Name: La Xenopus Ovocytes Cut-ouvert vaseline Gap voltage-clamp Technique Avec Fluorimétrie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez la technique de voltage-clamp cut-open avec fluorimétrie pour l'électrophysiologie des canaux ioniques dans les ovocytes Xenopus. Cette méthode permet des enregistrements à faible bruit avec haute résolution temporelle.

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<ol><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+KV+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).</li>
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<li>Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+Shaker+K%2B+channels%3A+I.+Ionic+and+gating+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents.</a> Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).</li>
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<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
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<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
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<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
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<li>Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+disulfide+bridge+linking+the+fourth+and+the+seventh+extracellular+loops+of+the+Na%2B%2Fglucose+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter.</a> J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;ovocyte vaseline tension d&#39;espace technique du clamp de coupe-ouverte permet la résolution rapide des données, à faible bruit, un contrôle accru sur la solution interne et la composition de la solution externe, et des enregistrements stables sur de relativement longues protocoles 19. Ces avantages mis cette technique en dehors de la pince de tension à deux électrodes standard et des techniques de patch-clamp. Bien que l&#39;équipement spécialisé est nécessaire et le protocole est relativement diffic...

Techniques spécialisées tension de serrage permettent l&#39;enregistrement des courants ioniques à des potentiels de membrane contrôlées. Largement utilisé tension à deux électrodes pince (TEVC) et des techniques de patch-clamp fournissent des informations électrophysiologique fiable sur les propriétés de nombreux canaux ioniques. Cependant, ces deux méthodes présentent des inconvénients qui empêchent l&#39;acquisition de données fiables pour les canaux sodiques voltage-dépendants rapides et d&#39;autres canaux d&#39;activation rapide dans les membranes tels que ceux des ovocytes de Xenopus. Les laboratoires Bezanilla et Stefani donc développé la technique écart de vaseline tension pince coupe-ouvert (COVG) pour 2 ovocytes. La technique a été largement appliqué pour enregistrer, Na +, K + et Ca 2 + canaux 3-8. Pendant l&#39;enregistrement COVG, une membrane de l&#39;ovocyte exprimant la protéine hétérologue est divisée en trois régions. Les données du courant ionique est enregistrée à partir de la région supérieure de l&#39;ovocyte que lebain entourant la zone de tête est fixée à un potentiel de commande, qui peut être changé facilement et rapidement. La région du Moyen protège contre les courants de fuite par serrage au même potentiel que la région supérieure 9. La zone inférieure est l&#39;endroit où l&#39;ouverture de l&#39;ovocyte (cut-open) se produit grâce à l&#39;utilisation d&#39;une solution de saponine ou d&#39;une canule. Chimique ou ouverture manuelle de la membrane dans la zone de fond permet un contrôle du potentiel interne, qui est fixée à la masse, et rend l&#39;intérieur de la cellule contiguë avec la solution de la chambre inférieure. Perfusion de solutions dans la chambre inférieure peut ajuster les propriétés de l&#39;environnement interne, alors que l&#39;échange de solution dans la chambre supérieure modifie l&#39;environnement extérieur. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. Ovocyte Cut-Ouvrir un diagramme de configuration Voltage-Clamp Bath. (A) Hautbas de la vue des trois salles de bains séparées les unes des autres. Les dimensions des chambres pour COVG sont affichés sur la figure. (B) Vue de côté de l&#39;installation de salles de bains en position d&#39;essai. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . Les avantages de la technique de COVG comprennent faible bruit actuel (1 nA à 3 kHz), le contrôle de la composition ionique des médias externes, la capacité de moduler les médias interne, la résolution de temps rapide (20-100 constante ps de temps de décroissance de la capacité transitoire), et des enregistrements stables pendant plusieurs heures 9. Les inconvénients sont que cela nécessite un équipement spécialisé et il est plus difficile à réaliser par rapport aux deux serrage de tension des électrodes (TEVC) 10. Bien que l&#39;approche de COVG nécessite un équipement hautement spécialisé et éléments de procédure complexes, il peut permettre l&#39;acquisition de précieuxdonnées électrophysiologiques capables. Ces données, comme gating courants avec une cinétique rapide et courants de queue 4, peut être enregistrée sans certains des problèmes associés à d&#39;autres protocoles tension de serrage y compris le canal délabré. Des modifications mineures à la configuration COVG peuvent permettre l&#39;utilisation de régulateurs de température et de la tension de serrage fluorométrie (VCF). L&#39;inclusion d&#39;éléments de serrage fluorimétrie de tension au sein de l&#39;assemblage COVG peut augmenter la sortie des données en conférant la capacité à surveiller les changements de conformation des protéines tout en enregistrant simultanément de courant de 11 à 13.

<table><tbody><tr><td>Solution externe</td> Numéro de <td>catalogue</td> de <td>la marque</td><td>[Final], poids ou volume</td></tr><tr><td>N-méthyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES Sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Hydroxyde de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variable (pH à 7,4)</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td>interne</tr><tr><td>N-méthyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td></td><td>HEPES Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variable (pH à 7,4)</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td>dépolarisante</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1.5mM</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Caisson</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Pipet Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr><td>Saponin Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>Interne Solution</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>50 ml</td></tr> de <tr><td>solution de pont</td><td></td><td></td><td></td>d’agar</tr><tr><td>N-méthyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100 ml de 1M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>1,2 g</td></tr><tr><td>de MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variable (pH à 7,4)</td></tr><tr>Produits de recherche sur <td>la gélose granulée</td><td> International</td><td>A20250</td><td>3 %</td></tr> <tr><td>NMDG Solution</td><td></td><td></td><td></td>de stockage</tr><tr><td>NMDG, HEPES, MES Solution d’hydrate</td><td>voir ci-dessus</td><td></td><td>40ml</td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td>60ml</td></tr><tr><td>Nom du matériel/ de l’équipement</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires/Description</td></tr><tr><td>Pince à ovocytes haute performance</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données</td><td>Axon CNS</td><td>²nbsp ; Oscilloscope Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix&nbsp ;</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’alimentation rack</td><td>APC&nbsp ;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température de bain de chauffage/refroidissement</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Logiciel de pince de tension</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Vibration Control TableTop Platform</td><td>TMC</td><td>SÉRIE</td><td></td></tr><tr><td>TMC Table d’air de contrôle des vibrations</td><td>TMC</td><td><a name="GAMME ! Série C10">20)&nbsp ; </a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I Collecteur de données d’électrodes</td><td>Dagan</td><td>partie de CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L Micromanipulateur</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Bain/Garde (I/V) Headstage (avec connecteurs appropriés)</td><td>Dagan</td><td>partie de CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Bain de contrôle de température Personnalisé</td><td>ou Dagan</td><td>Personnalisé ou HE-204C</td><td>Chambre personnalisée fabriquée à partir de matériaux de Cool Polymers (série D). Dagan fournit également une platine préfabriquée (HE-204C).</td></tr><tr><td>Conteneur à granulés AgCl personnalisé</td><td></td><td>Électrode</td> Ag/AgCl <td>usinée sur mesure</td></tr><tr><td>, granulés, 2,0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’ovocytes externe</td><td>sur mesure ou Dagan</td><td>sur mesure ou CC-1-T-LB</td><td>Usiné sur mesure ou acheté chez Dagan</td></tr><tr><td>Bain d’ovocytes interne</td><td>sur mesure ou Dagan</td><td>sur mesure ou CC-TG-ND</td><td>Sur mesure ou acheté chez Dagan</td></tr><tr><td>Capillaires pour ponts gélifiés et électrodes tirées</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Montures rotatives pour microscope, micromanipulateur et bain</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel régulière</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Ovocytes Xenopus laevis</td><td>Nasco</td><td>LM535M (femelles sexuellement matures)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ Solution externe</td><td>Voir la fiche</td><td></td><td></td>des solutions</tr><tr><td>10 Na+ Solution interne</td><td>Voir la fiche</td><td></td><td></td>des solutions</tr><tr><td>3 M KCL Voir la</td><td>fiche</td><td></td><td></td>des solutions</tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Storage Solution</td><td>Voir la fiche</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>des solutionsPipettes de transfert de 5 ml</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur d’électrodes KCl modifié</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Embout de seringue en plastique fondu pour permettre l’injection de solution dans les électrodes. Alternativement, un Microfil de WPI peut être acheté.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Forceps</td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Outils de manipulation d’ovocytes (pompe à pipette)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de gicleur d’eau déminéralisée</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>vaseline vaseline vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Matériel supplémentaire requis pour les enregistrements VCF :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope VCF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW Objectif NIR</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y Système de traduction pour microscopes verticaux à platine fixe</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’ovocytes VCF externe</td><td>sur mesure</td><td></td><td>Usiné sur mesure. Les dimensions de la chambre sont de 2,7 x 1,9 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Bain d’ovocytes interne VCF</td><td>usiné sur mesure</td><td></td><td>. Les dimensions de la chambre sont de 1,6 x 1,6 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Chambre</td><td></td><td></td><td>personnalisée fabriquée à partir de matériaux de polymères froids (série D). Les dimensions de la chambre du bain du régulateur de température modifié sont de 2,7 x 1,9 x 0,3 cm pour la chambre horizontale et de 1 x 2,5 x 0,5 cm pour la chambre verticale.</td></tr></tbody></table>

la<em&gt; xenopus</em&gt; ovocytes cut-ouvert vaseline gap voltage-clamp technique avec fluorimétrie

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

L&#39;écart ovocyte vaseline coupe-ouvert (COVG) technique tension de serrage permet d&#39;analyser les propriétés électrophysiologiques et cinétiques des canaux ioniques hétérologues dans les ovocytes. Les enregistrements de la configuration du coupe-ouvert sont particulièrement utiles pour résoudre des courants faibles ampleur de déclenchement, l&#39;activation du courant ionique rapide, et la désactivation. Les principaux avantages par rapport à la tension à deux électrodes pince (TEVC) comprennent la technique d&#39;augmenter la vitesse de serrage, l&#39;amélioration de rapport signal-sur-bruit, et la capacité de moduler la intracellulaire et milieu extracellulaire. Ici, nous utilisons le canal sodique cardiaque humain (HNA V 1.5), exprimé dans des ovocytes de Xenopus, pour démontrer l&#39;installation et le protocole coupe-ouverte ainsi que les modifications qui sont nécessaires pour ajouter la capacité de fluorimétrie tension de serrage. Les propriétés des canaux ioniques rapides d&#39;activation, comme HNA V 1.5, ne peuvent pas être entièrement résolus proche de la température ambiante en utilisant TEVC, dans which, la totalité de la membrane de l&#39;ovocyte est serré, ce qui rend difficile le contrôle de la tension. Cependant, dans la technique de découpe ouverte, l&#39;isolement de seulement une petite partie de la membrane cellulaire permet la fixation rapide requis pour enregistrer avec précision une cinétique rapide, tout en empêchant canal course vers le bas associée à des techniques de patch-clamp. En liaison avec la technique de COVG, la cinétique des canaux ioniques et les propriétés électrophysiologiques peuvent encore être dosée à l&#39;aide de la tension de serrage fluorimétrie, où le mouvement de la protéine est suivi par l&#39;intermédiaire de la cystéine conjugaison de fluorophores extracellulaire appliqués, l&#39;insertion de protéines fluorescentes codés génétiquement, ou l&#39;incorporation d&#39;acides aminés non naturels dans la région d&#39;intérêt 1. Ces données supplémentaires donne des informations sur les réarrangements conformationnels cinétique de la protéine dépendant de la tension par des changements dans le microenvironnement autour de la molécule fluorescente.

La figure 4 montre la variation de la perméabilité de l&#39;ovocyte en tant que solution de saponine est appliquée à la partie inférieure de l&#39;ovocyte. Figure 5 démontre le taux de conversion de la solution intracellulaire par diffusion suivant la perméabilisation de la saponine. 20-40 min sont nécessaires pour arriver à un état ​​d&#39;équilibre 2,18. Figure 6A présentent des traces générées par le protocole d&#39;enregistrem...

L&#39;approche de l&#39;écart de vaseline découpe ouverte est utilisée pour obtenir des enregistrements à faible bruit des courants ioniques et dérogeant canaux ioniques voltage-dépendants exprimées dans des ovocytes de Xenopus à haute résolution de la cinétique de canaux rapides. Avec des modifications mineures, la tension de serrage fluorimétrie peut être couplé au protocole d&#39;ovocytes découpe ouverte.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocytes Cut-ouvert vaseline Gap voltage-clamp Technique Avec Fluorimétrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des enregistrements à faible bruit des courants ioniques et des courants de commande provenant de canaux ioniques activés par le voltage, exprimés dans des cellules zap, avec une résolution temporelle élevée des cinétiques rapides du canal. Ceci est réalisé en injectant d'abord l'ARNm du canal ionique enregistré dans des ovocytes de grenouille. La deuxième étape consiste à créer des ponts d'agar en modelant des capillaires et en remplissant ensuite ces capillaires avec une solution d'agar contenant un sel.Ensuite, le montage ouvert est préparé pour l'expérimentation en plaçant toutes les composantes, y compris le site UO et les ponts d'agar, à leurs emplacements désignés. La dernière étape consiste à insérer la microélectrode dans le site UO afin d'effectuer des enregistrements en régime de blocage de tension. Enfin, le protocole d'enregistrement est utilisé pour montrer les courants ioniques provenant des canaux ioniques situés dans la membrane de l'ovocyte.Le principal avantage de la technique de blocage de tension en configuration « cut open » est qu'elle permet d'obtenir des enregistrements stables et peu bruités d'une populat

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Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Courant ionique des canaux BK est enregistrée en utilisant des techniques de patch-clamp. Canaux BK sont exprimés...

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Nous décrivons une méthode pour quantifier l’activité des ATPases de type P contre-transportant K+ par expression hétérologue des enzymes dans les ovocytes de xénope et en mesurant l’absorption de Rb+ ou Li+ dans les cellules individuelles par spectrophotométrie d’absorption atomique. La méthode est une alternative sensible et sûre aux expériences de flux de radio-isotopes, facilitant les études cinétiques complexes.

Mesure de transport de cations Na, K et H, K-ATPase dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Les ovocytes par spectrophotométrie d&#39;absorption atomique: une alternative à dosages radio-isotopes

Pour compléter les méthodes couramment utilisées pour étudier TRPV4 de, deux méthodes sont décrites: Son mécanosensibilité peut être étudiée par le Ca 2 + luminométrie-aequorine dans la levure transgénique lors de l'épreuve de l'hypo-osmotique. Il peut également être consultée en TRPV4-ARN injecté des ovocytes de Xenopus par cellule entière à deux électrodes de verrouillage de tension ou de patch clamp dans la cellule ou le mode excisé.

Levure et luminométrique Xenopus ovocytes électrophysiologiques examens de la mécanosensibilité moléculaire de TRPV4

Une méthode d’imagerie des changements de potentiel membranaire à l’aide d’indicateurs de tension génétiquement codés est décrite.

Imaging potentiel de membrane avec deux types de capteurs codés génétiquement tension fluorescentes

Des procédures optimisées pour l’isolement des follicules uniques, les micro-injections d’ARN cytoplasmique, l’élimination des couches cellulaires environnantes et l’expression des protéines dans les ovocytes de xénope sont décrites. En outre, une méthode simple pour des changements rapides de solution dans des expériences électrophysiologiques avec des canaux ioniques ligand-dépendants est présentée.

Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques

Cet article décrit une amélioration de la Fluorométrie conventionnelle en tension-clamp (VCF) où les acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) sont utilisés à la place des colorants maléimidés, pour sondage des réarrangements structurels dans les canaux ioniques. La procédure comprend l'injection d'ADN ovocytaire de Xenopus, la co-injection d'ARN / fUAA et les mesures simultanées de courant et de fluorescence.

Fluorométrie de tension-serre dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytes utilisant des acides aminés fluorescents non naturels

Les enregistrements de cellules entières des photorécepteurs de Drosophila melanogaster permettent de mesurer des bosses sombres spontanées, des bosses quantiques, des réponses macroscopiques à la lumière et des relations courant-tension dans diverses conditions. En combinaison avec des outils de manipulation génétique de D. melanogaster, cette méthode permet d’étudier la voie de signalisation inositol-lipidique ubiquitaire et sa cible, le canal TRP.

Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs

Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Nous présentons ici un protocole pour exprimer les protéines de jonction lacunaire dans les ovocytes Xenopus et enregistrer le courant jonctionnel entre deux ovocytes apposés à l’aide d’un amplificateur commercial conçu pour les enregistrements à double tension ovocytaire dans un mode de mesure à courant latéral élevé.

Enregistrement du courant de jonction de l’espace des ovocytes Xenopus

Découvrez la technique de voltage-clamp cut-open avec fluorimétrie pour l'électrophysiologie des canaux ioniques dans les ovocytes Xenopus. Cette méthode permet des enregistrements à faible bruit avec haute résolution temporelle.

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