Un Protocole d'intervention en Trompe d'extension pour les enquêtes plasticité comportementale chez les insectes: application à la base, biomédicale et la recherche agricole

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment mettre en œuvre un conditionnement comportemental d'une réponse réflexe simple à la nourriture chez les abeilles. Cette démarche consiste d'abord à capturer des abeilles, à les immobiliser dans des harnais, à leur administrer une petite quantité de solution secrète, puis à les habituer à cette immobilisation. Ensuite, on sélectionne des abeilles pour le conditionnement, en choisissant celles qui manifestent une motivation suffisante lorsque leurs antennes sont touchées avec du saccharose.

Pendant la phase de conditionnement, la présentation d'une odeur est associée à une récompense de saccharose afin d'induire la réponse conditionnée. Ensuite, des essais non renforcés permettent de mesurer la présence ou l'absence de la réponse, la latence de la réponse et la durée de la réponse. La dernière étape consiste à analyser les données et à présenter graphiquement les essais de conditionnement et de test.

Cette technique a été appliquée avec succès à l'étude de la biologie des abeilles mellifères et de leur comportement d'apprentissage, qui est particulièrement sensible aux traitements perturbateurs tels que les pesticides, permettant ainsi d'évaluer l'impact de ces traitements sur le comportement des abeilles mellifères à des niveaux sublétaux. La démonstration visuelle de cette méthode facilite la compréhension du moment précis d'application du stimulus nécessaire à un conditionnement efficace, ainsi que des erreurs fréquentes qui réduisent son efficacité. Une personne novatrice dans cette méthode éprouvera des difficultés à respecter avec précision les détails requis tant par le protocole que par les conditions environnantes.

Pour commencer, collectez des abeilles ouvrières à l'entrée de la colonie, au moment où elles s'arrêtent avant de partir ou au retour de la butinage. Capturez une seule abeille par flacon. Tenez l'ouverture du flacon horizontalement ou dirigée vers le bas tout en fixant le couvercle afin d'éviter toute évasion.

Une fois les abeilles collectées, retournez au laboratoire et placez quelques flacons à la fois dans un mélange d’eau et de glace. Dès qu’une abeille devient immobile, retirez immédiatement le flacon de la glace pour éviter une exposition excessive, puis placez l’abeille dans un harnais de contention. Immobilisez l’abeille de manière à ce que son thorax dorsal soit orienté vers la partie découpée du support et sa tête légèrement au-dessus du bord supérieur.

Appuyez doucement sur l'abeille afin que ses pièces buccales dépassent du bord du support. Glissez une bande de ruban adhésif entre la tête et le thorax sur le côté dorsal, puis fixez fermement l'extrémité libre sur le côté du support. Veillez à ce que le ruban adhésif sur le harnais soit lisse et tendu.

Il ne devrait y avoir aucun espace visible entre l'avant du support à abeille et le ruban. S'il y a des espaces, l'abeille pourrait ne pas pouvoir étendre correctement son proboscis ou pourrait réussir à s'échapper. Laissez les abeilles environ 30 minutes pour se remettre de l'entravement avant de les nourrir.

Ensuite, dans une zone éloignée de la zone d'entraînement, nourrir chaque abeille avec environ trois à quatre microlitres de saccharose 0,5 M pendant l'intervalle entre l'alimentation et le conditionnement. Placer les abeilles dans un endroit calme du laboratoire, dans un récipient en plastique avec des serviettes en papier humides. Pendant ce temps, quelques minutes avant le début du conditionnement, tester la motivation alimentaire de l'abeille en touchant leurs antennes avec une petite goutte de solution de saccharose 0,5 M.

Ne les laissez pas s'alimenter pendant ce test. S'ils répondent en étendant leurs psis, ils sont probablement suffisamment motivés pour apprendre et peuvent être utilisés pour le protocole. Lorsqu'ils sont prêts, placez la seringue à odeur en verre dans un support en pâte à modeler et ajustez-la de manière à ce que l'ouverture de l'extrémité large soit dirigée directement vers les abeilles et à 10 E. L'extrémité de la seringue doit se trouver à un ou deux centimètres de l'abeille ; placez fermement le raccord reliant la cartouche au système de tubulure et de valve d'écoulement d'air sur l'extrémité étroite de la seringue.

Au début de chaque essai, placer l'abeille harnachée sur le support dans l'arène de conditionnement, en orientant ses antennes directement vers la cartouche d'odeur. Laisser l'abeille se reposer dans l'arène pendant 15 à 25 secondes avant de commencer le stimulus olfactif, afin qu'elle s'habitue à son nouvel environnement. Appuyer sur le bouton de démarrage pour activer le mécanisme de temporisation de la délivrance de l'odeur.

Surveiller la réponse de l'abeille à l'odeur après le début du stimulus et avant la présentation du stimulus non conditionné. Après chaque essai, laisser l'abeille se reposer dans la zone de conditionnement pendant encore 15 à 25 secondes afin de permettre la formation initiale de la mémoire. Déplacer l'abeille trop tôt après l'essai réduira considérablement l'efficacité de chaque essai de conditionnement.

Pour administrer le sucrose, maintenez la pointe de l'aiguille à deux ou trois centimètres de l'abeille pendant la présentation de l'odeur. Utilisez le bord de l'arène d'entraînement pour éviter de faire trembler la seringue, car ce mouvement peut distraire l'abeille. Un signal sonore indiquant l'alimentation retentira pendant la présentation du stimulus olfactif.

Dès que le signal de nourrissage retentit, touchez légèrement les antennes jusqu'à ce que l'abeille étende sa proboscis, puis nourrissez l'abeille. L'intervalle entre la présentation de l'odeur et celle du saccharose est crucial. Idéalement, ces deux stimuli doivent se chevaucher brièvement.

Si plus de quelques secondes s'écoulent entre la présentation de l'odeur et la présentation du saccharose, la performance en conditionnement diminuera. Après le conditionnement, utilisez des essais de test non renforcés pour évaluer dans quelle mesure les abeilles se souviennent de l'association conditionnée. Commencez par installer une caméra vidéo sur un trépied au-dessus de la zone d'entraînement et mettez au point la caméra sur l'avant de la tête de l'abeille afin que les antennes et le proboscis soient nettement visibles.

Veillez à ce qu'une petite lumière LED, indiquant la présentation du stimulus olfactif, se trouve dans une zone située derrière l'abeille, visible sur la vidéo mais pas pour l'abeille. Cela permet d'identifier le moment de début et de fin de l'odeur lors de l'analyse. Pour des résultats aussi reproductibles que possible, utilisez des cartouches d'odeur fraîchement préparées pour les tests, une fois que tout est mis en place.

Commencez le test en présentant l'odeur comme indiqué précédemment. Commencez l'enregistrement 20 secondes avant la présentation de l'odeur et poursuivez l'enregistrement pendant au moins 20 secondes après. Après le test, utilisez un logiciel de montage vidéo pour évaluer la réponse de chaque abeille à la condition en réponse au stimulus.

Utilisez un système de notation binaire pour évaluer la réponse d'extension des psis, en classant les réponses comme positives ou négatives. Classez la réponse de B comme positive. Lorsque les B extensus s'étendent au-delà de la ligne formée en reliant les extrémités des mandibules ouvertes, n'attribuez une réponse positive que si B étend son prob bois après le début de l'odeur, mais avant la fin de celle-ci. Classez la réponse de B comme négative s'il n'y a aucune extension du prob bois pendant l'essai, ou si le pro bois est étendu après la disparition de l'odeur. D'autres paramètres peuvent être recueillis, tels que la latence d'extension, ainsi que le nombre et la durée totale des réponses d'extension en fonction de la condition.

Le stimulus a augmenté au cours des essais de conditionnement successifs. Les réponses à des odeurs de test nouvelles, qui différaient du stimulus par la longueur de la chaîne carbonée et/ou la position de la liaison carbone-carbone, ont diminué proportionnellement au degré de différence entre le stimulus conditionné et l'odeur de test nouvelle. Ces données illustrent la variabilité et le succès du conditionnement entre différents investigateurs.

Les réponses à l’octanal différaient selon le groupe effectuant les tests. Lors des essais, l’odeur utilisée comme stimulus conditionné provoquait la réponse la plus forte. Lorsque l’octanal était utilisé comme stimulus conditionné, la réponse était plus intense lors du test par rapport à la méthylcyclohexone, une odeur nouvelle.

De même, le cyclone de méthyle a produit des réponses plus intenses lorsqu'il était utilisé comme stimulus conditionné. Lorsqu'un appariement rétrograde était utilisé, la réponse conditionnée était réduite à un niveau proche de celui de l'odeur nouvelle, illustrant l'importance d'un minutage précis pour un conditionnement réussi après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les bases neuronales de l'apprentissage et de la mémoire chez des organismes modèles insectes tels que l'abeille domestique.

N'oubliez pas que le travail avec les insectes, en particulier les abeilles, peut être dangereux. Assurez-vous de porter des équipements de protection appropriés lorsque vous travaillez avec ces animaux.