&#39;à ce que complètement réveillé. </li></ol> 4. Évaluation de souris <ol><li> Respecter les souris quotidiennement les signes cliniques, y compris la qualité de la robe, de la posture,marche, et l&#39;état d&#39;hydratation. Surveiller le poids corporel par jour. Les souris qui perdent ≥ 20% du poids corporel doivent être euthanasiés. </li><li> Suivez le point 5 de la collecte de fluide lavage broncho-alvéolaire (LBA) et les points 6 ou 7 pour la collecte des poumons et de l&#39;analyse sur un total de CFU, l&#39;analyse histologique, la réponse inflammatoire en termes de nombre total et différencié cellule de la BAL, l&#39;analyse des cytokines, et la myéloperoxydase (MPO). </li></ol> 5. BAL Collecte et analyse des fluides <ol><li> Euthanasier les souris par inhalation de CO 2. </li><li> Placez la souris en position couchée. Désinfecter le manteau de la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Exposer la trachée et de la cage thoracique par une coupe verticale de la peau. Exposer les poumons en coupant le diaphragme. </li><li> Insérez un fil de suture dans la trachée en utilisant des pinces et intuber la trachée avec un stérile, souple 22 g 0,9 mm x 25 mm cathéter IV. Tirez les deux extrémités du fil de suture pour lier le catheter de la trachée et de nouer le fil autour de la trachée. </li><li> Prélever un volume de 1 ml de RPMI 1640 en utilisant une seringue de 1 ml et l&#39;attacher au cathéter. Poussez le piston de la seringue pour laver les poumons et récupérer immédiatement le liquide, le stocker dans un tube de 15 ml. NOTE: Si les cytokines doivent être analysés, ajouter des inhibiteurs de protéase à RPMI 1640. </li><li> Répéter cette étape trois fois avec un total de 3 ml de milieu RPMI. A partir de maintenant, stocker le liquide de LBA sur la glace. Passez à l&#39;étape 6 pour la collecte et l&#39;analyse des poumons. NOTE: S&#39;il vous plaît noter que pas tout le liquide seront récupérés (2,8 ml maximum). </li><li> Pour la quantification des bactéries présentes dans le fluide de BAL, prélever une petite aliquote (300 pi), en série, diluer 1:10 dans du PBS stérile, plaque sur des plaques de TSA et incuber à 37 ° C pendant une nuit. </li><li> Compter les cellules totales en utilisant un microscope optique inversé lumière diluant une partie aliquote du fluide BAL 1:02 avec une solution Tuerk dans une chambre de comptage de cellules Burker. </li><li> Centrifuger le remaining LBA à 330 g pendant 8 min à 4 ° C. Prendre le surnageant pour l&#39;analyse ELISA de cytokines, stocker à -80 ° C. Suivez les étapes 5.10 à 5.13 pour le nombre de cellules écart par cytospin. </li><li> Si la pastille est rouge, lyser les erythrocytes de remettre en suspension le culot dans 250 à 300 pi de tampon de lyse RBC dilués à 1:10 dans de l&#39;eau distillée ultra pure pendant 3 min. Neutraliser avec 2 ml de PBS et centrifuger à 330 g pendant 8 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans du milieu RPMI 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Utiliser un volume qui fournira 1 x 10 6 cellules / ml, sur la base du nombre total de cellules. </li><li> Placer des lames de microscope et des filtres dans des fentes appropriées dans la cytospin avec les filtres en carton faisant face au centre de la cytospin. Introduire à la pipette 150 ul de chaque échantillon dans les puits appropriés de la cytospin et centrifuger dans un cytocentrifugeuse à 300 g pendant 5 min. </li><li> Colorer les lames par Romanowsky coloration utilisant un kit commercial, selon le males instructions tion du fabricant et comme décrit précédemment 12. Suivez les étapes 5.14 à 5.17 pour MPO analyse de l&#39;activité. </li><li> Centrifuger le volume restant de BAL à 380 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 pl de chlorure Hexadecyltrimethylammonium à 0,5% dans de l&#39;eau distillée ultra pure pour lyser les cellules. La suspension peut être congelé à -20 ° C pendant plusieurs jours avant de réaliser le dosage. </li><li> Centrifuger à 16 000 g pendant 30 min à 4 ° C et en utilisant le surnageant pour effectuer dosage MPO dans des plaques à 96 puits, ajouter l&#39;échantillon en double exemplaire dans chaque puits et, si nécessaire, également des dilutions appropriées de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter à chaque échantillon dans les puits un volume égal de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tétraméthylbenzidine (TMB) comme substrat pour la peroxydase. Laisser la réaction doit se faire dans l&#39;obscurité pendant au moins 5 minutes et jusqu&#39;à ce que il n&#39;y a plus développement de la couleur. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 2 MH 2 SO 4 and mesurer la DO à 450 nm. La valeur de DO sera directement proportionnelle à l&#39;activité de la peroxydase. </li></ol> 6. Mesure de la charge bactérienne dans les poumons et de cytokines analyse <ol><li> Immédiatement après le prélèvement de fluide BAL, poumons d&#39;accise de la souris, les rincer dans du PBS stérile, lobes distincts, les mettre dans un tube à fond rond avec 2 ml de PBS stérile et stocker sur la glace. NOTE: Si cytokines sont à analyser, ajouter des inhibiteurs de protease à du PBS pour les tubes. </li><li> Homogénéiser aseptique poumons, prendre une petite aliquote (300 pi) de l&#39;homogénat, série diluer 1:10 dans PBS, plaque sur des plaques de TSA et incuber à 37 ° C pendant la nuit. S&#39;il vous plaît noter que la charge bactérienne des voies aériennes totale sera la somme des CFU trouvés dans le fluide BAL et les poumons. </li><li> Centrifuger l&#39;homogénat à 16 000 xg restant pendant 30 min à 4 ° C. Prenez le surnageant pour ELISA analyse des cytokines, et conserver à -80 ° C. </li></ol> 7. L&#39;examen histologique &lt;ol&gt; <li> Effectuer une analyse histologique seulement sur les poumons dans lequel le liquide de LBA n&#39;a pas été recueillies, afin de préserver l&#39;aspect et les propriétés du poumon. </li><li> Euthanasier la souris par inhalation de CO 2. </li><li> Exposer la cage thoracique par une coupe verticale de la peau, les poumons exposer en coupant le diaphragme. </li><li> poumons d&#39;accise, les rincer dans du PBS, séparent les lobes, les mettre dans un tube contenant du formol 5-10 ml 10% neutre tamponné (4% de formaldéhyde) et conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Intégrer poumons en paraffine, en utilisant des procédures standard. </li><li> Couper 5 sections um d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un microtome. </li><li> diapositives de coloration à l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine et couvrent les lames avec une lamelle, selon les procédures standard. </li><li> Examiner les lames à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à fond clair et à acquérir des images en connectant le microscope à un appareil photo. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes essentielles de la P. aeruginosa-perles préparation et le défi de la souris sont présentés ci-dessous. La souche de P. aeruginosa utilisé pour les souris défi est critique. La mortalité, une infection chronique ou clairance peuvent différer sensiblement en fonction de la souche bactérienne utilisée pour le défi. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car elle a entraîné une m...

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique causée par des mutations dans le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) de gène. Ce gène code pour un canal chlorure exprimé sur la membrane de la plupart des cellules épithéliales. Dilatation des bronches, quantité de mucus et parenchymateuse destruction causée principalement par des infections à Pseudomonas aeruginosa conduit progressivement à une maladie pulmonaire grave et de mortalité dans la plupart des patients atteints de mucoviscidose 1. Comprendre la pathogenèse de la CF et le développement de nouvelles thérapies reposent sur un modèle animal avec caractéristiques de FC. Plusieurs souris, génétiquement modifiées pour le gène CFTR ont été générés, mais limites dans la capacité de ces espèces de récapituler les maladies pulmonaires CF-comme et plusieurs autres anomalies des organes observés chez les patients CF ont été largement documentés 2. Développement de l&#39;infection est l&#39;un des défis majeurs dans le modèle animal FC. Les cl de la littératuresuggère que tôt une infection chronique durant plus d&#39;un mois peut être atteint que si les souris sont inoculés avec des bactéries incorporées dans un agent d&#39;immobilisation tels que l&#39;agar, agarose, ou algues alginate 3-5. Ces agents immobilisants fournissent les conditions microaérobie / anaérobies qui permettent aux bactéries de se développer sous la forme de microcolonies, de façon similaire à la croissance dans le mucus de patients atteints de mucoviscidose 6. Ce modèle de l&#39;infection chronique conduit à la persistance de la bactérie dans les poumons, causant une inflammation des voies respiratoires et des dommages 7. Toutefois, en fonction de la méthode utilisée, la souche bactérienne et la dose inoculée dans les poumons, le pourcentage de souris infectées chroniques et la charge bactérienne dans les poumons récupéré à différents points dans le temps peuvent varier considérablement. En particulier, le principal défi pour l&#39;infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l&#39;épreuve, indiquant thacellules bactériennes sont progressivement effacés t par l&#39;hôte. En sélectionnant le P. aeruginosa RP73 souche clinique d&#39;une collection de FC isole 8 nous avons obtenu avec succès une faible mortalité, des lésions plus sévères, et le pourcentage élevé d&#39;infection chronique avec une charge bactérienne stable jusqu&#39;à un mois chez la souris C57Bl/6NCrl. Ce document détaille la méthodologie pour intégrer P. aeruginosa dans les billes d&#39;agar-agar, nous avons des souris infectées par instillation intratrachéale, mesuré la charge bactérienne et des cytokines dans les poumons, recueillies LBA et effectué un examen histologique. Dans l&#39;ensemble, ce protocole aidera les chercheurs à répondre à des questions d&#39;une importance fondamentale sur la pathogenèse 8,9 et de tester de nouvelles thérapies contre P. aeruginosa infection chronique 10,11.

<table><tbody><tr><td>Bacto Tryptic Bouillon de soja</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulé</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale lourde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de s-(+)-kétamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml 25 G 5/8 po&nbsp ; 0,5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter 22 G 0,9 mm x 25 mm</td><td>Pince Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe - Pointes de 0,5 mm Outils de</td><td>sciences fines</td><td>incurvés 11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux, iris, 11 cm, droits</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Pinces de suture</td><td>Outils de sciences fines</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker Chambre jetable</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk solution</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus lames de microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Kit de coloration Romanowsky Medion</td><td>Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’hexadécyltriméthylammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>Plaque EIA/RIA 96 puits</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tétraméthylbenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10 % Neutre formol tamponné</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris hématoxyline non Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin plus solution alcoolique</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Incubateur à agitation</td><td>Amerex Instruments Steady</td><td>Shake 757</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance de précision</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant à faible coût</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Sonde d’homogénéisation</td><td>Ystral</td><td>2366925(petite)</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique inversé</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>Caméra (microscope)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

chronique à long terme<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; infection des voies respiratoires chez les souris

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Un modèle de souris de l&#39;infection chronique des voies respiratoires est un atout majeur dans la fibrose kystique (FK) la recherche, mais il ya un certain nombre de préoccupations concernant le modèle lui-même. Les premières phases de l&#39;inflammation et de l&#39;infection ont été largement étudiés en utilisant le modèle d&#39;agar-perles souris Pseudomonas aeruginosa, tandis que peu de rapports ont mis l&#39;accent sur ​​l&#39;infection chronique à long terme in vivo. Le principal défi pour l&#39;infection chronique à long terme reste la faible charge bactérienne par P. aeruginosa et le faible pourcentage de semaines de souris infectées après l&#39;épreuve, ce qui indique que les cellules bactériennes sont progressivement effacés par l&#39;hôte. Cet article présente une méthode pour obtenir une infection chronique efficace à long terme chez la souris. Cette méthode est basée sur l&#39;incorporation de la P. souches cliniques aeruginosa dans l&#39;agar-perles in vitro, suivie par instillation intratrachéale chez les souris C57Bl/6NCrl. Infection pulmonaire bilatérale est associée à plusieurs mesurables lecture-out, y compris la perte de poids, la mortalité, l&#39;infection chronique, et la réponse inflammatoire. Le P. souche clinique aeruginosa RP73 a été préférée à la souche de laboratoire de référence de PAO1 car elle a entraîné une mortalité relativement bas, des lésions plus sévères, et l&#39;infection chronique plus élevé. P. aeruginosa colonisation peut persister dans le poumon pendant plus de trois mois. Pathologie pulmonaire murin ressemble à celle de patients atteints de mucoviscidose avec une maladie pulmonaire chronique avancée. Ce modèle murin imite plus étroitement le cours de la maladie chez l&#39;homme et peut être utilisé à la fois pour des études sur la pathogenèse et pour l&#39;évaluation de nouvelles thérapies.

Lorsque le protocole est fait correctement, le P. aeruginosa agar-perles mesurent entre 100-200 um et peuvent être observés avec un microscope optique inversé par aspiration un petit volume de la suspension d&#39;agar-perles sur une diapositive. Des cellules bactériennes individuelles peuvent être consultées dans les perles d&#39;agar-agar, comme représenté en détail sur la figure 1. Le choix de P. aeruginosa souche utilisée dans la préparation d&#39;agar-b...

Nous décrivons la méthode agar-perles d&#39;établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

L'objectif général de cette procédure est d'établir une infection chronique persistante à long terme des voies respiratoires par Pseudomonas aeruginosa chez la souris. Cela est réalisé en cultivant d'abord la souche bactérienne sélectionnée de Pseudomonas aeruginosa. La deuxième étape consiste à incorporer les bactéries dans de petites billes d'agar en mélangeant les bactéries avec de l'agar et de l'huile minérale à 50 degrés Celsius, puis en refroidissant le mélange à quatre degrés Celsius sous agitation lente et continue.Ensuite, l'huile minérale est éliminée par plusieurs lavages avec du PBS, et un aliquot des billes d'agar est homogénéisé et ensemencé sur des boîtes de gélose. Pour déterminer la teneur bactérienne, la dernière étape consiste à injecter quelques microlitres de la suspension de billes d'agar dans la trachée de souris afin d'induire une infection pulmonaire chronique à Pseudomonas aeruginosa. Finalement, le liquide de lavage broncho-alvéolaire et les poumons peuvent être récupérés à différents moments après le défi et ensemencés sur des boîtes de gélose afin de détecter le pourcentage de souris chroniquement infectées et la charge bactérienne dans les voies respiratoires des souris survivantes. Le principal avantage de ces méthodes utilisant des billes d'agar par rapport aux méthodes existantes est qu'elles permettent une infection chronique stable à long terme chez un pourcentage élevé de souris, entraînant une persistance d'une charge bactérienne stable jusqu'à un mois.Les méthodes AGA créent dans le poumon de la souris un environnement microaérobie permettant aux bactéries de croître sous forme de microcolonies. De façon similaire à la croissance dans le mucus des patients atteints de mucoviscidose, ces méthodes peuvent aider les chercheurs à répondre à des questions essentielles concernant la pathogenèse de la mucoviscidose et d'autres maladies respiratoires, ainsi qu'à tester de nouvelles thérapies contre les infections pulmonaires chroniques à Pseudomonas aeruginosa. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour induire une infection chronique par d'autres pathogènes, y compris Burkholderia dolosa ou Staphylococcus aureus. Des co-infections avec différents pathogènes ou des expériences de compétition sont également possibles. La démonstration de la procédure sera effectuée par Pheno, postdoctorante, et Camil Riva, doctorante dans mon laboratoire. Trois jours avant l'infection des souris, ensemencer une boucle pleine de Pseudomonas aeruginosa à partir de la souche congelée à −80 °C sur une boîte de gélose au tryptone-soja, puis incuber à 37 °C pendant la nuit.Le lendemain, prélevez une colonie unique inoculée dans cinq millilitres de bouillon tryptone soja et incubée à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans un incubateur agité à 200 tr/min. Le lendemain matin, diluez un petit aliquot de la culture bactérienne de nuit dans du tampon phosphate salin à raison de un à 50. Mesurez ensuite la densité optique à 600 nanomètres.Ensuite, diluez la culture bactérienne de nuit en ajoutant deux OD de la suspension bactérienne dans un nouveau tube contenant 20 millilitres de TSB frais incubé à 37 degrés Celsius pendant environ trois à quatre heures en phase logarithmique dans un incubateur agité à 200 tr/min jusqu'à l'obtention d'un total de 10 à 50 OD. Une fois que Pseudomonas aeruginosa a atteint la phase logarithmique, récupérez les cellules bactériennes par centrifugation à 2 700 × g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Après cela.Resuspendez le culot bactérien dans un millilitre de PBS stérile et vortexez soigneusement pour le resuspendre complètement. Ensuite, mélangez un millilitre de la suspension bactérienne avec neuf millilitres de TSA liquide prééquilibré à 50 degrés Celsius. Ajoutez ce mélange à l'huile minérale lourde préchauffée à 50 degrés Celsius.Agiter immédiatement pendant six minutes à température ambiante. L'agitation doit produire un vortex visible dans l'huile. Refroidir ensuite le mélange à quatre degrés Celsius, en agitant à la vitesse minimale pendant 35 minutes.Ensuite, laisser reposer sur glace pendant 20 minutes supplémentaires. Par la suite, transférer les billes d'agar dans des tubes Falcon de 50 millilitres et centrifuger à 2 700 × g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Retirez soigneusement l'huile minérale et lavez le culot de billes d'agar avec du PBS stérile. Répétez la procédure six fois après trois lavages. Les billes peuvent être centrifugées par gravité au lieu d'utiliser la centrifugeuse après le dernier lavage.Ressuspendre les billes d'agar dans 20 à 30 millilitres de PBS de manière aseptique et homogénéiser 0,5 millilitre des billes. Ensuite, diluer 100 microlitres des billes homogénéisées dans 900 microlitres de PBS stérile, puis effectuer six dilutions sérielles jusqu'à 10 à la puissance moins six selon un rapport de un pour dix.Ensuite, réaliser une série de dilutions sur les boîtes de TSA, y compris l'échantillon non dilué. Diluer l'échantillon jusqu'à 10 à la puissance moins six et incuber les boîtes à 37 degrés Celsius. Mesurer le diamètre des billes à l'aide d'un microscope optique inversé sur plusieurs champs.Le diamètre des billes doit être compris entre 100 et 200 micromètres avant le défi chez les souris. Compter le nombre d'unités formant des colonies sur les boîtes de gélose TSA afin de déterminer le nombre d'UFC par millilitre dans la suspension de billes d'agar. Ensuite, ajuster le volume des billes d'agar à deux à quatre fois 10 à la puissance sept UFC par millilitre pour obtenir un inoculum optimal de un à deux fois 10 à la puissance six dans 50 microlitres.Placer une souris mâle âgée de six à huit semaines, préalablement anesthésiée avec de la kétamine et de la xylazine, en position dorsale sur un tapis chauffant, puis désinfecter son pelage avec de l'éthanol à 70 %. Exposer la trachée par une incision cutanée verticale. Ensuite, utiliser une pince pour séparer les muscles recouvrant la trachée.Ensuite, prélevez jusqu'à 50 microlitres de suspension de billes d'agar à l'aide d'une seringue d'un millilitre. Puis, intubez la trachée avec un cathéter et fixez la seringue d'un millilitre contenant la suspension de billes d'agar au cathéter. Appuyez doucement sur le piston de la seringue pour permettre l'implantation des billes dans le poumon.Ensuite, fermer l'incision à l'aide de clips de suture. Dans cette étape, placer la souris euthanasiée en position supine et désinfecter son pelage avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, exposer la trachée et la cage thoracique par une incision cutanée verticale. Puis, exposer les poumons en coupant le diaphragme. Insérer un fil de suture sous la trachée à l’aide de pinces et intuber la trachée avec un cathéter.Ensuite, tirez sur les deux extrémités du fil de suture pour fixer le cathéter à la trachée, et non le fil autour de la trachée. Prélevez maintenant un millilitre de milieu de culture cellulaire à l’aide d’une seringue d’un millilitre et fixez-la au cathéter. Enfoncez le piston de la seringue pour laver les poumons, récupérez immédiatement le liquide et stockez-le dans un tube de 15 millilitres.Répétez cette étape trois fois avec un volume total de trois millilitres de milieu, puis conservez le liquide de lavage bronchoalvéolaire sur de la glace en vue de la collecte et de l'analyse des poumons. Prélève les poumons de la souris. Rince-les dans du PBS stérile.Ensuite, séparez les lobes. Placez-les dans un tube à fond rond contenant deux millilitres de PBS stérile et conservez sur de la glace. Homogénéisez aseptiquement les poumons de manière successive.Diluez l'homogénat dans du PBS selon un rapport de un à dix. Ensuite, effectuez des dilutions sérielles, y compris l'échantillon non dilué, sur des boîtes de gélose TSA et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Prélevez le liquide de lavage broncho-alvéolaire sur la glace et diluez-le avec la solution de Turk selon un rapport de un à deux sous un microscope optique inversé.Compter le nombre total de cellules dans une chambre de numération de Burker pour la numération différentielle. Centrifuger le liquide de lavage broncho-alvéolaire à 330 ×g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre le culot à une concentration d'un million de cellules par millilitre dans un milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Placer les lames de microscope et les filtres dans les fentes appropriées du cytocentrifugeur, les filtres en carton étant orientés vers le centre.Introduisez 150 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés du cytosine et effectuez une centrifugation cyto à 300 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, un dépôt de cellules doit être observé ; après coloration, un décompte différentiel peut être réalisé au microscope. Cette figure montre l'évolution temporelle de l'infection chronique par Pseudomonas aeruginosa avec la souche de référence PA O1 et RP 73.Souche clinique pour chaque point temporel. Les histogrammes représentent le pourcentage de mortalité induite par la bactériémie en rouge et de survie en gris, ou le pourcentage d'animaux ayant éliminé l'infection en blanc, et ceux capables d'établir une infection chronique en vert. La souche clinique *Pseudomonas aeruginosa* RP73 est plus efficace pour établir une infection chronique comparée à la souche de laboratoire PAO1.Les souris survivantes ont été euthanasiées aux moments indiqués et les poumons ont été prélevés, homogénéisés et cultivés sur des boîtes de TSA afin de déterminer la charge bactérienne. Les courbes de croissance des souches P oh one et RP 73 dans les poumons de souris montrent que la quantité de bactéries trois jours après l'infection est plus élevée pour P oh one par rapport à RP 73. Ensuite, à partir du septième jour, lorsque l'infection chronique est établie, la charge bactérienne se stabilise entre 10⁴ et 10⁵ UFC par poumon pour les deux souches. Après sept jours d'infection chronique avec la souche clinique RP 73, le recrutement des cellules inflammatoires dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire a été évalué.Le nombre de leucocytes totaux est considérablement plus élevé chez les souris infectées par RP 73 par rapport aux souris non infectées. Les cellules les plus représentées sont les neutrophiles, indiquant une réponse importante du système immunitaire inné à l'infection chronique. Dans la case ci-dessous, des flèches indiquent des neutrophiles et un macrophage tels qu'observés sur une goutte déposée sur une lame après cyto-centrifugation.On observe ici une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine sur des coupes histologiques de poumons de souris après sept jours d'infection chronique avec des billes de la souche clinique rp. 73. Des billes indiquées par des flèches peuvent être observées dans la lumière bronchique ainsi que de microcolonies de cellules bactériennes. Dans les zones infectées, les bronches et le parenchyme pulmonaire se caractérisent par un recrutement massif de cellules inflammatoires.Alors que les voies respiratoires d'une souris non infectée étaient dépourvues de cellules inflammatoires, le diamètre et la concentration finale des BES sont des détails très importants. Pour obtenir un bon résultat, il est essentiel de garder à l'esprit que la taille est influencée par la vitesse de rotation pendant la phase de refroidissement, et que la quantité initiale de bactéries peut affecter la dilution finale des billes. En outre, le choix d'une souche appropriée de pseudomonas, provoquant une faible mortalité chez les souris et un pourcentage élevé d'infection chronique, permettra de minimiser le nombre de souris utilisées.Après l'infection des souris, un décompte bactérien est effectué. En outre, une analyse de la réponse inflammatoire peut être réalisée, incluant le décompte total et différentiel des cellules, le dosage viral dans le liquide bronchique, l'analyse des cytokines, le dosage de la myéloperoxydase et une analyse histologique, afin d'étudier la réponse à l'infection bactérienne. N'oubliez pas que le travail avec des pathogènes opportunistes comme Pseudomonas exige toujours des précautions, telles que le port de gants, la manipulation des bactéries sous hotte de sécurité biologique et l'utilisation de techniques stériles.Le développement de modèles animaux appropriés a permis la mise à l'essai préclinique de nouvelles molécules antibactériennes et anti-inflammatoires. Cette étape est cruciale pour les futures interventions thérapeutiques contre les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique ou d'autres maladies respiratoires.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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