VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l'identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte

L'objectif général ici est de démontrer la méthodologie utilisant l'interférence génique induite par un virus afin d'identifier les gènes impliqués dans la résistance des plantes non hôtes, et ainsi obtenir des VIGs (virus-induced gene silencing) du végétal endogène. Inoculer des plantes de Nicotiana benthamiana avec un vecteur de virus de la nervure du tabac (tobacco rattle virus) portant un fragment du gène cible, puis préparer et inoculer des cultures du pathogène non hôte exprimant la protéine fluorescente verte sur les feuilles des plantes dont le gène a été silencé. Ensuite, évaluer les colonies vertes fluorescentes du pathogène non hôte sous lumière UV, à l'obscurité.

Afin d'identifier les plantes présentant un gène inhibé qui compromet la résistance non hôte, identifier le gène cible par séquençage de l'insert dans le vecteur viral. Globalement, cette méthodologie de criblage génétique direct médié par VIX permet aux chercheurs d'identifier facilement les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes contre les pathogènes bactériens. En peu de temps, nous avons pris conscience de l'importance de combiner la génétique directe médiée par l'inhibition génique induite par un virus avec des pathogènes exprimant la GFP en lumière UV afin d'identifier les gènes responsables de la résistance non-STS.

Lorsque nous avons précédemment effectué un écran génétique direct fastidieux en évaluant la mort cellulaire induite par une réponse hyperactive et la mort cellulaire induite par la maladie. Ainsi, les graines de Nicotiana ben sont semées sur un mélange de culture sans sol et germent dans une chambre de croissance. Après trois semaines, transplanter les semis en godets individuels, puis les faire croître en serre pendant au moins deux à trois jours avant le virus du frémissement du tabac.

Décongeler progressivement les tiges congelées d'agrobactérium contenant les clones d'ADNc pour l'inoculation vectorielle. Dans des conditions stériles, inoculer les cultures individuelles d'agrobactérium sur milieu Luria à l'aide du vecteur Intv deux. Incuber les plaques Berti agro à 28 degrés Celsius pendant un maximum de deux jours.

Prélevez quatre colonies réplicates pour chaque clone afin de disposer d'un inoculum bactérien adéquat pour l'inoculation de deux plantes. Inoculez TRV1 dans un milieu liquide Luria-Bertani. Récupérez les cultures développées pendant la nuit par centrifugation, resuspendez les bactéries dans le tampon d'inoculation et incubez pendant trois heures à température ambiante sur un agitateur à 50 tr/min.

Après avoir récolté les cellules par centrifugation, mesurer la densité optique et resuspendre les pastilles bactériennes dans un tampon MES 5 millimolaire, pH 5,5. Ensuite, inoculer la culture bactérienne TRV1 ayant une DO600 de 0,3 dans l'axile de trois à quatre feuilles de Nicotiana benthamiana à l'aide d'une seringue sans aiguille, au site d'inoculation de TRV1. Piquer les feuilles avec l'inoculum des colonies respectives de TRV2 à l'aide d'un cure-dent pendant deux semaines. Maintenir les plantes à basse température avec une nutrition adéquate, car une croissance vigoureuse est importante pour un silençage génique efficace par les pigS.

À titre d'exemple, Pseudomonas syringae pv. tomato T1 est utilisé dans cette expérience. Les agents pathogènes doivent porter un plasmide capable d'exprimer la GFP-UV. Faire croître les souches PGE dans un milieu liquide KB supplémenté avec 10 microgrammes par millilitre de rifampicine et 50 microgrammes par millilitre de kanamycine à 28 degrés Celsius pendant 12 heures.

Récupérez les cultures bactériennes par centrifugation, puis confirmez la présence d'une fluorescence verte à l'aide d'une lampe UV à longue longueur d'onde dans l'obscurité. Après deux lavages dans de l'eau stérile, resuspendez les cellules à la concentration souhaitée dans de l'eau stérile et ajustez l'OD à 600. Ensuite, inoculez les pathogènes respectifs sur le côté axial de la cible.

Les feuilles avec gènes silencieux forment des cernes d'environ 1,5 centimètre de diamètre si nécessaire. Testez simultanément plusieurs pathogènes non hôtes pour leur croissance sur les plantes cibles dont le gène est silencieux, et incluez également un contrôle de vecteur pour l'observation. Implantez une croissance bactérienne entre deux et cinq jours.

Exposer les feuilles inoculées à une lumière UV de longue longueur d'onde dans l'obscurité. Veiller à porter une protection pour la peau et les yeux. Observer les colonies bactériennes sous forme de taches vertes fluorescentes sur le côté axial de la feuille, en fond de fluorescence rouge émise par la surface de la feuille.

Vérifiez la fluorescence verte émise par l'agent pathogène hôte, qui sert de contrôle positif. Observez la croissance de l'agent pathogène quotidiennement, de deux à cinq jours après l'inoculation. Établissez une liste des clones dont l'inactivation a entraîné la croissance d'un ou plusieurs agents pathogènes non hôtes.

Pour éliminer les faux positifs du premier criblage, répétez les VIGs pour les clones sélectionnés, puis testez à nouveau la réponse des plantes avec gènes silencés face à des pathogènes non associés. Utilisez la PCR sur colonie du clone sélectionné pour amplifier l'insert à l'aide des amorces A TTB un et TB deux du vecteur T RV deux ou des amorces encadrant le site de clonage.

Exécutez le produit de PCR sur un gel d'agarose et vérifiez l'amplification de la bande unique. Ensuite, séquencez l'insert du gène végétal dans le vecteur T RV deux en utilisant soit les amorces A TTB, soit des amorces encadrant le site de clonage. Effectuez une analyse BLAST à partir de la séquence et identifiez les détails du gène.

Un protocole généralisé pour l'inhibition de grands nombres de gènes utilisant des figs basés sur le virus de la tache annulaire du tabac chez Nicotiana. Hamana est indiquée dans ce schéma de déroulement. Certaines plantes ayant subi une inhibition génique ont montré diverses altérations phénotypiques, incluant une croissance réduite, un jaunissement et des phénotypes de photodécoloration.

Ces données montrent la fluorescence verte du pathogène exposé à la lumière UV dans l'obscurité avant l'inoculation de la plante, ainsi que la croissance des implants trois jours après l'inoculation. La même feuille exposée à la lumière blanche est présentée comme témoin. Cette expérience suit la croissance de bactéries exprimant G-F-P-U-V chez trois plantes non hôtes.

Les agents pathogènes ont été utilisés pour démontrer le processus d'identification du gène silencé chez la plante sensible aux agents pathogènes non hôtes dans les plantes sauvages non silencées de Nicotiana benthamiana présentant une immunité. Ces agents pathogènes n'ont pas proliféré. Toutefois, au moins deux agents pathogènes non hôtes se sont développés sur le mutant NB sgt.

Feuilles avec un gène inhibé. Des données quantitatives sur la croissance bactérienne démontrent le processus d'identification de plantes dont le gène a été inhibé et qui présentent une résistance altérée aux non-ST. En utilisant cette approche de génétique directe médiée par des figues, nous avons inhibé environ 5 000 gènes chez Nicotiana benthamiana et identifié des plantes présentant une résistance aux non-ST compromise, au cours d'une période d'environ un an et demi.

À titre d'exemple, la croissance de pathogènes non hôtes chez deux plantes avec gènes silencés identifiées lors de cet écran est présentée ici. Nous espérons avoir expliqué comment réaliser un isolement génique induit par un virus pour des centaines de gènes, puis évaluer les plantes silencées en observant la croissance de pathogènes non coûteux chez les plantes afin d'analyser la résistance non coûteuse. En utilisant ce protocole fondé sur l'inactivation génique induite par un virus, il est possible d'inactiver des centaines de gènes en deux à trois semaines environ, puis d'évaluer la croissance de pathogènes non hôtes marqués par la GFP UV en deux à trois heures par jour, sur une période d'environ deux à cinq jours.