Name: Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des cellules endothéliales du cerveau antérieur embryonnaire pour étudier l'angiogenèse cérébrale. Cette méthode par séparation magnétique CD31 permet d'obtenir des cultures pures pour analyser les interactions neurovasculaires.

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Ce travail a été soutenu par une Alliance nationale pour la recherche sur la schizophrénie et la dépression (NARSAD) Prix du jeune chercheur et les Instituts nationaux de la Santé accorder R01NS073635 AV.

Une. Préparation des réactifs et solutions <ol><li> Revêtement de 35 mm boîte de culture: Le collagène de type 1 est fournie comme solution une solution aqueuse à 20 mM d&#39;acide acétique (~ 100 mg de protéine / fiole). Diluer un volume approprié de solution de collagène à une concentration de travail de 0,01% en utilisant une culture tissulaire stérile eau de qualité. plats Manteau avec 1 ml de solution de collagène pour 3-4 heures à température ambiante (RT) ou 37 ° C, ou une nuit à 2-8 ° C. Enlever l&#39;excédent de la boîte enduit et laisser sécher pendant la nuit. Rincer le plat avec de l&#39;eau de qualité de culture de tissus ou de PBS avant d&#39;ajouter les médias. Boîtes revêtues peuvent être stockés à 4 ° C pendant un mois. </li><li> Préparer milieu Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM). Compléter le DMEM (500 ml) avec 10% de FBS et de solution antibiotique-antimycotique (concentration de 1x; une ml/100 ml). DMEM complet peut être stocké à 4 ° C pendant deux mois. </li><li> Préparer une partie aliquote (50 ml) de DMEM avec de la DNase I (0,001 mg / ml), (dénommé DMEM-DNase I). </li><li> Préparer une autre partie aliquote (10 ml) de DMEM avec de la collagénase et de la dispase (1 mg / ml) (dénommé DMEM-collagenase/dispase). </li><li> Préparer des cellules endothéliales milieu de culture (ECCM, 500 ml), supplémenté avec de l&#39;EGF (5 ng), ECGS (100 mg) et 5 ul de solution d&#39;antibiotique-antimycotique. ECCM peut être stocké à 4 ° C pendant deux mois. </li><li> Préchauffer tous les médias avant de l&#39;utiliser. </li><li> Préparer le tampon de purification: PBS, pH 7,2 avec 0,5% de BSA et 2 mM d&#39;EDTA. Gardez tampon froid (2-8 ° C). </li></ol> 2. Suppression des embryons et dissection de Télencéphale Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire sont approuvés par les soins des animaux et de l&#39;utilisation des comités de l&#39;hôpital McLean et sont conformes aux directives du NIH pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. <ol><li> Utilisez la souris CD1 enceintes chronométrés (jour embryonnaire 15). Le jour de la découverte du bouchon vaginal est considéré comme jour embryonnaire 0 (E0). CD1 barrages produisent généralement de grandes portées, de sorte 10-12 embryons sont attendus à partir d&#39;un barrage enceinte. </li><li> Pour hystérotomie, anesthésier les souris enceintes avec une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg). Pour les souris d&#39;environ 20-30 g, livrer 0,3 ml d&#39;une solution anesthésique 10 ml / kg de kétamine / xylazine et veiller à ce que la douleur et la détresse est minime lors des injections intra-péritonéales de l&#39;anesthésie. Faire preuve de retenue à la main pour les injections. </li><li> Vérifiez anesthésie profonde par pincement de l&#39;orteil. Retirer des embryons de souris profondément anesthésiés. Décapiter chaque embryon immédiatement après son retrait de la mère. Placez les têtes embryonnaires dans des plats de Pétri dans glacée PBS. </li><li> Suivez l&#39;hystérectomie par euthanasie immédiate avec surdose d&#39;un anesthésique (130 mg / kg de pentobarbital, ip), une méthode d&#39;euthanasie, qui est conforme aux lignes directrices de l&#39;AVMA sur l&#39;euthanasie des animaux: 2013 Edition. </li><li> Sous un microscope stéréo, retirez le cerveau de la tête avec des ciseaux à micropointes fines et une pince fine. Remarque: Une dissection de haute qualitéion est indispensable pour réussir à éliminer la membrane pial du cerveau embryonnaire. Ceci est réalisé en pratique. Une pince fine et ciseaux à micropointes sont également des outils essentiels pour obtenir un bon dissection. </li><li> Utilisez la pince pour obtenir une prise ferme sur le cerveau et les ciseaux à micropointes à décoller la membrane pial. Retirez le mésencéphale et métencéphale et isoler le télencéphale. Transfert télencéphale pial-libre de tous les embryons à une boîte de culture de 35 mm avec 2 ml de PBS dans la glace. </li></ol> 3. Cellule d&#39;isolement <ol><li> Hacher le télencéphale en fragments de 1 à 2 mm avec une lame de scalpel et recueillir le tissu dans un tube Falcon de 15 ml contenant 2 ml de DMEM complet. </li><li> Dissocier le tissu doucement mais à fond avec une pipette de 1 ml jusqu&#39;à touffes disparaissent et une suspension laiteuse est atteint. </li><li> Centrifugeuse dissocié les cellules à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirez délicatement le surnageant et remettre le culot dans du DMEM-DNase I. doucement dissocier la CElls nouveau en utilisant pipette de 1 ml et centrifuger à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Reprendre le culot dans du DMEM chaud complet. cellules de filtrer à travers un maillage de 70 um Nylon stérile. Recueillir des cellules filtrées et garder dans la glace. </li><li> Recueillir les cellules-parties retenues sur le maillage et digérer plus loin avec DMEM-collagenase/dispase (2 ml) pendant 1-2 min à température ambiante. Laver les cellules 3 fois dans du milieu DMEM-DNase I par centrifugation à 800-1000 g pendant 5 min à température ambiante. Commun de ces cellules avec les cellules filtrées recueillies à l&#39;étape 3.5. Laver les cellules une fois avec le total DMEM complet. Passez à déterminer le nombre de cellules et des mesures d&#39;étiquetage magnétiques. Remarque: Il est important pour obtenir une suspension à cellule unique avant le marquage magnétique. </li></ol> 4. Étiquetage magnétique <ol><li> Ce protocole indique le marquage magnétique de 10 7 cellules. Pour le nombre de cellules inférieur à 10 7, utilisent le même volume de réactif et pour le nombre de cellules de plus de 10 7, à l&#39;échelle de tous les volumes de réactifs et le total des volumesen conséquence (par exemple pour 2 x 10 7 cellules totales, utiliser deux fois le volume de tous les réactifs indiqués). Conservez tous les réactifs et les cellules dans la glace. </li><li> Déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Centrifugeuse suspension de cellules à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Ajouter μl/10 90 7 cellules de tampon de purification pour le culot de cellules, suivie par 10 ul de microbilles CD31. Les microbilles fournies par le fabricant sont conjugués à l&#39;anticorps monoclonal anti-CD31 de souris. </li><li> Bien mélanger et incuber pendant 15 min au réfrigérateur. Remarque: Des températures plus élevées et / ou un plus long temps d&#39;incubation pendant marquage magnétique peut entraîner la liaison non spécifique. </li><li> Laver les cellules par addition de 2.1 ml/10 7 cellules de tampon de purification et centrifuger à 300 g pendant 10 min. Enlever les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de tampon de purification. Procéder à une séparation magnétique ou étape de purification. </li></ol> 5. Purification <ol><li> Placez MS colonne dans le champ magnétique de MACS Separator. </li><li> Rincer la colonne avec 500 ul de tampon de purification. </li><li> Appliquer une suspension de cellules dans la colonne. Chargez nombre approprié de cellules de MS colonne le nombre de cellules plus élevée peut obstruer la colonne. Attention: Chaque colonne MS peut accueillir un maximum de 2 x 10 7 cellules, pour un nombre de cellules plus élevée, utiliser plusieurs colonnes. </li><li> Recueillir et jetez accréditives contenant des cellules non marquées. </li><li> Laver la colonne avec 500 ul de tampon de purification trois fois. Au cours des étapes de lavage, assurez-vous que le réservoir de la colonne est vide avant addition de quantités de tampons de purification ultérieures. </li><li> Supprimer colonne du séparateur MACS et le placer sur un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Un plongeur est fourni avec la colonne MS. Pipette 1 ml de tampon de purification sur la colonne MS et rincer immédiatement les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne. </li><li> Plaque cells sur une boîte de culture de 35 mm pré-revêtu avec du collagène de type 1 et cultiver des cellules dans CCME dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 95% d&#39;O 2 et 5% de CO 2. </li><li> Changer le milieu tous les quatre jours. Utilisez PVECs pour des expériences ou sous-culture après 10-12 jours lorsque le plat est confluent. </li></ol> 6. Subculture de PV ECS <ol><li> Retirez le CCME et rincer la monocouche de PVECS avec 1-2 ml de PBS stérile. </li><li> Ajouter lentement 1,5 ml de solution à 0,25% de trypsine-EDTA pour couvrir la monocouche cellulaire. </li><li> Remettre le plat dans l&#39;incubateur. Dans 5-7 min, les cellules se détacher de la surface de la boîte. </li><li> Après que les cellules ont détaché, ajouter immédiatement un volume égal d&#39;inhibiteur de la trypsine et on triture plusieurs fois. </li><li> Transférer les cellules dans un tube de 15 ml de Falcon stérile. Centrifuger le tube à 500 g pendant 5 min. </li><li> Enlever le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de préchauffé CCME. </li><li> Ensemencer les cellules d&#39;expansion de la culture, imvieillissement ou d&#39;autres dosages. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
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<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pvec de sont physiologiquement plus pertinent que les cellules endothéliales cérébrales adultes et EC provenant d&#39;autres sources de tissus pour des études portant sur les interactions neurovasculaires et avoir un potentiel thérapeutique aussi. Pour la préparation PVEC, il est essentiel début à la dissection de travailler rapidement pour obtenir une bonne viabilité puisque les cellules mortes peuvent se lier de manière non spécifique à microbilles CD31. En outre, si la suspension à cellule unique n&#39;est pas attein...

L&#39;angiogenèse, la neurogenèse et la migration neuronale sont des événements critiques dans le système nerveux central (SNC) le développement, la réparation et la régénération. Plusieurs études ont montré que les élégantes cellules endothéliales stimulent la prolifération neuronale et vice-versa grâce à la libération de facteurs solubles et par contact direct. Nous avons trouvé curieux que dans la majorité de ces études 1-3, tandis que progéniteurs neuronaux / cellules souches neurales sont isolées du cerveau embryonnaire, ils sont co-cultivées avec des cellules endothéliales de cerveau de l&#39;adulte, d&#39;autres sources de tissu adulte, ou avec des lignées de cellules endothéliales. Cela peut être dû à des difficultés techniques associées à l&#39;isolement et la mise en culture des populations pures de cellules endothéliales de cerveau embryonnaire en partie. Cependant, l&#39;angiogenèse, la neurogenèse, la migration neuronale et sont des événements simultanés qui se produisent dans des ordres de grandeur plus robuste dans le cerveau embryonnaire que dans le cerveau d&#39;un adulte normal. Le réseau vasculaire périventriculaire du embryonic cerveau antérieur (télencéphale) provient d&#39;un navire situé dans le ganglion basal ébauche et se développe sous la forme d&#39;un gradient ordonnée de ventral à dorsal télencéphale par jour embryonnaire 11 (E11) 4,5. Ce plexus de vaisseaux du réseau vasculaire périventriculaire se distinguent des vaisseaux pie-mère basée sur les origines, la localisation anatomique, les modèles de croissance, et la régulation du développement 4,5. La direction de propagation du gradient de l&#39;angiogenèse périventriculaire correspond à la pente transversale neurogenetic télencéphalique. Au sein du télencéphale, le gradient de l&#39;angiogenèse périventriculaire et le gradient de migration des neurones GABA chevauchent tangentiellement dans l&#39;espace ainsi 6. En ce qui concerne la synchronisation, le gradient de l&#39;angiogenèse est l&#39;avance de la pente et de GABA neurone neurogenetic gradient d&#39;environ un jour. Ainsi, les cellules endothéliales périventriculaires sont spatialement et temporellement bien placés pour fournir des indices essentiels pour soutenir la neurogenèse et télencéphaliqueneuronale 4,6 de migration. Par conséquent, l&#39;utilisation des cellules endothéliales périventriculaires embryonnaires dans des expériences de co-culture avec des progéniteurs et / ou des neurones neurones fournirait un modèle plus favorable pour l&#39;étude des interactions neurovasculaires et le développement de nouvelles voies pour le traitement de maladies neurodégénératives ou une lésion cérébrale ischémique / traumatique. Nous insistons sur l&#39;importance d&#39;éliminer la membrane pial, non seulement pour limiter la contamination des cellules épithéliales, mais aussi pour séparer les cellules endothéliales pie-mère qui sont moléculairement et fonctionnellement distincte de cellules endothéliales du réseau vasculaire périventriculaire 4,6 (de PVECs appelés à distinguer de la pie-mère EC) . Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire pour obtenir un rendement riche et pur de PVECs. Ces cellules endothéliales sont préparés à partir forebrains embryonnaires isolées à partir d&#39;un simple clic de souris chronométrée enceinte. Ils peuvent être complétés, en sous-culture, et on les congèle avec succès vers le bas pour une utilisation future.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Collagène, solution de type 1 de queue de rat&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Produits biologiques de qualité</td> <td>DPBS</td><td>114057-131</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>² ;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>MS column</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microbilles CD31</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Séparateur MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stand multiple MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Crépine à cellules 70 &micro ; m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution antibiotique et antimycosique</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>²�</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>² ;</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plat de culture 35 mm</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tube Falcon de 15 ml&nbsp ;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube Falcon</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit ECCM</td><td>Le kit 355054 BD Bioscience</td><td></td><td>comprend un supplément de croissance des cellules endothéliales, un EGF et un supplément</td></tr> de <tr><td>croissance des cellules endothéliales (ECGS)</td> inhibiteur de la trypsine de sojaBD <td>Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Applications des cellules</td> <td>RBECGM</td><td>R819-500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM F12° ;</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Eau de culture tissulaire Life</td><td>Technologies</td><td>15230162</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine Life</td><td>Technologies</td><td>15050</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de soja</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Kit d’étiquetage cellulaire</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Membrane plasmique CellLight-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps biotinylé contre l’isolectine B4</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Facteur anti-Von Willebrand</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Supports de montage VECTASHIELD Hardset avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Butler Schein Approvisionnement en santé animale</td><td>44028</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Roboz Instrument chirurgical</td><td>7 inox</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux fins à micro-pointes</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS5611</td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Cellules endothéliales du cerveau embryonnaires peuvent servir comme un outil important dans l&#39;étude de l&#39;angiogenèse et le développement neuro-vasculaire et les interactions. Les deux réseaux vasculaires du cerveau antérieur embryonnaire, la pie-mère et périventriculaire, sont distinctes dans l&#39;espace et avoir des origines différentes et des modèles de croissance. Les cellules endotheliales à partir des réseaux vasculaires et la pie-mère périventriculaires ont des profils uniques d&#39;expression génique et les fonctions. Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l&#39;isolement, la culture, et la vérification des populations pures de cellules endothéliales à partir du réseau vasculaire périventriculaire (PVECs) du cerveau antérieur embryonnaire (télencéphale). Dans cette approche, le télencéphale dépourvue de membrane pial obtenu à partir de 15 jours embryonnaires de souris est hachée, une digestion avec de la collagénase / dispase, et on disperse mécaniquement dans une suspension cellulaire unique. PVECs sont purifiés à partir de la suspension cellulaire en utilisant une sélection positive avec l&#39;anticorps conjugué à anti-CD-31/PECAM-1 microbilles en utilisant une forte magnétiqueProcédé de séparation. Des cellules purifiées sont cultivées sur collagène 1 boîtes de culture revêtues dans endothéliale milieu de culture de cellules jusqu&#39;à confluence, et en outre en subculture. PVECs obtenu avec ce protocole exposition pavé et en forme de fuseau phénotypes, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase et microscopie de fluorescence. Pureté des cultures Pvec a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales. Dans nos mains, cette méthode fiable et cohérente donne des populations pures de PVECs. Ce protocole bénéficiera des études visant à obtenir un aperçu mécanistes dans le cerveau antérieur angiogenèse, la compréhension des interactions de Pvec et croisées des entretiens avec les types de cellules neuronales et détient un énorme potentiel pour l&#39;angiogenèse thérapeutique.

La caractérisation phénotypique des PVECs du jour 1-12 est représenté par microscopie optique à contraste de phase (Figure 2). Les cellules fixées à l&#39;antenne le jour 1 montrent une morphologie caractéristique de la division cellulaire (figure 2A). Entre 5-8 jours, PVECs transition de galets de pierre à la broche en forme de morphologie typique des cellules endothéliales et plus proche de son état ​​in vivo (figures 2B et 2C). Par jour 12 d...

Cette vidéo montre une stratégie simple et fiable pour la préparation de cultures pures de cellules endothéliales de cerveau antérieur embryonnaire dans les 10-12 jours et sera utile pour la recherche axée sur de nombreux aspects de l&#39;angiogenèse cérébrale.

Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des cultures pures de cellules endothéliales à partir de quatre cerveaux embryonnaires afin d'étudier l'angiogenèse cérébrale et les interactions neurovasculaires. Cela est réalisé en commençant par retirer la membrane pelliculaire et en isolant le céphalon à partir des cerveaux embryonnaires. La deuxième étape de la procédure consiste à produire une suspension monocellulaire en utilisant la dissociation, la filtration et la digestion du tissu récolté.La troisième étape consiste à marquer magnétiquement les cellules à l'aide de microbilles CD 31. Les dernières étapes sont la purification des cellules marquées CD 31 par séparation magnétique, puis leur culture. En fin de compte, des populations pures de cellules endothéliales para-ventriculaires sont obtenues pour des études ultérieures par microscopie de fluorescence immunohistochimique et par des tests d'angiogenèse.Cette méthode bénéficiera aux études portant sur les mécanismes cellulaires et moléculaires. Pour les anis cérébraux, elle peut servir d'outil pour élucider les interactions entre les cellules endothéliales préventriculaires et les types cellulaires neuronaux, ainsi que leurs échanges. Elle présente également un potentiel considérable pour la mission thérapeutique des anis.La démonstration de cette méthode est essentielle pour éliminer certaines des difficultés techniques associées à l'isolement et à la culture de populations pures de cellules endothéliales à partir d'embryons cérébraux. Pour ce protocole, placez les têtes de souriceaux E15 provenant de souris CD1 sous un stéréomicroscope dans du PBS glacé. Retirez les cerveaux à l’aide de ciseaux à micro-pointe fins et de pinces délicates.Une bonne dissection est essentielle et s'acquiert avec la pratique ainsi qu'avec des outils en excellent état. Ensuite, utilisez la pince pour bien saisir le cerveau et les ciseaux à micro-pointe pour détacher la membrane périmysique. Cette étape est la plus difficile de la procédure, mais les compétences nécessaires s'acquièrent avec la pratique.Ensuite, retirer le mésencéphale et le métacéphale. Isoler le céphalosome. Puis, le transférer, exempt de membrane pelliculaire, dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant deux millilitres de PBS sur glace.Collectez toutes les griffes dans un même plat. Commencez par hacher les griffes en fragments d'un ou deux millimètres à l'aide d'une lame de scalpel. Recueillez le tissu dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de DMEM complet.Dissocier délicatement mais complètement le tissu par pipetage avec une pipette d'un millilitre jusqu'à disparition des agrégats et obtention d'une suspension laiteuse. Centrifuger la suspension à 800 à 1000 G pendant cinq minutes. À température ambiante, retirer soigneusement le surnageant par aspiration et resuspendre.Suspendez le palais dans le DMEM avec DS un. Dissociez ensuite à nouveau les cellules en utilisant une agitation douce et répétez l'étape de centrifugation. Resuspendez alors le culot dans du DMEM complet préchauffé.Filtrer les cellules en suspension à travers un tamis en nylon de 70 microns et recueillir les fractions cellulaires retenues sur le tamis. Poursuivre la digestion dans deux millilitres de DMEM contenant du collagénase et du dis bays. Attendre quelques minutes, puis laver le tissu. Procéder à trois centrifugations et resuspendre le culot dans du DMEM avec DS un pool, puis combiner la fraction lavée avec le filtrat maintenu sur glace.Ensuite, lavez le mélange avec le DMEM complet en utilisant une centrifugation et une resuspension. Déterminez maintenant le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et procédez à l’étiquetage magnétique. Les volumes indiqués dans ce protocole conviennent pour un maximum de 10 millions de cellules. Pour des nombres de cellules plus élevés, augmentez simplement les volumes proportionnellement.Commencez par centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirez complètement le surnageant et ajoutez 90 microlitres de tampon de purification glacé au culot cellulaire, puis 10 microlitres de microbilles conjuguées à CD31. Mélangez bien les cellules à l’aide d’une pipette de 200 microlitres et incubez la suspension pendant 15 minutes au réfrigérateur, sans dépasser ce délai afin que le marquage reste spécifique. Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon de purification glacé et centrifugez à 300 G pendant 10 minutes.Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans 500 microlitres de tampon de purification glacé. Placer ensuite une colonne MS dans le champ magnétique du séparateur Max. Puis, rincer la colonne avec 500 microlitres de tampon de purification à température ambiante.Ensuite, appliquez la suspension cellulaire sur la colonne. Elle convient pour un maximum de 20 millions de cellules. Récupérez et jetez tout l'écoulement post-colonne, qui contient les cellules non marquées.Lavez la colonne avec 500 microlitres de tampon de purification trois fois. Veillez toujours à ce que le réservoir de la colonne soit vide avant d'ajouter les aliquots suivants de tampon de purification. Retirez maintenant la colonne du séparateur max et placez-la sur un tube de 15 millilitres.Ajouter un millilitre de tampon de purification sur la colonne et éliminer immédiatement les cellules marquées magnétiquement en enfonçant fermement le piston fourni dans la plaque de colonne. Déposer les cellules éliminées dans une boîte de culture de 35 millimètres pré-enduite de collagène de type I.Incubez maintenant les cellules avec le milieu ECCM à 37 degrés Celsius, sous une atmosphère de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Renouvelez le milieu tous les quatre jours. Observez quotidiennement les cellules en cours de croissance dans la boîte de culture au microscope.La caractérisation phénotypique des cellules endothéliales périventriculaires ou des CPVE évolue du premier au douzième jour, comme observé en microscopie optique en contraste de phase. Les cellules fixées au plat le premier jour présentent une morphologie caractéristique de division cellulaire entre le cinquième et le huitième jour. Les CPVE passent d'une morphologie en pavé à une morphologie allongée en fuseau, typique des cellules endothéliales et plus proche de leur état in vivo.Au jour 12, la culture de PVEC atteint une confluence complète. Le p vs peut être repiqué facilement pour agrandir la colonie après le repiquage.La pureté des cultures de cellules endothéliales a été déterminée à 100 % à l’aide des marqueurs suivants des cellules endothéliales : l’ISO-sélectine, le facteur de von Willebrand, le CD31, le PE-cam-1 et la VE-cadhérine. Des images en haute magnification de PVC préparées à partir d’embryons CD1 ainsi que d’embryons tie2-GFP, dont les cellules endothéliales exprimaient la GFP, ont été marquées à l’ISO-lectine. Elles ont révélé des morphologies courantes en pavé ou en fuseau, ainsi que des morphologies polygonales avec des prolongements fins observées dans certaines boîtes de culture revêtues de collagène. En l’absence de Matrigel, les PVC formaient des motifs en treillis rappelant la caractéristique unique du réseau vasculaire périventriculaire in vivo.Ceci reflète le fort potentiel angiogénique des PVE CS. Un essai d'angiogenèse a été réalisé dans lequel 20 000 PVE CS ont été ajoutés à des boîtes de culture revêtues de gel matriciel. Ces PVE CS ont montré une formation robuste de tubes dans les 18 heures.L'étude à long terme des CPV, y compris la migration, la motilité, la morphologie, les tests fonctionnels cellulaires, ainsi que les expériences in vivo, est possible en marquant les CPV isolées d'embryons CD1 à l'aide de nanocristaux Q dot. Ces nanocristaux délivrent une fluorescence intense et stable dans le cytoplasme des cellules vivantes.Les Pve EECS peuvent être transfectées avec des traceurs cellulaires tels que Cell Light Membrane Plasmique RFP MAR 2.0 afin de permettre une visualisation claire de la morphologie cellulaire lors d'expériences d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes. Les Pve CS ont été cultivées dans plusieurs milieux et la morphologie cellulaire a été comparée par microscopie de contraste de phase et par ISO-sélectine avant coloration.Bien que les CS PV cultivées dans le milieu ECCM présentent une morphologie en fuseau et soient confluentes au jour 12, les CS pve cultivées dans le milieu de croissance pour cellules endothéliales cérébrales de rat montrent une morphologie très allongée et atteignent la confluence au jour 20. En revanche, les CS PV cultivées dans le milieu D-M-E-M-F 12 présentent uniquement une morphologie plate et polygonale, sans formation de fuseau, une croissance très rapide et atteignent la confluence au jour quatre.Les PVEC ont été cultivées dans le MCEE pendant jusqu'à trois passages sans perte de phénotype ni de fonction. Par conséquent, le MCEE est le milieu privilégié pour la culture des PVEC. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.La co-culture de cellules endothéliales périventriculaires avec des précurseurs neuronaux stimule probablement bien davantage la neurogenèse et la migration neuronale que les cellules endothéliales provenant du cerveau adulte ou d'autres sources. Elles pourraient donc s'avérer précieuses pour favoriser le rétablissement de la fonction neurologique dans de nombreux contextes différents.

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