Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des feuilles de cellules pour construire un patch issu de l’ingénierie tissulaire. Ceci est accompli en traitant d’abord la surface de la culture cellulaire avec le polymère thermosensible poly propyl acrylamide, également appelé p nipam. La deuxième étape consiste à cultiver les cellules d’intérêt à haute densité sur la surface recouverte de polymère pour créer des feuilles de cellules.

Ensuite, les feuilles sont soulevées en abaissant la température de la plaque, ce qui permet aux cellules de se détacher de la plaque comme une feuille de cellules. La dernière étape consiste à déplacer les feuilles de cellules intactes sans les déchirer sur une construction pour l’implantation. En fin de compte, la microscopie optique simple peut être utilisée pour montrer que la feuille cellulaire a été créée et maintenue pendant sa manipulation tout en créant un matériau implantable issu de l’ingénierie tissulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui intégreront des cellules dans une matrice comme des hydrogels, est que dans cette technique, les frontières latérales des cellules peuvent être générées et maintenues comme un tissu fonctionnel. Ces méthodes peuvent également permettre d’approfondir les études dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Par exemple, dans quelle mesure les cellules survivent-elles après la transplantation lorsqu’elles sont dans cet état organisé ?

La démonstration de cette procédure sera assurée par le Dr William Turner, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, et Mme Snapshot sand do. Pour commencer cette procédure, dissolvez 2,6 grammes de P nipam dans deux millilitres d’une solution de toluène à 60 % et d’hexane à 40 %. Ensuite, chauffez le mélange à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes et remuez jusqu’à ce que le P nipam soit dissous.

Coupez ensuite le papier filtre en un cercle de 60 millimètres de diamètre et placez-le dans un entonnoir de buchner. Filtrez la solution à travers l’entonnoir Buchner dans un bécher en verre pré-pesé. Conservez le bécher et son contenu dans un aspirateur à cloche pendant la nuit.

Ensuite, pesez le bécher avec du pnipam. Ajoutez ensuite de l’alcool isopropylique au P nipam pour créer une solution de poids 50 50. Ensuite, placez deux millilitres de solution sur la surface de la plaque de culture tissulaire et enduisez-la pendant cinq minutes sous la lumière UV.

Ensuite, lavez deux fois la plaque avec deux millilitres de PBS chaud avant de l’utiliser pour la culture cellulaire. Dans cette procédure, isolez d’abord les cellules musculaires lisses aortiques du rat en lavant les cellules avec deux millilitres de PBS chaud. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine ou une autre solution de dissociation de clivage aux cellules et incubez pendant cinq minutes.

Ajoutez ensuite trois millilitres de milieu de culture ou de PBS contenant 10 % de FBS aux cellules. Après cela, collectez les cellules dans un tube conique et comptez-les. Ensuite, faites tourner les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu de croissance. Ensuite, placez le milieu contenant les cellules sur une plaque thermosensible de 35 millimètres à une concentration qui atteindra 100 % de confluence, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour maintenir l’adhérence de la cellule à la plaque. Maintenant, collectez les cellules endothéliales et dispersez-les dans une solution unicellulaire.

L’utilisation d’un tampon de trypsine, d’acuate ou de dissociation cellulaire pourrait également être utilisée pour la dispersion de cellules uniques. Ensuite, désactivez l’enzyme trypsine avec une quantité égale d’inhibiteur de trypsine de soja ou 10 % de FBS dans le PBS. Collectez ensuite les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculez le volume nécessaire pour les dimensions du patch pour un patch de quatre millimètres, 2 millions de cellules endothéliales sont utilisées après cela, extrayez 2 millions de cellules et placez-les dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant cinq minutes, aspirez le surnageant, laissant les cellules sous forme de pastille dans le tube conique. Préparez maintenant l’hydrogel à haute teneur en aurine conformément au protocole de l’entreprise.

Mélangez de la gélatine à haute teneur en aurine et de la gélatine liquide dans un rapport de un à un. Transférez ensuite 80 % du volume final total dans le tube conique contenant la pastille, remettez en suspension les cellules endothéliales dans le mélange de gélatine à haute teneur en aurine. Ensuite, transférez les cellules en suspension dans la matrice fibreuse.

Ajouter 20 % du volume final total de l’agent de réticulation et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Dans cette étape, retirez de l’incubateur la plaque traitée au P nypa de 35 millimètres contenant les cellules et placez-la dans une hotte de culture cellulaire. À température ambiante, aspirez rapidement le média des cellules.

Ajoutez ensuite deux millilitres de 37 degrés Celsius, 6 % de gélatine normale dans la plaque pendant que la gélatine est encore chaude, placez le treillis métallique dans la gélatine, en l’immergeant sous la surface de la gélatine normale. Ensuite, placez toute l’assiette sur de la glace pendant cinq à sept minutes, en laissant la gélatine durcir. Après sept minutes, utilisez une spatule pour séparer soigneusement les bords de la gélatine du côté de l’assiette.

Ensuite, soulevez le treillis métallique de la plaque à l’aide d’une pince. Transférez la feuille cellulaire dans la boîte et placez-la sur la combinaison d’hydrogel à matrice fibreuse. Ajoutez deux millilitres de milieu à 37 degrés Celsius dans la plaque de culture tissulaire et incubez pendant la nuit pour permettre à la feuille de cellules d’adhérer à la surface de l’hydrogel.

Pendant ce temps, retirez le treillis métallique une fois que la solution s’est réchauffée. Ici, les cellules ont été cultivées sur une surface recouverte de Pippa, puis déplacées sous forme de feuille à la surface de la matrice fibreuse. Les premiers essais qui n’ont pas été transférés avec le réseau de gélatine métallique ont donné lieu à de petites taches en lambeaux.

Cette image représente une image composite de conception précoce combinant le traqueur mito, les cellules musculaires lisses aortiques de rat teintées en rouge, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine fluorescentes vertes et l’image en lumière transmise. Et il s’agit du composite de feuille cellulaire combiné à la combinaison d’hydrogel à matrice fibreuse de base plus forte. Cette image composite a été prise du bas de la plaque à travers une matrice fibreuse de base plus forte, et cette image composite des feuilles de cellules a été prise sur la matrice fibreuse de base.

Les cellules combinées d’hydrogel dans la feuille recouvrent la combinaison d’hydrogel à matrice fibreuse de base, qui présente une fluorescence accrue sur les bords en raison de l’agrégation des cellules. Il s’agit d’une image de transmission de la construction et la matrice de base fibreuse naturelle autofluorescente en DPI est montrée ici. Après cette procédure, d’autres expériences d’ingénierie tissulaire peuvent répondre à d’autres questions telles que comment l’alignement et la communication des cellules affectent le succès de la transplantation.

Cette technique permet aux chercheurs en génie tissulaire d’explorer des méthodes complexes de transplantation de plusieurs types de cellules. N’oubliez pas que travailler avec des solvants peut être extrêmement dangereux. Des précautions, telles que le port de masques appropriés et de cagoules chimiques, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.