Simulation pancréatique neuroplasticité:

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les modifications réactives des neurones périphériques dans différents microenvironnements pancréatiques. Cette étude est réalisée en préparant d'abord des extraits totaux de tissus provenant de pancréas humain normal et de tissu pancréatique malade. Dans un deuxième temps, des cellules du ganglion rachidien (DRG) sont isolées à partir de rats nouveau-nés, puis traitées avec les extraits tissulaires isolés.

Ensuite, après une incubation de 48 heures, les cellules sont fixées en vue d'une coloration double par immunofluorescence ultérieure. Les résultats montrent les différences dans le motif de ramification de la densité des neurites et dans la densité gliale des neurones cultivés dans différents extraits tissulaires. Cette méthode peut aider à faciliter les études dans le domaine de la neurogastroentérologie, telles que le rôle des médiateurs moléculaires ou des altérations neuroplastiques dans différentes maladies gastro-intestinales.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les différentes propriétés neurotrophiques des maladies pancréatiques, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cancers ou les états inflammatoires de tout le tractus digestif. Nous avons eu pour la première fois l'idée d'utiliser cette méthode lorsque nous avons commencé nos collaborations avec des chercheurs spécialisés dans les maladies neuropathiques du système pédiatrique, comme la maladie de Ong, et nous l'avons adaptée à nos besoins afin d'homogénéiser le tissu pancréatique humain. Transférez des cubes de tissu pancréatique de cinq par cinq par cinq millimètres directement de moins 80 degrés Celsius vers l'azote liquide.

Ensuite, placer les blocs congelés d'abord dans des tubes d'homogénéisation pouvant contenir une bille métallique de dissociation, puis dans l'homogénéisateur de tissus, homogénéiser sans permettre au tissu de décongeler immédiatement après la dissociation. Resuspendre la poudre solide, de type homogénat, dans 300 à 500 microlitres de PBS 0,1 X glacé. Ne pas utiliser de tampon de lyse car cela pourrait.

Lysatisez les neurones, puis centrifugez l'homogénéat à 21 130 ×g à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Récupérez le surnageant clair, qui contient l'extrait tissulaire, afin de collecter le surnageant de lignée cellulaire à partir de lignées cellulaires pancréatiques humaines. Culturez les cellules jusqu'à une confluence d'au moins 70 à 80 % dans un milieu de croissance normal.

Lorsqu'elles sont prêtes, laver les cellules au moins trois fois avec du PBS de qualité pour culture cellulaire et les cultiver dans un milieu sans sérum pendant 48 heures au maximum. Ensuite, mesurer la concentration en protéines de l'homogénat tissulaire ou des surnageants de lignée cellulaire à l'aide du dosage des protéines de Bradford. Puis aliquoter les extraits tissulaires et les surnageants de lignée cellulaire de sorte que la concentration finale de l'extrait ou du surnageant dans le milieu neuronal soit de 100 microgrammes par millilitre.

Et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. À l’aide d’un rat nouveau-né décéphalé de P2 à P12, incisez la peau et exposez la colonne vertébrale. Ensuite, réalisez une laminectomie antérieure pour exposer la moelle épinière.

Ensuite, exposer et retirer les ganglions de la racine dorsale ou les DRG. Placer le DRG dans du milieu MEM glacé additionné de gentamicine et de métronidazole. Continuer à recueillir les DRG, en commençant par les DRG sacrés et en remontant jusqu'aux DRG cervicaux supérieurs.

Lorsque l'opération est terminée, 52 ganglions racinaires dorsaux sont collectés, ce qui est suffisant pour une plaque de 24 puits. Ensuite, utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour séparer les ganglions racinaires dorsaux de leurs racines et nerfs. Puis retirez toutes les projections périphériques et centrales résiduelles.

Après la collecte des ganglions racinaires dorsaux, les incuber dans du HBSS additionné de collagénase de type II à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Après l'incubation, triturer les ganglions racinaires dorsaux à l’aide de seringues de diamètre décroissant.

Remarquez que la trypsine excessive peut détruire les neurones, mais est moins destructrice pour les cellules gliales. Une fois que le milieu contenant les ganglions de la racine dorsale est devenu trouble, centrifugez la suspension à 93,9 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le milieu et resuspendez.

Suspendez les cellules dans un milieu neurobasal afin de préparer les cellules pour la culture. Utilisez un hémocytomètre pour estimer le nombre total de neurones et de cellules gliales. Ensuite, ensemencez les cellules sur des lamelles pré-recouvertes de 13 millimètres.

Dans une plaque de 24 puits, le revêtement utilisé dépend des objectifs expérimentaux. Ensuite, recouvrez les puits de milieu basal neuro et laissez les cellules s'attacher aux puits toute la nuit. Le jour suivant, décongelez le milieu supplémenté en extrait de tissu ou le milieu supplémenté en surnageant de lignée cellulaire.

Ensuite, aspirez le milieu de semis des ganglions racinaires dorsaux et effectuez un lavage optionnel, très doux, au PBS. Puis, pipetez lentement le tissu, le milieu supplémenté en extrait tissulaire ou le milieu surnageant de lignée cellulaire supplémenté sur les cellules afin d'obtenir 100 microgrammes par millilitre. Laissez maintenant les cellules croître pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans le milieu contenant l'extrait tissulaire ou le surnageant de lignée cellulaire, après 48 heures.

Aspirez le milieu et fixez avec du paraformaldéhyde à 4 % pour la coloration immunohistochimique. Pour la double coloration immunofluorescente, utilisez des marqueurs spécifiques des neurones et spécifiques des cellules gliales pour l'analyse morphogéométrique. Utilisez un microscope optique inversé équipé d'une caméra CCD, combiné à un logiciel automatisé, pour mesurer la densité des neurites en utilisant un grossissement de 200 x.

Mesurer la densité des neurites dans les cultures neuronales en superposant une grille de 50 par 50 micromètres et en comptant la densité des fibres par carré, mesurée d'après les fibres intersectant la grille. Répéter cette analyse sur quatre régions distinctes présentant la croissance la plus dense, sur quatre à cinq microphotographies représentatives pour chaque lame. Mesurer l'extension moyenne des neurites, le nombre moyen de branches par neurone, la longueur moyenne des branches et la taille périanale à partir de 30 neurones isolés choisis aléatoirement sur chaque lame, en marquant les neurites et les neurones périphériques. Des ganglions de la racine dorsale (DRG) cultivés avec un extrait tissulaire de pancréas normal sont présentés ici.

En revanche, les neurones du ganglion rachidien cultivés avec des extraits de tissu provenant de pancréatite chronique ou de cancer du pancréas présentent une densité de neurites plus élevée, comme indiqué ici. Voici des neurones du plexus myentérique cultivés avec divers extraits de tissu pancréatique humain.

Les neurones du plexus myentérique cultivés dans des extraits de pancréas atteint de pancréatite chronique ou de cancer du pancréas développent des prolongements plus longs et présentent un schéma de ramification plus complexe que ceux cultivés dans des extraits de pancréas normal. Lorsque des neurones du ganglion de la racine dorsale ont été mis en culture avec le surnageant de cellules cancéreuses du pancréas, une augmentation de la densité nerveuse a également été observée, similaire à celle notée avec les extraits tissulaires. Cette augmentation était toutefois réversible lorsque certains facteurs neurotrophiques sélectionnés, tels que notre tein ou le facteur de croissance nerveuse, étaient épuisés ou bloqués.

Les cellules Ggl répondent également différemment à divers extraits de tissu pancréatique, tels qu'extraits de pancréatite chronique ou de cancer du pancréas, qui stimulent la croissance et augmentent le nombre de cellules gliales dans les cultures de cellules gliales issues de ganglions de la racine dorsale. Bien que l'effet soit plus marqué avec les extraits de cancer du pancréas qu'avec ceux de pancréatite chronique une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures si elle est effectuée correctement après son développement.

Cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurogastroentérologie pour explorer les mécanismes de la neuroplasticité dans diverses maladies gastro-intestinales, notamment les affections inflammatoires et malignes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler des neurones périphériques afin d'étudier la neuroplasticité pancréatique dans le pancréas, ainsi que de la façon d'appliquer ce système et d'autres analyses d'altérations neuronales et de neuroplasticité dans les troubles gastro-intestinaux.