Name: Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-27T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la coculture amibienne pour isoler de nouveaux agents pathogènes intracellulaires à partir d'échantillons environnementaux ou cliniques. Cette méthode innovante permet d'identifier des bactéries et virus inconnus.

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Nous remercions le Pr. Bernard La Scola pour des conseils techniques utiles et intéressante discussion sur coculture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne. Nous remercions également le Dr Vincent Thomas pour son aide dans la mise en œuvre de la technique dans notre laboratoire.

Une. Amibienne Coculture 1.1 Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Échantillons de l&#39;environnement <ol><li> Les échantillons d&#39;eau Filtrer l&#39;échantillon de l&#39;eau (500 ml à 1 litre) à travers une membrane de taille de pore de 0,22 um. Ensuite, secouer la membrane dans amibe salines moyennes des PAS de la page (120 mg de NaCl, 4 mg de sulfate de magnésium 4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, et 136 mg de KH 2 PO 4 dans 1 litre d&#39;eau distillée). </li><li> Les échantillons solides Remettre en suspension les échantillons solides tels que la terre ou sable échantillons et des échantillons semi-solides telles que des boues activées dans l&#39;eau distillée ou du PBS et les filtrer à travers une membrane de taille de pore de 0,22 um. Ensuite, secouer la membrane PAS. </li><li> Échantillons fortement contaminés par des amibes endogène et protozoaires Première sédimenter les échantillons par centrifugation à basse vitesse (180 x g) for 10 min ou filtrer à travers une membrane de taille de pores de 5 um. Poursuivre le traitement du surnageant (filtrat respectivement), comme au point 1.1.1. Note: D&#39;autres techniques de décontamination peuvent être utilisées pour décontaminer en outre des échantillons environnementaux: Chauffer l&#39;échantillon à 50 ° C pendant 30 min ou traiter avec des solutions acides ou basiques 14. </li></ol></li><li> Échantillon clinique Traiter les échantillons cliniques en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Filtrer ou centrifuger les liquides pour éliminer les grosses impuretés. Remettre en suspension les échantillons solides. Pour utiliser les tissus, les broyer, par exemple en utilisant une homogénéiser Dounce ou des billes de verre, et de lyser les cellules pour libérer les bactéries intracellulaires. </li></ol> 1.2 préparation amibes <ol><li> préparation d&#39;un bouillon Préparer les supports suivants: rich media contenant de la peptone, l&#39;extrait de levure et de glucose (PYG; 100 g de peptone protéose, 10 g d&#39;extrait de levure, 4,9 g de MgSO 4 7H 2 •O, 5 g de citrate de sodium • 2H 2 O, 0,1 g de Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g de KH 2 PO 4, 1,97 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g de glucose, et 0,295 g de CaCl 2 à 5 L d&#39;eau distillée) et un milieu non nutritif tel que PAS pour les espèces Acanthamoeba. </li><li> Culture amibienne <ol><li> Cultiver amibes (Acanthamoeba préférentiellement castellanii ATCC 30010 ou A. polyphaga Linc-AP1) à 25 ° C dans des flacons de culture de cellules contenant 30 ml de milieu PYG. </li><li> Récolter les amibes par agitation vigoureuse de la fiole et centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 x g. Laver le culot deux fois avec du milieu de PAS. Compter les cellules dans une diapositive Kova et régler le volume pour obtenir une suspension de 5 x 10 5 cellules par ml. </li><li> Transférer la suspension amibienne en microplaques. Utilisez 1 ml par puits pour 12 - et 24-wplaques Ell, 500 ul pour des plaques de 48 puits et 300 pl pour plaques à 96 puits. Incuber la microplaque pendant au moins 2 heures à 25 ° C. Ceci permet la sédimentation et la fixation de la amibes au fond de chaque puits. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol><li> inoculation de l&#39;échantillon <ol><li> Inoculer la plaque de 2.3.3 à des dilutions successives de l&#39;échantillon à partir de 1,1 ou 1,2, habituellement avec 10 fois la série de dilution, à partir de 100 ul de l&#39;échantillon non dilué. </li><li> Centrifuger la microplaque à 1800 xg pendant 10 min à sédiments sur la pelouse amibienne les microorganismes potentiellement présents dans l&#39;échantillon. Cela augmente le contact et la phagocytose des micro-organismes par les amibes. </li><li> Incuber les plaques pendant 45 minutes à 25 ° C et laver trois fois avec SAP en remplaçant les médias avec le PAS frais. Ajouter 1 ml par puits de PAS avec ou sans addition d&#39;antibiotiques (streptomycine, de la pénicilline, de gentamicine et / ou à la vancomycine), en fonction de la bactériurieespèces al qui sont recherchées. </li><li> Incuber la microplaque à 32 ° C dans une atmosphère humidifiée pour éviter enkystement du amibes. Observez chaque puits tous les jours avec un objectif 20X pour détecter la présence de bactéries envahissantes et lyse des amibes. </li><li> Dans le cas d&#39;une lyse, effectuer une sous-culture sur des amibes frais par inoculation de 100 ul de co-cultures d&#39;une monocouche d&#39;environ 10 5 amibes / cm 2. Pour isoler spécifiquement une espèce bactérienne donnée, inoculer aussi des médias spécifique agar conçu pour ces bactéries (c.-à-BCYE gélose pour Legionella spp.). </li><li> En l&#39;absence de lyse, prendre 100 pi de co-cultures quatre à sept jours après la première inoculation et inoculer une culture fraîche amibienne de 900 pi dans une plaque de 24 puits. Si la lyse rapide des amibes est observée sans prolifération de bactéries, un virus peut être présent. Dans ce cas, filtrer le surnageant à 0,22 um et utiliser la suspension filtrée pour infecter des amibes frais. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 l&#39;isolement et la caractérisation bactérienne <ol><li> Coloration bactérienne Effectuer co-cultures directement sur des lamelles de verre en microplaques de 24 puits. Retirez le support et effectuer de coloration ou immunofluorescence. <ol><li> Modifié coloration Romanowsky <ol><li> Laissez la lamelle sec. Immerger la lamelle cinq fois dans la solution de fixation (2 mg / L Fast Green dans le méthanol). </li><li> Immerger la lamelle couvre-cinq fois dans la solution de coloration I (1,22 g / L Eosine G dans du tampon phosphate pH 6,6) </li><li> Enfin, immerger la lamelle 5 fois dans la solution de coloration II (1,1 g / L de thiazine dans du tampon phosphate pH 6,6). </li><li> Rincer l&#39;échantillon avec de l&#39;eau distillée. Laissez sécher et observer par microscopie. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen <ol><li> Laissez la lamelle sec. Couvrir l&#39;échantillon avec Ziehl fuchsine. Chauffer le colorant avec une flamme jusqu&#39;à ce que les vapeurs apparaissent. </li><li> Refroidir à la température ambiante pendant au moins 5 minuteset rincer avec de l&#39;eau distillée. Couverture de l&#39;échantillon avec une solution d&#39;acide chlorhydrique à 3% dans l&#39;isopropanol pendant 2 minutes et rincer à l&#39;eau distillée. </li><li> Couvrir pendant 30 secondes avec du bleu de méthylène et rincer avec de l&#39;eau distillée. Laissez sécher et observer par microscopie 22. </li></ol></li><li> Coloration de Gimenez <ol><li> Préparer une solution de base de fuchsine boursier en mélangeant 100 ml de 10% de fuchsine basique (10 g de fuchsine basique dans 100 ml 95% d&#39;éthanol), 250 ml de 4% de phénol aqueux et 650 ml d&#39;eau distillée. Incuber à 37 ° C pendant 48 heures avant utilisation. </li><li> Laissez sécher la lamelle et le fixer en le faisant passer à travers la flamme. Couvrir l&#39;échantillon avec la fuchsine basique fraîchement filtrée (4 ml de solution de base de fuchsine stock dans 10 ml de 0,1 M de tampon phosphate de sodium, pH 7,45) pendant 2 min. </li><li> Rincer l&#39;échantillon avec de l&#39;eau et incuber dans le vert de malachite (0,8% dans l&#39;eau distillée) pendant 10 secondes. Rincer à nouveau avec de l&#39;eau et répéter coloration vert malachite. Rincer à nouveau avec de l&#39;eau. Laissez la lamelle sec, montant, et observer par microscopie 23. </li></ol></li><li> Immunofluorescence <ol><li> Fixer la lamelle couvre-objet par l&#39;incubation dans du methanol pendant 5 minutes, ou avec du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. </li><li> Laver trois fois avec du PBS et incuber pendant 2 heures dans une solution de blocage (5% de BSA, 0,1% de saponine dans du PBS) à température ambiante. </li><li> Incuber la lamelle couvre pendant 1 heure dans une solution de blocage contenant des anticorps dirigés contre le micro-organisme d&#39;intérêt. </li><li> Laver à nouveau trois fois dans du PBS et incuber pendant 1 heure avec un anticorps secondaire dirigé contre l&#39;anticorps primaire et lié à un fluorophore. Laver trois fois avec du PBS, monter la lamelle couvre-objet et d&#39;observer au microscope à fluorescence. </li></ol></li></ol></li><li> la détection de l&#39;ADN par PCR Extraire l&#39;ADN de 100 à 200 ul de coculture amibienne. Détecter des micro-organismes avec des amorces universelles ciblant le gène de l&#39;ARNr 16S ou des amorces spécifiques pour les espèces d&#39;intérêt tels que les mycobactéries 24, 25 légionelles ou les membres de la 26 Chlamydiales. </li></ol> 2. Enrichissement amibienne 2.1. Préparation de l&#39;échantillon Remettre en suspension les échantillons solides et semi-solides dans le PAS par vortex. Centrifuger la suspension à basse vitesse (180 x g) pendant 10 min. Ceci permet l&#39;enrichissement des amibes libres dans le culot. Le surnageant peut être utilisé pour la co-culture amibienne et le culot 21 pour l&#39;enrichissement amibienne. 2.2. Préparation du milieu <ol><li> Ajouter 1,5 g d&#39;agar-agar à 100 ml de PAS et le milieu à l&#39;autoclave 15 min à 121 ° C. Verser le milieu chaud dans des boîtes de Pétri et laisser solidifier à température ambiante. </li><li> Cultiver Escherichia coli (ATCC 25922) dans un bouillon LB ou thioglycolate pendant une nuit à 37 ° C. Laver les bactéries fois avec du PBS et les remettre en suspension dans un milieu de PAS. Diluer 10x à Pas et répandre 2-3 ml de cette dilution sur une plaque de gélose PAS et laisser sécher. </li></ol> Ajouter une goutte de l&#39;échantillon (ou d&#39;un morceau de filtre) sur un côté de la plaque et laisser s&#39;écouler plus de la boîte de Pétri pour former une ligne au centre du plat. 2.4. Croissance amibienne et sous-culture amibienne <ol><li> Observez la boîte de Pétri quotidien. Si un front de migration amibienne est détectée, découper un petit morceau de gélose à l&#39;avant de la migration et inoculer un plat frais ANI Petri recouverte d&#39;une pelouse de E. coli. </li><li> Répéter plusieurs fois la réinoculation en fonction de la pureté de l&#39;échantillon, afin de disposer d&#39;une culture pure d&#39;une souche donnée amibienne. </li></ol> 2.5. Amibes et les bactéries caractérisation <ol><li> Grattez les cellules et les remettre en suspension dans SAP. </li><li> Extraire l&#39;ADN et déterminer l&#39;identité des amibes et / ou endosymbiontes bactériennes par PCR et séquençage (ARNr 16S amplification pour les bactéries, resp. 18S pour les amibes et séquençage, par exemple). </li> &lt;li&gt; Utilisez ces cellules grattées à Pas pour inoculer amibes frais et effectuer une co-culture amibienne pour détecter les bactéries éventuellement présentes dans l&#39;échantillon. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Coculture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne sont des méthodes efficaces qui ont permis l&#39;isolement de nombreuses nouvelles espèces bactériennes et amibienne. Les résultats obtenus avec ces méthodes confirment la présence ubiquitaire des amibes et les bactéries à la fois d&#39;amibes résistant à l&#39;environnement, et plus intéressant dans les réseaux d&#39;eau d&#39;origine humaine qui sont considérés pour être commandé par des traitements chimiques tels que la chloration, ozonation. Coculture amibienne e...

Avant l&#39;avènement de diagnostic moléculaire, les micro-organismes présents dans l&#39;environnement niches ou dans des échantillons cliniques sont souvent détectés en les cultivant sur différents milieux sélectifs, principalement sur de la gélose dans des boîtes de Pétri. Le phénotype des colonies bactériennes et leur activité métabolique ensuite laissé classification bactérienne au niveau de l&#39;espèce. Le bouillon peut également être utilisée pour augmenter la sensibilité de détection. Cependant, ces deux techniques ne permettent pas la récupération de bactéries qui se développent lentement ou pas du tout sur ces supports. C&#39;est la raison pour laquelle des approches moléculaires sont si largement utilisés de nos jours. Néanmoins, la détection de l&#39;ADN fournit aucune indication sur la viabilité des bactéries. En outre, contrairement à la culture, les approches moléculaires ne conduisent pas à une souche qui peut être en outre caractérisé. L&#39;étude des agents pathogènes qui se développent mal sur des supports solides ou que les cellules ont besoin pour grandir est compliqué. La plupart de ces «difficile à cultiver&quot; les bactéries sont intr fastidieuxbactéries acellulaire, souvent découverts et caractérisés suivant les grandes épidémies comme ce fut le cas pour Legionella pneumophila. Cette bactérie a été caractérisé suite à une épidémie qui s&#39;est produite au cours d&#39;un congrès de la Légion américaine. Autant que 182 personnes ont été infectées et 29 sont mortes en raison d&#39;une pneumonie sévère de 1,2. Il a ensuite été démontré que les amibes sont les hôtes naturels de cette bactérie et que leur présence dans les réseaux hôtel de système de climatisation et de l&#39;eau est à l&#39;origine de l&#39;éclosion de la maladie de la soi-disant légionnaire 3. Les amibes sont présents dans le monde entier et ont été isolés à partir du sol, l&#39;air, l&#39;eau et la muqueuse nasale de volontaires humains (revue en 4). Ces amibes &quot;libre-vie» sont généralement divise de manière autonome dans l&#39;environnement, mais peut parfois envahir hôtes permissives 5. l&#39;alimentation des amibes sur divers micro-organismes par phagocytose et après digestion lysosomale par hydrolases 6. Beaucoup de bactéries intracellulaires facultatives ou obligeront sont capables de résister à la digestion et donc d&#39;infecter et de diviser en amibes comme par exemple des bactéries ou des mycobactéries Legionella, Chlamydia liées (revu en 7 et 8). Amibes libres représentent probablement un réservoir important potentiel pour les bactéries intracellulaires qui l&#39;ont pas encore été découverts. Cela a conduit notre groupe à mettre en œuvre à Lausanne deux techniques principales, appelées co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne, qui ont permis d&#39;isoler les différents groupes de plusieurs nouveaux micro-organismes intracellulaires obligatoires à partir de divers échantillons environnementaux 9-15. Depuis amibes sont des phagocytes professionnels qui paissent sur les bactéries, une bactérie capable de résister à la phagocytose et à se développer à l&#39;intérieur de ces protistes peut également coloniser les phagocytes humains et être pathogène envers les humains. Ceci a été partiellement démontrée pour certaines bactéries Chlamydia liés, tels que Waddlia chondrophila. W. chondrophila peut se développer non seulement dans les amibes, mais également dans plusieurs types de cellules telles que des cellules épithéliales de mammifères, les macrophages, et les lignées cellulaires de poisson de 16 à 18. La co-culture amibienne semble également pertinent pour détecter des bactéries intracellulaires dans des échantillons cliniques, y compris 19,20 selles qui sont fortement contaminés par les différentes espèces bactériennes 21. Nous décrivons ici les principales étapes de co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne, y compris (a) le traitement des échantillons environnementaux ou cliniques; (b) la croissance des amibes sur les médias axéniques et sur ​​une pelouse bactérienne d&#39;Escherichia coli et (c) la sélection et la caractérisation des bactéries intracellulaires.

<table><tbody><tr><td>Glucose monohydraté</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu ; m membrane de taille de pores</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>peptone protéose</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>Extrait</td> de levure 211693 <td></td></tr><tr><td></td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Kova slide</td><td>Hycor, Indianapolis, IN</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>microplaques de culture cellulaire</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration Diff-Quik</td><td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Allemagne</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsin</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Oxalate vert de malachite</td> corrosif et mutagène <td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 16 % solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne coculture et approches amibienne enrichissement

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Pathogènes intracellulaires tels que les légionelles, les mycobactéries et organismes Chlamydia-like sont difficiles à isoler car ils poussent souvent mal ou pas du tout sur des milieux sélectifs qui sont habituellement utilisés pour cultiver des bactéries. Pour cette raison, beaucoup de ces agents pathogènes ont été découverts que récemment ou à la suite des flambées importantes. Ces agents pathogènes sont souvent associés à des amibes, qui servent de la cellule hôte et de permettre la survie et la croissance des bactéries. Nous avons l&#39;intention ici de fournir une démonstration de deux techniques qui permettent l&#39;isolement et la caractérisation de pathogènes intracellulaires présents dans les échantillons cliniques ou environnementaux: la co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne. Coculture amibienne permet la récupération des bactéries intracellulaires en inoculant l&#39;échantillon étudié sur une pelouse amibienne qui peut être infectée et lysée par des bactéries intracellulaires présentes dans l&#39;échantillon. Amibienne enrichissement permet la récupération d&#39;amibes présent dans un échantillon clinique ou environnementale. Thest peut conduire à la découverte de nouvelles espèces amibienne, mais aussi de nouvelles bactéries intracellulaires croissance spécifiquement dans ces amibes. Ensemble, ces deux techniques permettent de découvrir de nouvelles bactéries intracellulaires capables de se développer dans les amibes. En raison de leur capacité à infecter les amibes et résister à la phagocytose, ces bactéries intracellulaires peuvent aussi échapper à la phagocytose par les macrophages et, par conséquent, être pathogènes pour les eucaryotes supérieurs.

Utilisation de co-culture amibienne et l&#39;enrichissement amibienne, toute une gamme de bactéries de l&#39;environnement et / ou pathogènes ont été découverts (tableau 1). Coculture amibienne a été utilisé par notre groupe et d&#39;autres pour analyser des échantillons environnementaux, les usines de traitement de l&#39;eau et des systèmes de distribution d&#39;eau. Un large éventail de microorganismes a pu être isolé par cette technique. Les bactéries les plus communes is...

Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'isoler de nouveaux agents pathogènes intracellulaires potentiels présents dans des échantillons environnementaux ou cliniques. Cette isolation est réalisée en inoculant l'échantillon d'intérêt dans une culture d'AME afin de sélectionner les bactéries capables d'entrer et de se multiplier dans les amibes. Ensuite, les amibes lysées, ou dans lesquelles une croissance intracellulaire nette est observée, sont analysées plus en détail afin d'identifier le microorganisme au niveau de l'espèce.Ensuite, si aucune croissance bactérienne n'est obtenue en utilisant la méthode de co-culture avec des amibes, un enrichissement en amibes est effectué afin de détecter les amibes endogènes qui pourraient contenir des bactéries intracellulaires spécifiques. Les résultats obtenus sont l'isolement de nouvelles espèces bactériennes et de nouveaux virus grâce à cette méthode innovante, qui peuvent être caractérisés ultérieurement à l'aide d'approches incluant la microscopie et le séquençage du génome. Les principaux avantages de ces techniques par rapport aux autres méthodes existantes, telles que la culture axénique ou la culture de cellules de mammifèr

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Eucaryotes microbiens sont à la fois une source de carbone photosynthétique dérivé et principales espèces prédatrices en permanence lacs antarctiques couvertes de glace. Ce rapport décrit une approche de la culture d'enrichissement d'isoler métaboliquement eucaryotes microbiens polyvalents du lac de l'Antarctique, le lac Bonney, et évalue le potentiel de fixation du carbone inorganique en utilisant un dosage radio-isotope pour ribulose-1 ,5-oxygénase bisphophate carboxylase (RubisCO) l'activité.

Mise en place de cultures microbiennes eucaryotes à partir d&#39;un enrichissement chimique stratifié lac Antarctique et de l&#39;évaluation du potentiel de fixation du carbone

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Cette technique fournit une méthode pour récolter, normaliser et quantifier la croissance intracellulaire des bactéries pathogènes qui sont pré-cultivées dans les cellules hôtes naturels protozoaires avant infections de cellules de mammifères. Cette méthode peut être modifiée pour accueillir une grande variété de cellules hôtes pour la phase d'amorçage, ainsi que les types de cellules cibles.

Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d'affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

Nous décrivons ici les dernières avancées en matière d’isolement viral pour la caractérisation de nouveaux génotypes de Faustovirus, une nouvelle lignée de virus géants apparentée à l’asfarvirus. Ce protocole peut être appliqué à l’isolement à haut débit de virus, en particulier de virus géants infectant les amibes.

Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Nous présentons ici deux protocoles pour étudier les interactions Phagocyte -Mycobacterium abscessus : le criblage d’un transposon mutant pour carence intracellulaire bactérienne et la détermination des bactéries intracellulaire transcriptome de l’ARN séquençage. Les deux approches offrent un aperçu des avantages génomiques et transcriptomique des adaptations améliorant l’aptitude des bactéries intracellulaires.

Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

Nous présentons ici un protocole visant à mesurer la virulence de bactéries planctoniques ou attaché à la surface à l’aide de d. discoideum (amibes) en tant qu’hôte. Virulence est mesurée sur une période de 1 h et hôte tuant est quantifiée à l’aide de fluorescence microscopie et analyse d’images. Nous démontrons ce protocole à l’aide de la bactérie P. aeruginosa.

Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe

Cet article détaille un protocole pour la préparation d'une co-culture de cellules cryptococciques et d'amibes qui est étudiée à l'aide d'images fixes fluorescentes et d'images de microscope électronique à transmission haute résolution. Illustré ici est comment les données quantitatives peuvent compléter ces informations qualitatives.

Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.

Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes

Une nouvelle méthode de préparation d’échantillons est démontrée pour l’analyse de macrocolonies bactériennes à base d’agar par spectrométrie de masse par imagerie par désorption/ionisation laser assistée par matrice.

Étude de la coopération microbienne par imagerie par spectrométrie de masse Analyse de colonies bactériennes cultivées sur gélose et dans les tissus pendant l’infection

Découvrez la coculture amibienne pour isoler de nouveaux agents pathogènes intracellulaires à partir d'échantillons environnementaux ou cliniques. Cette méthode innovante permet d'identifier des bactéries et virus inconnus.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

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