Name: Imagerie RICL sécrétion denquêter sur linfection cellulaire par le pathogène bactérien Listeria monocytogenes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T22:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie pour quantifier l'invasion cellulaire par Listeria monocytogenes via le marquage fluorescent de la protéine InlC. Cette technique permet des cribles siRNA à haut débit pour identifier les facteurs hôtes impliqués dans l'infection bactérienne.

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La recherche en laboratoire P. Cossart est soutenu par l&#39;Institut Pasteur, l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l&#39;Institut National de la Recherche Agronomique, ERC avancée Grant (233348), l&#39;Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fondation Louis-Jeantet et la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK est récipiendaire d&#39;une bourse de l&#39;Université Paris-Pasteur Programme Doctoral International / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Nous remercions Jason Mercer pour optimiser le protocole de transfection cellulaire.

Une. Préparation des cultures cellulaires et bactériennes, transfection Outils et anticorps primaires <ol><li> Préparer une plaque de gélose frais d&#39;isoler individuelle L. monocytogenes colonies à partir d&#39;un stock de glycérol bactérienne (50% glycerol/50% saturé culture de la nuit liquide bactérienne) conservé à -80 ° C. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un rack en aluminium (conservé à -80 ° C) pour transporter un bactérienne glycérol d&#39;surgelés, les bactéries à balayage sur un coeur cervelle (BHI) de plaque de gélose. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 48 h (ou jusqu&#39;à ce que des colonies bactériennes individuelles peuvent être isolés). </li><li> Conservez cette plaque travailler ensuite à 4 ° C pendant une durée maximale de 1 mois (elle sera utilisée pour ensemencer des cultures liquides). </li><li> Dans notre protocole, nous utilisons le L. monocytogenes sérotype 1/2a EGDe.PrfA * souche, mais comme cela est illustré sur la figure 1, le L. monocytogenes sérotype 4b P14.PrfA * souche donne des résultats similaires. </li></ol></li><li> IlCellules de CCL2 La ATCC sont cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) en l&#39;absence d&#39;antibiotiques. </li><li> Pools indépendants de brouillés (contrôle) et des anti-Met siRNAs sont chargés dans 384 puits de plaques de culture cellulaire par microscopie noirs. <ol><li> Diluer 160 pmol de siRNA dans 500 pi d&#39;eau sans RNase et ajouter 5 ul de cette solution par puits (concentration finale: 1,6 pmol). </li><li> Conservez cette plaque à -20 ° C pour une période maximale de 1 an. </li></ol></li><li> Des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine bactérienne RICL ont été obtenus par immunisation à l&#39;aide d&#39;une protéine recombinante RICL-GST comme décrit précédemment 25. </li></ol> 2. Inverser siRNA Transfection cellulaire <ol><li> 72 heures avant l&#39;infection amener à la température ambiante, une plaque 384 puits de culture cellulaire de microscopie noir contenant 1,6 pmol siRNA dans 5 pi d&#39;eau sans RNase dans chaque puits. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 3 min à 300rcf à la température ambiante pour faire baisser siRNA qui aurait pu être déposé dans les parois des puits. </li><li> Préparer à manger DMEM de température complété avec 0,4% Lipofectamine RNAiMAX. </li><li> Ajouter 25 ul du milieu de transfection DMEM / RNAiMAX à chaque puits (ne pas laisser incuber le milieu de transfection plus de 20 minutes avant de l&#39;ajouter à la siRNA). </li><li> Déplacer la plaque avant et en arrière de mélanger le siRNA avec la solution de transfection, puis garder la plaque pendant 1 heure à température ambiante pour permettre complexes siARN-Lipofectamine pour former. </li><li> Laver les cellules HeLa à partir d&#39;un flacon-confluente ou une culture de cellules sous-confluentes une fois avec 10 ml 37 ° C préchauffé PBS. </li><li> Détacher les cellules HeLa par addition de 1 ml à 37 ° C préchauffé trypsine dans la fiole de culture de cellules et incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C. </li><li> Re-suspendre les cellules dans 10 ml 37 ° C préchauffé DMEM supplémenté avec 16% de FBS. </li><li> Compter les cellules et à préparer une suspension cellulaire de 12 000 cellules par ml dans du DMEM supplémenté avec16% de FBS. </li><li> Ajouter 50 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 384 puits. </li><li> Déplacer la plaque rapidement d&#39;avant en arrière pour répartir les cellules et les cellules laisser s&#39;installer pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Sceller la plaque avec du Parafilm et garder pendant 72 heures dans un contenant du CO 2 atmosphère humidifiée de 5% à 37 ° C. </li></ol> 3. Infection cellulaire et coloration <ol><li> Le jour avant l&#39;infection, prendre une seule colonie de L. monocytogenes dans la plaque de gélose BHI et remettre en suspension dans 5 ml de milieu de BHI de liquide dans un tube de 15 ml en polystyrène. </li><li> Incuber pendant une nuit à 37 ° C dans un dispositif de Shacking pour permettre la croissance bactérienne. </li><li> Le jour de l&#39;infection, se laver 1 ml de la L. nuit monocytogenes culture par centrifugation 2 min à 10600 rcf sur une centrifugeuse de table. </li><li> Jeter le surnageant (qui contient le sécrétée cytotoxine listériolysine O) et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS (REPEAt l&#39;étape de lavage 3 fois plus). </li><li> Lire la densité optique à 600 nm bactérienne et estimer le nombre de bactéries (OD = 1 est équivalent à 1E9 bactéries / ml). </li><li> Préparer le L. adéquate monocytogenes dilution dans du DMEM supplémenté avec 1% de FBS: en utilisant des souches hautement invasives comme EGDe.PrfA *, nous suggérons l&#39;utilisation de bactéries 5E4 dans 30 pi de milieu par puits (la multiplicité d&#39;infection est estimé à 25 pour 2000 cellules). </li><li> Retirer le milieu de culture de cellules dans chaque puits (80 ul) et de la remplacer par l&#39;ajout de 30 ul de la L. monocytogenes milieu contenant. </li><li> Centrifuger la plaque à 200 rcf pendant 5 min à température ambiante pour synchroniser le processus d&#39;infection. </li><li> Incuber la plaque pendant 1 heure dans un CO 2-atmosphère humidifiée contenant 5% à 37 ° C sur un bloc d&#39;aluminium préchauffé. </li><li> Retirez le L. monocytogenes contenant du milieu de chaque puits et ajouter 30 ul de DMEM préchauffé additionné de 10% de FBS et40 pg / ml de gentamicine de tuer extracellulaire L. monocytogenes. </li><li> Incuber pendant 4 heures dans un CO 2-atmosphère contenant 5% à 37 ° C sur un bloc de métal préchauffée. </li><li> Préparer une solution de PBS supplémenté avec 8% de formaldehyde (cette solution doit être préparé de telle sorte que les monomères de formaldéhyde, de préférence aux polymères de paraformaldéhyde, sont utilisés). </li><li> Sans écarter le milieu de culture de cellules, ajouter 30 ul de PBS supplémenté avec 8% de formaldéhyde (concentration finale: 4%) et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Retirer le fixateur et de lavage des cellules trois fois avec 80 ul de PBS par puits (maintenir les cellules dans un volume final de 80 ul de PBS par puits). </li><li> Préparer une dilution 1:250 du lapin anti-RICL sérum dans du PBS additionné de 0,2% de saponine. </li><li> Ajouter 10 ul de la solution d&#39;anticorps primaire à chaque puits après avoir enlevé le PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Jeter le primairesolution d&#39;anticorps et laver quatre fois avec 40 pl de PBS par puits. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire Alexa Fluor 546 à couplage anti-lapin (1:250), la solution de DAPI (1:1500) et phalloïdine-DY647 (1:150) dans du PBS supplémenté avec 0,2% de saponine. </li><li> Ajouter 10 ul de cette solution de coloration secondaire pour chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Jeter la solution de coloration secondaire et laver quatre fois avec 40 pl de PBS par puits (laisser un volume final de 40 ul dans chaque puits et sceller la plaque). </li><li> La plaque peut être reproduite immédiatement ou peut être conservé à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière (couvrir de papier d&#39;aluminium) pour une analyse ultérieure. </li></ol> 4. Acquisition et analyse d&#39;images <ol><li> Acquérir des images en trois canaux différents (350 nm, 546 nm et 647 nm) en utilisant un objectif 10X monté sur un microscope automatisé (acquérir préférentiellement 9 images par puits). </li><li> Le signal RICL peut être mesurée en utilisant l&#39;imagelogiciel d&#39;analyse comme CellProfiler qui permet la segmentation automatique des noyaux et des corps cellulaires utilisant le DAPI et la coloration de phalloidin, respectivement. </li></ol>

<ol><li>Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).</li>
<li>Mackaness, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resistance+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular resistance to infection.</a> Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).</li>
<li>Tilney, L. G., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+and+the+growth%2C+movement%2C+and+spread+of+the+intracellular+bacterial+parasite%2C+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes.</a> Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).</li>
<li>Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+structural+gene+encoding+the+SH-activated+hemolysin+of+Listeria+monocytogenes%3A+listeriolysin+O+is+homologous+to+streptolysin+O+and+pneumolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.</a> Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).</li>
<li>Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+L.+monocytogenes+into+cells+is+mediated+by+internalin%2C+a+repeat+protein+reminiscent+of+surface+antigens+from+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci.</a> Cell. 65, 1127-1141 (1991).</li>
<li>Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+control+of+Listeria+monocytogenes+virulence+factors+by+a+gene+that+is+autoregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated.</a> Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).</li>
<li>Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+monocytogenes-induced+actin+assembly+requires+the+actA+gene+product%2C+a+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein.</a> Cell. 68, 521-52 (1992).</li>
<li>Glaser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Listeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Listeria species.</a> Science. 294, 849-852 (2001).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape%3A+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+host-pathogen+interactions+with+the+bacterium+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).</li>
<li>Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+the+receptor+for+internalin%2C+a+surface+protein+required+for+entry+of+L.+monocytogenes+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells.</a> Cell. 84, 923-932 (1996).</li>
<li>Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InIB-dependent+internalization+of+Listeria+is+mediated+by+the+Met+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase.</a> Cell. 103, 501-510 (2000).</li>
<li>Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha-and+beta-catenins+in+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).</li>
<li>Ireton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion.</a> Science. 274, 780-782 (1996).</li>
<li>Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+protein+InlB+is+an+agonist+of+mammalian+phosphoinositide+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+patterns+associated+with+Listeria+monocytogenes+InlA-+or+InlB+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes.</a> Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+phosphatidylinositol+4-kinases+promote+Listeria+monocytogenes+entry+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells.</a> Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).</li>
<li>Hamon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+induced+by+a+family+of+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Histone modifications induced by a family of bacterial toxins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).</li>
<li>Ribet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+impairs+SUMOylation+for+efficient+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection.</a> Nature. 464, 1192-1195 (2010).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416, 644-648 (2002).</li>
<li>Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).</li>
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<li>Rajabian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+virulence+factor+InlC+perturbs+apical+cell+junctions+and+promotes+cell-to-cell+spread+of+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria.</a> Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).</li>
<li>Gouin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+monocytogenes+InlC+protein+interferes+with+innate+immune+responses+by+targeting+the+I%CE%BAB+kinase+subinit+IKK%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+analysing+invasion+of+mammalian+cells+by+bacterial+pathogens%3A+the+Listeria+monocytogenes+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system.</a> Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).</li>
<li>Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Plusieurs paramètres sont essentiels pour le succès de notre protocole RICL de détection, y compris l&#39;utilisation de lignées de cellules saines présentant un assez grand cytoplasme pour permettre une détection sans ambiguïté du signal RICL. Dans l&#39;analyse que nous présentons dans cet article, nous proposons l&#39;utilisation de cellules HeLa CCL2, qui sont particulièrement bien adapté à notre analyse en raison de l&#39;extension de leur espace cytosolique; autres clones HeLa comme les cellules HeLa Kyoto affiche...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51043">Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes</a>. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas K&#252;hbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerd&#225;1,2,3 
1Unit&#233; des Interactions Bact&#233;ries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Z&#252;rich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Sant&eacute; et de la Recherche M&eacute;dicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

A correction to author list has been made for the article Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication.

Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

La bactérie à Gram positif Listeria monocytogenes est un agent pathogène d&#39;origine alimentaire qui envahit les cellules de l&#39;hôte, perturbe sa vacuole d&#39;internalisation et se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes 1. L. monocytogenes facilité de manipulation dans le contexte de laboratoire (d&#39;une croissance rapide, une faible toxicité pour les individus en bonne santé) associée à la persistance de caractéristiques de virulence bactériennes observées dans des modèles cellulaires et animaux (l&#39;activité hémolytique, leucocytose) a permis son utilisation initiale dans les années 1960 comme un modèle majeur pour l&#39;étude du parasitisme intracellulaire et pour la mise en place des fondements théoriques de l&#39;immunité cellulaire contre l&#39;infection 2. À la fin des années 1980 et au début des années 1990, la dissection du cycle intracellulaire bactérienne 3 ainsi que la caractérisation moléculaire de la virulence bactérienne la plus importante facteurs 4-7 favorisé l&#39;utilisation de L. monocytogenes comme un outil moléculaire clé pour la manipulation et le goujony des fonctions de la cellule hôte. La présence de non virulente (L. innocua) et (L. monocytogenes) espèces virulentes dans le genre Listeria ont ouvert la voie à des études génomiques comparatives 8 qui, avec la création récente de la L. complète monocytogenes transcriptome 9, ont accru notre compréhension de l&#39;évolution de L. monocytogenes comme un agent pathogène humain et en tant que système modèle pour l&#39;infection études de 10. L. monocytogenes induit son internalisation dans les cellules hôtes lors de l&#39;interaction des protéines de surface bactériennes INLA et INLB avec leurs récepteurs de la cellule hôte E-cadhérine et Met, respectivement 11-12. Études sur la base de candidats initiaux ont conduit à l&#39;identification de l&#39;α / β caténines-actine lien comme une composante importante de la voie InlA-invasion 13 et de la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) comme un effecteur critique de la InlB- dépendant invasion cascade 14 à 15. Analyses protéomiques et base fonctionnelle suite ont permis d&#39;identifier de nouveaux éléments du cytosquelette et 16 seconds messagers lipidiques 17 requis pour l&#39;invasion de la cellule hôte. Études de la transcription 18 et protéomique de masse basé spectrométrie de 19 quantitatives ont récemment jeté un nouvel éclairage sur l&#39;activation de la signalisation accueil cascades et la répression de la réponse immunitaire au cours de L. monocytogenes infection. Biologie systémique basée sur l&#39;inactivation des grands ensembles de gènes (kinomes, génomes complets) par petits ARN interférents (siRNA) silencieux ont récemment ouvert de nouvelles voies pour l&#39;analyse de l&#39;hôte mondiale cascades de signalisation dans le cadre des fonctions cellulaires spécifiques, y compris la phagocytose et pathogène internalisation 20. Écrans de siRNA du génome entier ont déjà été menées pour examiner cascades cellulaires nécessaires pour l&#39;infection de L. monocytogenes dans phagocytaire Drosophila </em&gt; cellules S2 21-22, mais ce type d&#39;analyse n&#39;a pas été réalisée dans des cellules non-phagocytaires, qui représentent des cibles importantes pour l&#39;infection in vivo. Nous avons optimisé un protocole pour la détection microscopique des stades tardifs de l&#39;infection par L. monocytogenes qui est adapté pour les études à haut débit siARN d&#39;entrée bactérienne dans les cellules épithéliales. Notre essai tire parti d&#39;un L. hautement invasive monocytogenes souche qui présente une mutation ponctuelle dans PrfA, le régulateur transcriptionnel majeur de L. monocytogenes facteurs de virulence 6: cette mutation (nommé PrfA *) rend PrfA constitutivement active 23 et conduit à une augmentation de l&#39;expression des protéines d&#39;invasion de l&#39;INLA et INLB, favorisant ainsi l&#39;entrée des bactéries dans les cellules non-phagocytaires sinon mal infectés. Notre lecture de l&#39;infection est basé sur la détection de l&#39;accumulation cytosolique de la sécrétée de la protéine bactérienne RICL: cette molécule estun effecteur pleiotrope qui s&#39;exprime préférentiellement par voie intra-cytoplasmique L. 9 monocytogenes et qui participe non seulement à la cellule-cellule au-bactérien réparties 24 mais qui modulent également les réponses immunitaires de l&#39;hôte 25. Le marquage fluorescent des RICL la sécrétion par les bactéries intracellulaires non seulement permet de distinguer clairement infectée à partir de cellules non infectées, mais représente également une lecture du point final qui peut être utilisé par la suite pour disséquer infection dans ses différentes étapes: d&#39;entrée, évasion vacuolaire, bactérienne cytosolique la prolifération et la propagation de cellule à cellule. Ce protocole basé sur la microscopie peut être couplé à écrans siARN donc d&#39;étudier les voies cellulaires impliquées dans l&#39;infection des cellules hôtes par L. monocytogenes.

<table><tbody><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>237500</td><td>Pour préparation de BHI liquide</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Complément à BHI liquide pour plaques de gélose BHI </td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur</td><td>Biowest</td><td>51830-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-100</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde (16 %)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>Préparer frais avant chaque expérience</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Dy647</td><td>Dyomics</td><td>647-33</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Scramble</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>siRNA Met</td><td>Dharmacon</td><td>L-003156-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie noire à 384 puits plaque de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver Z1 microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007 9901</td><td></td></tr><tr><td>Caméra sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td>Logiciel public disponible à l’adresse <a href="http://www.cellprofiler.org/ » target="_blank">http://www.cellprofiler.org/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie ricl sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; listeria monocytogenes</em

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Pathogènes intracellulaires bactériennes peuvent être conçus comme des outils moléculaires pour disséquer les cascades de signalisation cellulaire en raison de leur capacité à manipuler exquise et subvertir les fonctions cellulaires qui sont nécessaires pour l&#39;infection des tissus cibles de l&#39;hôte. Parmi ces bactéries pathogènes, Listeria monocytogenes est un micro-organisme à Gram positif qui a été utilisé comme un paradigme pour parasitisme intracellulaire dans la caractérisation des réponses immunitaires cellulaires, et qui a joué un rôle instrumental dans la découverte des voies moléculaires contrôlant cytosquelette et la membrane dynamique de la traite. Dans cet article, on décrit un test microscopique robuste pour la détection des stades de l&#39;infection cellulaire L. fin monocytogenes basées sur le marquage fluorescent de RICL, une protéine bactérienne sécrétée qui s&#39;accumule dans le cytoplasme des cellules infectées, ce dosage peut être couplé à de petits écrans d&#39;ARN automatisées à haut débit interférant de manière à carboniseracterize voies de signalisation cellulaires impliqués dans la hausse ou à la régulation à la baisse de l&#39;infection.

Marquage fluorescent cytoplasmique RICL fournit une lecture robuste pour l&#39;infection des cellules par L. monocytogenes, comme illustré sur la figure 1: la cellule centrale dans la micrographie est fortement infectées par la souche P14.PrfA * 23 comme cela peut être observé dans l&#39;image à contraste de phase (pointes de flèches, figure 1A) et il est confirmé par le signal DAPI où bactéries individuelles peuvent être clairement distingués (figure 1B).</s...

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène à Gram positif fréquemment utilisé comme un modèle important pour l&#39;étude du parasitisme intracellulaire. Imagerie fin L. monocytogenes stades d&#39;infection dans le contexte de petits écrans ARN interférant permet l&#39;étude globale des voies cellulaires nécessaires à l&#39;infection bactérienne de cellules hôtes cibles.

Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier l'invasion cellulaire par le pathogène *Listeria monocytogenes* dans le cadre de tests d'ARNi afin de découvrir de nouvelles fonctions cellulaires nécessaires à l'infection bactérienne. Cela est réalisé en effectuant tout d'abord une transfection inverse d'ARNi cellulaire afin d'inactiver des fonctions spécifiques de la cellule hôte. Dans un second temps, les cellules sont inoculées avec *Listeria monocytogenes*, qui infecte différemment les cellules selon les fonctions cellulaires altérées par le traitement à l'ARNi.Ensuite, les cellules infectées sont traitées par immunofluorescence afin de marquer les noyaux cellulaires. L'actine du cytosquelette et la protéine bactérienne INLC sont révélées, permettant d'identifier les cellules infectées et de les distinguer des cellules non infectées, sur la base de l'analyse microscopique de la distribution de la protéine INLC dans chaque cellule. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les tests d'invasion à la gentamicine, est qu'elle peut être utilisée de manière FU.Ainsi, cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés da

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Source : Chetrit, D., et al. Application de l’imagerie à cellules vivantes et de la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion dot/icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo montre la préparation et l’imagerie de bactéries pathogènes marquées par fluorescence. Les tampons d’agarose sont d’abord préparés et positionnés dans un cadre adhésif. Une suspension de bactéries génétiquement modifiées exprimant une...

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La transmission orale de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Chez la souris par l&#39;ingestion d&#39;aliments contaminés

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Listeria monocytogenes cause des infections fœtales chez les femmes enceintes et une méningite dans les populations sensibles.  Les sous-populations de bactéries peuvent coloniser le tissu cardiaque, provoquant une myocardite chez les patients et les animaux de laboratoire.  Ici nous présentons un protocole qui décrit comment évaluer l’invasion de cellules cardiaques de monocytogenes de L. in vitro et la colonisation cardiaque chez les animaux infectés.

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Ce protocole décrit comment inoculer des souris C57BL / 6J avec la souche EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) et de mesurer l' interféron-γ (IFN-γ) Réponses par tueuses naturelles (NK), T (NKT) des cellules tueuses naturelles, et adaptative des lymphocytes T post-infection. Ce protocole décrit également la façon de mener des études de survie chez les souris après l' infection avec une DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène.

Infection expérimentale avec<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En tant que modèle pour l&#39;étude de l&#39;hôte Réponses Interféron-y

Nous décrivons les deux tests in vitro et in vivo de l’infection qui peuvent être utilisés pour analyser les activités des facteurs de l’hôte-codage.

À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte

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Imagerie de la production gamma d'interféron in situ dans la rate de souris suite à l'infection à Listeria monocytogenes

Découvrez une méthode de microscopie pour quantifier l'invasion cellulaire par Listeria monocytogenes via le marquage fluorescent de la protéine InlC. Cette technique permet des cribles siRNA à haut débit pour identifier les facteurs hôtes impliqués dans l'infection bactérienne.

Imagerie RICL sécrétion d'enquêter sur l'infection cellulaire par le pathogène bactérien

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