Name: Ingénierie tissulaire: Construction dun échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Apprenez à construire un échafaudage 3D multicellulaire pour l'ingénierie tissulaire en utilisant des feuilles cellulaires et des polymères thermosensibles. Cette méthode permet de créer des patchs implantables avec intégrité cellulaire préservée.

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Ce travail a été financé par un New Faculty Award II du California Institute of Regenerative Medicine (CIRM ; RN2-00921-1), la bourse nationale de recherche financée par les NIH (F32-HL104924) et la subvention de formation du CRIEM (TG21163). Le matériel a été fourni par : Glycosan Biosystems Inc / BioTime et le Dr Stephen Badylak (Université de Pittsburgh)

1 Création de plaques PNIPAAm revêtues <ol><li> Dissoudre 2,6 g de PNIPAAm dans 2 ml d&#39;une solution / 40% d&#39;hexane à 60% dans le toluène. </li><li> Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min sous agitation, jusqu&#39;à ce que l&#39;on dissout PNIPAAm. </li><li> Couper le papier filtre dans un cercle de 60 mm de diamètre et placez le papier dans l&#39;entonnoir de Büchner. </li><li> Filtrer la solution à travers un entonnoir de Büchner dans le bécher pré-pesée verre (ne pas utiliser des matières plastiques, comme l&#39;hexane fera fondre les plastiques). </li><li> Placer le bécher et contenu dans un vide de cloche (24 psi) O / N (16 h). Note: Jusqu&#39;à ce que le résidu est traité avec isopropylique il s&#39;oxyde alors assurez-vous qu&#39;il n&#39;entre pas en contact avec l&#39;oxygène. </li><li> Peser le bécher pour déterminer la masse de la PNIPAAm. </li><li> Ajouter de l&#39;alcool isopropylique à la PNIPAAm, la création d&#39;un 50/50 p / p de la solution. </li><li> Placer 2 ml de la solution sur la surface de la plaque de culture de tissu, et le pelage pendant 5 min sous une lampe UV. </li><li> Laver la plaque avec 2 ml de PBS chaud deux foisavant de l&#39;utiliser pour la culture cellulaire. </li></ol> 2 Création de feuilles cellulaires Remarque: feuilles cellulaires de cellules primaires pour l&#39;organe cible peuvent être créés en utilisant un certain nombre de méthodes différentes, ou par le revêtement de surfaces de culture de tissu de polymère thermo-sensible comme décrit ici. Plaques thermo-sensible pré-enrobées sont également offerts par un certain nombre de fournisseurs. Remarque: Ce protocole est de culture en utilisant une boîte de 35 mm. Brièvement, les cellules sont d&#39;abord mises en incubation à 37 ° C pendant un minimum de 24 h à confluence pour établir des connexions latérales entre les cellules adjacentes. Pour détacher les feuilles de cellules, les plaques sont soumises à des températures inférieures à 32 ° C. Le tapis cellulaire est ensuite transféré dans la matrice fibreuse de base forte contenant un hydrogel permissive néovasculaire avec des cellules endotheliales vasculaires. <ol><li> Isoler la population de cellules. Remarque: cette méthode dépend des procédures de dérivation individuels et le type de cellules. Rat mu lisse aortiquedes cellules sub-aigu (RASMC) sont utilisés dans cet exemple. Ce sont des primaires de cellules musculaires lisses isolées de l&#39;aorte abdominale d&#39;un rat. </li><li> Laver les cellules avec 2 ml de PBS chaud. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine (ou autre / solution dissocier de clivage) sur les cellules pendant 5 min. </li><li> Inhibition de la trypsine par addition de 3 ml de milieu de culture, ou une solution tampon phosphate (PBS) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS). </li><li> Les cellules dans un tube conique et compter une aliquote. </li><li> Faites tourner les cellules à 1000 rpm (228 xg) pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans leur milieu de croissance (milieu de culture SmGM2 plus kit balle est utilisé pour RASMC). </li><li> Placer le support contenant les cellules sur une plaque thermo-sensible 35 mm - PNIPAAm plaque revêtue à une concentration qui permettra d&#39;atteindre 100% de confluence. Remarque: Pour CMLAR ce nombre a été déterminé que 100 000 cellules / cm 2. Toutefois, en raison de la perte de cellules lors de la transmission, que 120% de VA<html> lue est utilisée. </li><li> Placer dans un incubateur à 37 ° CO / N. Remarque: il est important de maintenir les cellules à 37 ° C pour maintenir l&#39;adhérence cellulaire de la plaque. </li></ol> 3 Préparation de Matrix Foundational Remarque: Plusieurs matrices fibreuses 3D peuvent être utilisés pour la couche solide matrice fibreuse entre les feuilles de cellules délicates. Voici quelques exemples: gelfoam, bioverre, matériaux naturels acellularized 26 ou nanospun matériaux 27,28 Le porc urinaire matrice de la vessie (UBM) utilisée dans ces études a été généreusement fourni par notre collaborateur, le Dr Badylak 29. <ol><li> Avant d&#39;utiliser, de déterminer les caractéristiques de la matrice, y compris le manque de contenu cellulaire si matrice décellularisé est utilisée, 27,28 viabilité cellulaire spécifique, et un espace vide. 22 </li><li> Couper la matrice de pré-stérilisé dans une taille et une forme souhaitées. Note: Ici, un poinçon est utilisé pour découper un cercle de 4 mm de diamètre. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4. Cellules endothéliales ensemencement dans un néovasculaire permissive hydrogel Remarque: Les cellules endotheliales peuvent être obtenus à partir d&#39;une variété de sources, y compris la différenciation de cellules souches ou progénitrices. Ici, on utilise des cellules HUVEC. <ol><li> Utilisation tout hydrogel permissive (de fibrine, des gels de collagène) aussi longtemps que le temps de reticulation est suffisamment courte pour que les cellules restent viables. Remarque: ici, un gel acide hyaluronique (HA) réticulé à base d&#39;un pont disulfure est utilisé. </li><li> Préparer l&#39;hydrogel HA en conformité avec le protocole de la société. </li><li> Recueillir les cellules endothéliales et les disperser dans une solution à une seule cellule à l&#39;aide de la trypsine 1x. Remarque: Accutase ou tampon de dissociation cellulaire peuvent également être utilisés pour la dispersion de la cellule unique. </li><li> Désactiver l&#39;enzyme de la trypsine en utilisant une quantité égale d&#39;inhibiteur de trypsine de soja (si il est important que les cellules ne sont pas en contact avec le sérum) ou 10% de FBS dans du PBS, la collecte de la solution / cellules dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Contant les cellules, et de calculer le volume nécessaire pour les dimensions de raccordement (auparavant quantifiés). Remarque: Pour un patch de 4 mm, ici de 2 millions de cellules endothéliales sont utilisés. </li><li> Extrait 2 millions de cellules, et la placer dans un nouveau tube de 15 ml conique. </li><li> Spin au (228 xg) pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant, ce qui laisse les cellules en culot dans un tube conique. </li><li> Mélangez les matières liquides de HA et de la gélatine dans un rapport 1: 1 ration. Ensuite, ajouter 80% du volume total dans le tube conique contenant le culot. </li><li> Remettre en suspension les cellules endothéliales dans le mélange 1: 1 HA / Gélatine </li><li> Mettre les cellules en suspension dans le mélange HA / gélatine dans la matrice fibreuse de base à partir de l&#39;étape 2. </li><li> Ajouter cinquième (20 pour cent) du volume total souhaité de l&#39;agent de réticulation </li><li> Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li></ol> 5 Isolation de feuilles cellulaires <ol><li> Retirez les plaques de 35 mm PNIPAAm traités contenant les cellules de l&#39;incubateur et le placer dans une hotte de culture cellulaire àRT. </li><li> Aspirer rapidement les médias à partir des cellules, et ajouter 2 ml de 6% de gélatine normale qui a été chauffée à 37 ° C. </li><li> Bien que la gélatine est encore chaud, placer le treillis métallique dans la gélatine, la plongeant sous la surface de la gélatine normale (Film 1). </li><li> Placer la totalité de la plaque sur de la glace pendant 5 à 7 minutes, ce qui permet la gélatine à durcir. </li><li> Après 7 minutes, utiliser une spatule pour bien séparer les bords de gélatine sur le côté de la plaque, puis utilisez une pince pour soulever le treillis métallique de la plaque Remarque: Le 6% de gélatine, et la feuille de cellules devrait soulever avec le réseau. </li><li> Déplacer la feuille de cellules dans le plat et placer sur le dessus de la combinaison de matrice hydrogel base fibreuse, définissant avec soin le réseau au-dessus de la construction. Remarque: Le côté apical de la feuille de cellule sera toujours en position haute. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu chaud (37 ° C). </li><li> Incuber O / N permettre à la feuille de cellules d&#39;adhérer à la surface de l&#39;hydrogel. </li><li> Retirer til treillis métallique après que la solution se réchauffe (environ 1 heure), ou le jour suivant. </li></ol>

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Nous n’avons rien à divulguer.

Les étapes critiques du protocole comprennent: le revêtement des surfaces de la plaque avec le polymère thermosensible et la manipulation des feuilles de cellules après refroidissement des plaques. Parce que les cellules présentent différentes propriétés physiques différentes, comme l&#39;adhésivité, le temps de levée doit être optimisée pour chaque type de cellule différent. La seconde, et la plus significative difficile composante de ce protocole, se concentre sur la manipulation de la feuille de cellule, un aspect cr...

L’injection de cellules et/ou de matériaux uniques seuls a montré un succès variable dans d’autres systèmes organiques et un succès limité dans la régénération cardiaque. 5,7-12 À l’heure actuelle, les cellules dérivées de cellules souches sont administrées aux tissus endommagés à l’aide de diverses méthodes d’administration, notamment l’injection directe de cellules dans les tissus et la perfusion dans l’approvisionnement en sang. 13-17 D’autres ont implanté des cellules seules, des matériaux seuls et/ou en combinaison avec des supports de matériaux pour aider à régénérer les organes endommagés. 18-21 Cette conception combine plusieurs stratégies qui fournissent la résistance du matériau, la structuration de plusieurs matériaux et plusieurs types de cellules. 
Plus précisément, la matrice fibreuse acellularisée basique fournit la force physique fondamentale à la construction, ce qui la rend apte à la suture chez le patient, si nécessaire. Les espaces vides dans la matrice de base sont remplis de cellules endothéliales dans un hydrogel permissif néovasculaire22 pour établir rapidement la vascularisation de la construction implantée. Ce composite est ensuite intégré à des feuilles de cellules pré-structurées qui permettent une meilleure communication de cellule à cellule, imitant plus étroitement le tissu natif. 1,23-25 Le processus global de production du patch cellulaire en couches est décrit par l’organigramme de la figure 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>Cell tracker / colorant vivant</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Cell tracker</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Visible Cell dye</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-isopropylacrylamide)</td></tr><tr><td>Toluène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>Cellules musculaires lisses de l’aorte du rat</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Muscle lisse Média</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>Cellules endothéliales veineuses humaines</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan/ Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Specific Equipment</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Ahlstrom&nbsp ;</td><td>6310-0900&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Entonnoir Buchner&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>Z247308&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques UpCell&nbsp ;</td><td>Nunc&nbsp ;</td><td>2014-11&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lumière UV</td><td>Jelight Company&nbsp ;</td><td>Nettoyeur UVO Modèle n° 42</td><td></td></tr></tbody></table>

ingénierie tissulaire: construction d&#39;un échafaudage 3d multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Beaucoup de tissus, comme les adultes cœurs humains, sont incapables de se régénérer correctement après dommages. 2,3 Stratégies en ingénierie tissulaire proposent des innovations pour aider le corps dans la récupération et la réparation. Par exemple, les approches TE peuvent être en mesure d&#39;atténuer le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde (IM) et peut-être augmenter la fonction cardiaque totale à un niveau MI pré proche de la normale. 4 Comme avec n&#39;importe quel tissu fonctionnel, réussite de la régénération du tissu cardiaque implique la bonne exécution de plusieurs types de cellules avec des signaux environnementaux qui favorisent l&#39;intégration et la survie de la greffe de cellules / tissus implantés. Tissus d&#39;ingénierie devraient aborder plusieurs paramètres dont: signaux solubles, les interactions cellule-cellule et matériaux de matrice évalués comme les véhicules de livraison, de leurs effets sur la survie de la cellule, la résistance des matériaux, et la facilitation de l&#39;organisation de cellule à tissu. Des études utilisant l&#39;injection directe de cellules du greffon seulement ignorer ces éléments essentiels. 2,5,6Une conception de tissu combinant ces ingrédients n&#39;a pas encore été développé. Ici, nous présentons un exemple de superposition à l&#39;aide des dessins intégrés de feuilles de cellules à motifs avec deux types de matières biologiques contenant des dérivés du type cellulaire organes cibles et des cellules endothéliales pour l&#39;amélioration de la formation de nouveaux vaisseaux dans le &quot;tissu&quot;. Bien que ces études se concentrent sur la production de tissu cardiaque comme, cette conception de tissu peut être appliquée à de nombreux autres organes que le coeur de la conception et matérielles des changements minimes, et est censé être un produit hors-the-shelf pour les thérapies régénératrices. Le protocole contient cinq étapes détaillées. Une température Poly sensible (N de -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) est utilisé pour des boîtes de culture de tissus de la robe. Ensuite, les cellules sont mises en culture tissulaire spécifique sur la surface des plaques revêtues de motif fin / des surfaces pour former des feuilles de cellules avec de fortes adhérences latérales. En troisième lieu, une matrice de base est créé pour le tissu en combinant la matrice poreuse avec Permissi néovasculaireve hydrogels et les cellules endothéliales. Finalement, les feuilles de cellules sont soulevées à partir des boîtes revêtues PNIPAAm et transférées à l&#39;élément de base, ce qui rend l&#39;assemblage complet.

Le diagramme de flux (figure 1) illustre le procédé global de fabrication de la plaque à couches multiples. les feuilles de cellules sont détachées de la plaque traitée PNIPAAm en laissant tomber la température en dessous de 32 ° C. Ensuite, la feuille de cellules est placée au-dessus de l&#39;hydrogel réticulé contenant des cellules endothéliales ensemencées sur la matrice fibreuse sous-jacente (figure 1). Les plaques thermo-sensible prétraitées peuvent également être utilisés pour la ...

Pour créer des structures hautement organisées de tissus complexes, il faut assembler plusieurs types de matériaux et de cellules en un composite intégré. Cette conception combinatoire intègre des feuilles de cellules stratifiées spécifiques à un organe avec deux matériaux distincts d’origine biologique contenant une base de matrice fibreuse solide, et des cellules endothéliales pour améliorer la formation de nouveaux vaisseaux.

Ingénierie tissulaire: Construction d&#39;un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des feuillets cellulaires pour construire un patch tissulaire génie-équipé. Cela est réalisé en traitant tout d'abord la surface de culture cellulaire avec le polymère thermo-sensible polypropylacrylamide, également appelé pNIPAM. La deuxième étape consiste à cultiver les cellules d'intérêt à forte densité sur la surface revêtue de polymère afin de former des feuillets cellulaires.Ensuite, les feuillets sont soulevés en abaissant la température de la plaque, ce qui permet aux cellules de se détacher de la plaque sous forme de feuillets cellulaires. La dernière étape consiste à transférer les feuillets cellulaires intacts sans les déchirer vers un dispositif destiné à l'implantation. En fin de compte, une simple microscopie optique peut être utilisée pour démontrer que le feuillet cellulaire a été formé et préservé durant sa manipulation, tout au long de la création d'un matériau tissulaire ingénierisé implantable.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, qui consistent à intégrer des cellules dans des matrices telles que les hydrogels, réside dans le fait que, avec cette technique, les bords lat

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Dans ce travail, nous présentons une technique de fabrication rapide de tissus vasculaires vivants par culture directe de collagène, de cellules musculaires lisses et de cellules endothéliales. De plus, un nouveau protocole pour la caractérisation mécanique des tissus vasculaires modifiés est décrit.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Une bio-imprimante cartésienne a été conçue et fabriquée pour permettre le dépôt de plusieurs matériaux dans des géométries précises et reproductibles, tout en permettant le contrôle des facteurs environnementaux. À l’aide de la bio-imprimante tridimensionnelle, des constructions complexes et viables peuvent être imprimées et facilement reproduites.

Viabilité de Bioprinted cellulaires constructions Utilisation d&#39;une imprimante cartésienne Distributeur Trois

Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

Dans ce travail, des échafaudages en poly(acide lactique)/polyéthylène glycol (PLA/PEG) ont été préparés en utilisant une combinaison de mélange à l’état fondu et de lixiviation sélective. La méthode décrite ici a permis de développer des échafaudages à trois couches en contrôlant fortement à la fois la porosité et la taille des pores. Les propriétés mécaniques ont également été évaluées dans un environnement physiologique.

A Facile et écologique Route pour fabriquer poly (acide lactique) Échafaudages avec Graded Pore Taille

Nous démontrons une nouvelle méthode pour la construction d’une single-cell-based 3 Dimensions (3D) l’Assemblée sans un échafaudage artificiel.

Manipulation de cellules vivantes pour construire Stable Assemblée cellulaire 3D sans échafaudage artificiel

Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.

Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Cet article fournit une méthode efficace et réalisable pour la construction de plusieurs couches de cellules souches feuilles dont la propriété des cellules souches favorables.

Construction d’une feuille les cellules souches mésenchymateuses multicouche avec un système de Culture dynamique 3D

Présenté ici est un simple à utiliser, core / coquille, en trois dimensions bioimpression mise en place pour la fabrication en une étape d'échafaudages creux, adapté à l'ingénierie tissulaire de structures vasculaires et autres tubulaires.

Échafaudages d'impression de noyau/coquille pour l'ingénierie tissulaire des structures tubulaires

Dans cet article, nous démontrons un modèle organoïde en trois étapes (expansion bidimensionnelle [2D], stimulation 2D, maturation tridimensionnelle [3D]) offrant un outil prometteur pour la recherche fondamentale sur les tendons et une méthode potentielle sans échafaudage pour l’ingénierie tissulaire des tendons.

Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

Échafaudages électrofilées peuvent être traitées de post-production pour les applications d'ingénierie tissulaire. Nous décrivons ici les méthodes de filature échafaudages complexes (par filage consécutives), pour faire plus épais échafaudages (par le multi-couches en utilisant la chaleur ou de vapeur recuit), pour atteindre la stérilité (production aseptique ou la stérilisation post-production) et pour la réalisation appropriées des propriétés biomécaniques.

Traitement post-production des fibres électrofilées de génie tissulaire

Apprenez à construire un échafaudage 3D multicellulaire pour l'ingénierie tissulaire en utilisant des feuilles cellulaires et des polymères thermosensibles. Cette méthode permet de créer des patchs implantables avec intégrité cellulaire préservée.

Ingénierie tissulaire: Construction d'un échafaudage 3D multicellulaire pour la livraison de stratifiés feuilles cellulaires

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