Question 1

Comment l'interférence par ARN fonctionne-t-elle pour silencier les gènes chez C. elegans ?

Accepted Answer

L'ARN double brin pénètre dans les cellules de C. elegans après ingestion. L'enzyme Dicer divise l'ARN ds en ARN interférent court (siRNA), long de 21-23 nucléotides. Le siRNA s'associe au complexe de silencing induit par ARN (RISC) et se lie à l'ARNm cible via un appariement de bases complémentaires, conduisant à la dégradation de l'ARNm et à l'inhibition des gènes.

Question 2

Quelle est la première étape dans la préparation des bactéries pour les expériences d'ARNi?

Accepted Answer

Transformez le plasmide codant votre dsRNA cible dans la souche HT115(DE3) E. coli, qui manque de l'ARN polymérase III et contient un gène de T7 ADN polymérase inductible par IPTG. Transformez également les bactéries avec un plasmide vide comme contrôle. Étalez les bactéries transformées sur des plaques d'agar LB contenant de la tétracycline et de la carbénicilline, puis incubez toute la nuit à 37°C.

Question 3

Pourquoi la synchronisation des vers est-elle importante avant le traitement par RNAi ?

Accepted Answer

Synchroniser les stades développementaux garantit que les différences phénotypiques observées résultent de la réduction des gènes plutôt que de la variation développementale. Transférer les vers L4 sur des plaques RNAi pendant une nuit à 20°C pour devenir de jeunes adultes, puis les déplacer sur de nouvelles plaques pendant 6-8 heures pour pondre des œufs. Cela produit une progéniture synchronisée développementalement pour l'analyse.

Question 4

Comment les chercheurs utilisent-ils le RNAi pour effectuer des dépistages génétiques inverses?

Accepted Answer

Les criblages génétiques inverses suppriment des gènes connus d'une bibliothèque et évaluent les résultats phénotypiques pour découvrir la fonction des gènes. Les chercheurs cultivent des bactéries exprimant de l'ARN double brin pour de nombreux gènes de C. elegans sur des plaques à puits multiples et les donnent en nourriture aux vers. Les effets phénotypiques révèlent les fonctions géniques normales in vivo et peuvent être automatisés pour une analyse à haut débit de milliers de gènes.

Question 5

Que se passe-t-il pendant la phase de préparation de la culture bactérienne?

Accepted Answer

Sélectionnez une seule colonie bactérienne et ajoutez-la à 1 ml de bouillon LB avec 100 μg/ml d'ampicilline. Incubez toute la nuit à 37°C avec agitation. Ensuite, ajoutez 5 ml de bouillon LB frais avec de l'ampicilline et incubez 4-6 heures à 37°C. Cette culture est ensuite ajoutée aux plaques de vers RNAi et incubée toute la nuit à 37°C pour créer une pelouse bactérienne.

Question 6

Quels phénotypes peuvent être observés lors de l'analyse des vers traités par RNAi ?

Accepted Answer

Comparer les vers avec un ARN interférent à ceux des témoins et noter les différences de taille, de stade de développement, de morphologie et de schémas de localisation des protéines marquées de façon fluorescente. Les scientifiques peuvent également évaluer les effets sur le timing du développement, tels que les gènes qui retardent le développement lorsqu'ils sont neutralisés, ou les gènes impliqués dans les organes développement et d'autres processus biologiques.

Question 7

Comment une lame de microscope est-elle préparée pour visualiser C. elegans?

Accepted Answer

Tapotez deux lames de verre avec du ruban adhésif d'étiquetage comme espaceurs. Placez une lame propre entre elles et pipetez 150 μl de 4 % d'agar fondu dessus. Couvrez avec une lame perpendiculaire, puis séparez délicatement. Ajoutez 10 μl d'anesthésique à l'azide de sodium sur le tampon d'agar, transférez les vers à l'aide d'une broche en platine, ajoutez un porte-objets et observez sous un microscope.

Utilisation d'ARN interférent chez Caenorhabditis elegans - Quiz d'évaluation