Génération de cisaillement d'adhésion Carte Utilisation SynVivo réseaux microvasculaires synthétique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une carte de l'adhérence au cisaillement des particules cellulaires à partir d'une seule expérience utilisant des réseaux microvasculaires synthétiques. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant le dispositif microfluidique de la protéine d'intérêt, dans ce cas l'avadon. Dans un deuxième temps, des particules biotinylées sont injectées dans le dispositif à des débits de cisaillement physiologiques, qui se lient au dispositif revêtu d'avadon selon des schémas différents en fonction des taux de cisaillement locaux.

Ensuite, le nombre de particules liées est décompté afin de générer une carte d'adhérence au cisaillement des particules à l'aide d'une base de données créée par calcul des valeurs de taux de cisaillement dans le réseau. Les résultats montrent qu'une carte d'adhérence au cisaillement peut être obtenue à partir d'une seule expérience, ce qui permet des économies significatives de temps et de réactifs par rapport aux chambres à écoulement à plaques parallèles conventionnelles. Le principal avantage de cette technologie par rapport aux méthodes existantes, telles que les canaux d'écoulement linéaires, est que nous pouvons générer des cartes d'adhérence à partir d'une seule expérience, ce qui entraîne une réduction importante des coûts et du temps.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la vectorisation des médicaments, notamment concernant la capacité des vecteurs de délivrance à se lier aux cibles souhaitées. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous utilisions des chambres d'écoulement à plaque mobile pour étudier des lésions cellulaires particulières. Toutefois, dans des conditions fluides, l'objectif de ce test est de fournir des connaissances fondamentales sur l'adhésion des particules et des cellules.

La plateforme syn vivo peut être appliquée à divers autres systèmes, tels que la délivrance dans le cancer et le système nerveux central, l'infection et l'inflammation, la thrombose et le dysfonctionnement de la microcirculation. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes impliquant le dispositif microfluidique sont difficiles à apprendre, l'habitude des petits volumes d'échantillon s'acquiert progressivement, et les meilleures pratiques pour éviter la formation de bulles sont mieux transmises par voie visuelle. La procédure sera démontrée par Ashley Smith, scientifique chercheuse de notre laboratoire.

Le dispositif microfluidique SynVivo SMN est composé de deux séries de ports parallèles, l'une destinée à l'écoulement d'agents de revêtement de surface, de groupements fonctionnels ou de cellules pour leur immobilisation, et l'autre pour la réalisation du test. Pour commencer, immergez complètement le dispositif dans une boîte de Pétri contenant de l'eau déionisée stérile et placez la boîte sous vide. Procédez au dessiccation en laissant le dessiccateur fonctionner jusqu'à ce que tout l'air soit éliminé des canaux du dispositif.

Cela devrait prendre environ 15 minutes avant de retirer l'appareil de l'eau. Utilisez une pince fine pour insérer un tube tigon prérempli d'eau dans chaque orifice de l'appareil. Le tube doit mesurer environ un pouce de long.

L'appareil peut désormais être retiré de l'eau à l'aide d'une pipette ou d'une seringue. Déposez une goutte d'eau autour de la base du tube d'un orifice d'entrée. Retirez soigneusement le tube.

La goutte d'eau empêchera l'air d'entrer dans l'appareil. Ensuite, préparez une seringue d'un millilitre chargée d'avadon à une concentration de 20 microgrammes par millilitre. Connectez la seringue à une aiguille en acier inoxydable de calibre 24 et de tubulure, puis serrez le port d'entrée non utilisé à l'aide d'une pince à mâchoire.

Insérez le tube dans le port d'entrée du dispositif. Injectez de l'avadon à un débit de un microlitre par minute pendant 10 minutes afin d'assurer une perfusion complète du dispositif. À la fin du temps d'écoulement.

Serrer tous les tubes avec des pinces et placer l'appareil à quatre degrés pendant la nuit. Laisser l'appareil atteindre la température ambiante. Ensuite, placer l'appareil sur un microscope à fluorescence inversé équipé d'une platine motorisée et d'une caméra haute performance.

Préparer une solution de particules biotinylées de deux microns à une concentration de 5 millions de particules par millilitre dans du tampon salin au phosphate ou PBS. Charger les particules dans une seringue d'un millilitre. Préparer une deuxième seringue d'un millilitre contenant du PBS.

Chargez uniquement chaque seringue sur une pompe à seringue, puis connectez-les à l'aiguille et au tube à l'aide d'une pipette seringue. Déposez une goutte d'eau autour de la base du tube du port d'entrée et retirez soigneusement le tube utilisé pour revêtir le dispositif. Insérez délicatement les tubes destinés aux particules biotinylées et au PBS dans chacun des ports d'entrée.

Ensuite, commencez à injecter les particules biotinylées à un débit de 2,5 microlitres par minute. Surveillez le port d'entrée au microscope dès les premiers signes de présence des particules. Démarrez le chronomètre et maintenez l'écoulement pendant trois minutes.

À la fin des trois minutes, arrêter l’écoulement des particules biotinylées tout en démarrant simultanément l’écoulement de PBS à un débit de 2,5 microlitres par minute. Laisser le PBS circuler dans le dispositif pendant trois minutes afin de laver les particules non liées. Pour commencer l’acquisition, utiliser la fonction de balayage d’image grand format dans le logiciel d’imagerie afin d’acquérir l’image complète du dispositif, puis numérotéer séquentiellement les bifurcations du dispositif et créer une zone d’intérêt circulaire dont le diamètre est deux fois supérieur à celui des canaux.

Dans ce cas, régler le diamètre de la zone d'intérêt à 200 microns, puisque le diamètre du canal est de 100 microns. Utiliser la fonction de comptage automatisé du logiciel d'imagerie pour exporter le nombre de particules dans chaque zone d'intérêt vers un tableur. De même, utiliser la fonction de comptage automatisé pour exporter le nombre de particules dans l'appareil entier.

Les simulations de dynamique des fluides computationnelle (CFD) sont exécutées et les résultats sont stockés dans une base de données pour une analyse ultérieure. Les informations incluses dans les résultats comprennent les taux de cisaillement pariétaux, le flux de particules en vitesse et l'adhérence au dispositif. Ces données servent à déterminer le nombre de particules adhérentes dans chaque zone d'intérêt, étant donné une concentration de particules en entrée définie.

Pour générer une carte d'adhérence au cisaillement, calculez le pourcentage d'adhérence comme indiqué dans le protocole textuel comme étape finale. Tracez la carte d'adhérence au cisaillement en utilisant la vitesse de cisaillement à chaque bifurcation des réseaux et les valeurs de pourcentage d'adhérence. Cette image montre un dispositif SMN syn vivo typique revêtu d'avidine après la liaison de particules biotinylées de deux microns.

Remarquez que les particules adhèrent préférentiellement près des bifurcations dans le réseau. Les bifurcations numérotées dans le réseau SMN syn vivo sont visibles ici. Cette image représente la carte de cisaillement pariétal échantillonnée générée par le modèle CFD du dispositif.

Le taux de cisaillement varie dans le dispositif, allant de 250 secondes inverses à 15 secondes inverses, comme observé dans la microvasculature in vivo. Notez que ces taux de cisaillement variables ne peuvent pas être obtenus simultanément dans des canaux microfluidiques linéaires, car ceux-ci fournissent un taux de cisaillement constant pour chaque débit. Le graphique présenté ici, montrant les valeurs du taux de cisaillement à chacune des bifurcations du réseau, révèle que les profils de taux de cisaillement sont complexes et ne peuvent pas être décrits par une relation analytique simple, contrairement aux canaux d'écoulement linéaires.

En outre, plusieurs bifurcations sont présentes dans le réseau et se situent dans le même intervalle de cisaillement, ce qui renforce la fiabilité statistique des données présentées. Voici des résultats typiques de l'analyse CFD des flux de particules dans le réseau, utilisés pour calculer les flux de particules dans les branches et les bifurcations du réseau expérimental.

La carte d'adhérence au cisaillement calculée à partir d'une seule expérience SMN syn vivo suit la relation inverse observée à partir des cartes d'adhérence au cisaillement obtenues lors d'expériences sur des canaux linéaires. Toutefois, grâce à un test SynVivo, une seule expérience permet de générer cette carte de cisaillement, alors que plusieurs séries expérimentales sont nécessaires avec les canaux linéaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser les dispositifs SynVivo SMN pour produire la carte d'adhérence partagée à partir d'une seule expérience.

Lors de la réalisation de cette expérience, il est important de ne pas introduire de bulles dans le dispositif microfluidique SynVivo SMN après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'inflammation pour étudier l'interaction entre les leucocytes et l'endothélium à différents taux de cisaillement lors d'une seule expérience. Dans la prochaine génération de dispositifs, les chercheurs pourront étudier l'adhésion par roulement des leucocytes et leur migration dans un seul et même test, ce qui n'est pas possible actuellement.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes permettant d'étudier l'adhésion de médicaments, de vecteurs de délivrance de médicaments et de cellules peuvent être réalisées afin d'aborder des questions telles que l'effet physiologique du flux sur l'adhésion cellule-cellule, cellule-médicament et médicament-vecteur.