Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des feuillets cellulaires pour construire un patch tissulaire génie-équipé. Cela est réalisé en traitant tout d'abord la surface de culture cellulaire avec le polymère thermo-sensible polypropylacrylamide, également appelé pNIPAM. La deuxième étape consiste à cultiver les cellules d'intérêt à forte densité sur la surface revêtue de polymère afin de former des feuillets cellulaires.

Ensuite, les feuillets sont soulevés en abaissant la température de la plaque, ce qui permet aux cellules de se détacher de la plaque sous forme de feuillets cellulaires. La dernière étape consiste à transférer les feuillets cellulaires intacts sans les déchirer vers un dispositif destiné à l'implantation. En fin de compte, une simple microscopie optique peut être utilisée pour démontrer que le feuillet cellulaire a été formé et préservé durant sa manipulation, tout au long de la création d'un matériau tissulaire ingénierisé implantable.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui consistent à intégrer des cellules dans des matrices telles que les hydrogels, réside dans le fait que, avec cette technique, les bords latéraux des cellules peuvent être générés et maintenus comme un tissu fonctionnel. Ces méthodes peuvent également permettre des recherches supplémentaires dans le domaine du génie tissulaire. Par exemple, dans quelle mesure les cellules survivent-elles après la transplantation lorsqu'elles se trouvent dans cet état organisé ?

Le Dr. William Turner, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, et Mlle. Snapshot sand do, démontreront cette procédure. Pour commencer, dissoudre 2,6 grammes de P nipam dans deux millilitres d'une solution à 60 % de toluène et 40 % d'hexane. Ensuite, chauffer le mélange à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes et agiter jusqu'à ce que le P nipam soit complètement dissous.

Ensuite, découper le papier filtre en un cercle de 60 millimètres de diamètre et le placer dans un entonnoir de Büchner. Filtrer la solution à travers l'entonnoir de Büchner dans un bécher en verre préalablement pesé. Conserver le bécher et son contenu sous vide dans une cloche pendant toute la nuit.

Ensuite, peser le bécher contenant le p NIPAM. Ajouter ensuite de l'alcool isopropylique au P NIPAM afin d'obtenir une solution poids/poids 50/50. Placer ensuite deux millilitres de la solution à la surface de la plaque de culture tissulaire et l'irradier pendant cinq minutes sous lumière UV pour assurer le revêtement.

Ensuite, lavez la plaque avec deux millilitres de PBS chaud deux fois avant de l'utiliser pour la culture cellulaire. Dans cette procédure, commencez par isoler les cellules musculaires lisses aortiques du rat en lavant les cellules avec deux millilitres de PBS chaud. Ajoutez ensuite trois millilitres de trypsine ou d'une autre solution dissociante clivable aux cellules et incubez pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu de culture ou de PBS contenant 10 % de FBS aux cellules. Après cela, récupérez les cellules dans un tube conique et comptez-les. Ensuite, centrifugez les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans le milieu de croissance. Ensuite, déposez le milieu contenant les cellules sur une plaque thermo-sensible de 35 millimètres à une concentration permettant d'atteindre une confluence de 100 %, puis incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius pour maintenir l'adhérence cellulaire à la plaque. Prélève maintenant les cellules endothéliales et disperse-les en une solution monocellulaire.

Un tampon de dissociation cellulaire contenant de la trypsine 1×, ou un tampon de dissociation cellulaire aiguë, peut également être utilisé pour la dispersion en cellules individuelles. Ensuite, inactiver l'enzyme trypsine à l'aide d'une quantité égale d'inhibiteur de la trypsine issu de soja ou de 10 % de FBS dans du PBS. Puis recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et calculez le volume nécessaire en fonction des dimensions du patch ; pour un patch de quatre millimètres, utilisez 2 millions de cellules endothéliales. Ensuite, prélève 2 millions de cellules et place-les dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifugez ensuite les cellules pendant cinq minutes, aspirez le surnageant, en laissant les cellules sous forme de culot dans le tube conique. Préparez maintenant le gel hydrogel haut aurine selon le protocole du fabricant.

Mélanger l’aurine forte et la gélatine liquide en rapport un pour un. Ensuite, transférer 80 % du volume final total dans le tube conique contenant le culot, puis resuspendre les cellules endothéliales dans le mélange d’aurine forte et de gélatine. Puis, transférer les cellules en suspension dans la matrice fibreuse.

Ajouter 20 % du volume final total du réticulateur et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. À cette étape, retirer la plaque traitée de 35 millimètres en P nypa contenant les cellules de l’incubateur et la placer dans une hotte de culture cellulaire. À température ambiante, aspirer rapidement le milieu des cellules.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de gélatine normale à 6 % à 37 degrés Celsius sur la plaque, pendant que la gélatine est encore chaude, placez le treillis métallique dans la gélatine en l'immergeant sous la surface de la gélatine normale. Par la suite, placez l'ensemble de la plaque sur de la glace pendant cinq à sept minutes, afin de permettre à la gélatine de durcir. Au bout de sept minutes, utilisez une spatule pour séparer délicatement les bords de la gélatine du côté de la plaque.

Ensuite, soulevez le treillis métallique depuis la plaque à l’aide de pinces. Transférez la feuille de cellules dans la boîte et placez-la au-dessus du mélange d’hydrogel matriciel fibreux. Ajoutez deux millilitres de milieu à 37 degrés Celsius dans la plaque de culture tissulaire et incubez toute la nuit pour permettre à la feuille de cellules d’adhérer à la surface de l’hydrogel.

Entre-temps, retirez le treillis métallique une fois que la solution s’est réchauffée. Ici, les cellules ont été cultivées sur une surface revêtue de Pippa, puis transférées en tant que feuillet sur la surface de la matrice fibreuse. De premiers essais qui n’avaient pas été transférés avec le treillis métallique de gélatine ont abouti à de petites plaques déchirées.

Cette image représente une image composite de conception précoce de patch combinant le marqueur mito, des cellules musculaires lisses aortiques de rat colorées en rouge, des cellules endothéliales humaines veinées ombilicales marquées au calcium am vert fluorescent, et l’image en lumière transmise. Il s’agit ici de la combinaison de la feuille cellulaire associée à l’hydrogel de matrice fibreuse de base renforcée. Cette image composite a été prise depuis le fond du patch à travers une matrice fibreuse de base renforcée, et cette image composite des feuillets cellulaires a été prise au-dessus de la matrice fibreuse de base.

Les cellules de la combinaison en hydrogel dans la feuille recouvrent la matrice fibreuse de base en hydrogel, présentant une fluorescence accrue aux bords en raison de l'agglutination des cellules. Il s'agit d'une image en transmission de la structure, et la matrice naturelle fibreuse de base autofluorescente en DPI est montrée ici. Suite à cette procédure, d'autres expériences en ingénierie tissulaire peuvent répondre à d'autres questions, comme l'impact de l'alignement et de la communication cellulaires sur le succès de la transplantation.

Cette technique permet aux chercheurs en ingénierie tissulaire d'explorer des méthodes complexes de transplantation de plusieurs types cellulaires. N'oubliez pas que le travail avec des solvants peut être extrêmement dangereux. Des précautions, telles que le port de masques appropriés et l'utilisation de hottes chimiques, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.