Name: Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de Drosophila Testicules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Apprenez à disséquer et préparer des testicules de Drosophila pour la microscopie par contraste de phase et immunofluorescence. Cette méthode permet d'observer les stades de la spermatogenèse et de localiser les protéines cellulaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Michael Anderson pour établir dans le laboratoire Lee ces méthodes reconnues pour l&#39;étude de la spermatogenèse des conseils d&#39;experts de Karen Hales. H. Oda et Y. Akiyama-Oda généreusement fourni le γ-tubuline-GFP mouche stock. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH R01 à LAL (GM074044).

Une. Dissection des testicules <ol><li> Anesthésier les mouches dans une bouteille ou flacon à l&#39;aide d&#39;un flux de CO 2 et de les transférer à un pad à la mouche. </li><li> Trier les mouches sous un microscope à dissection à l&#39;aide d&#39;un petit pinceau, et collecter un nombre approprié (en fonction de l&#39;expérience) des mâles de Drosophila des génotypes souhaités. Les jeunes mâles (0-2 jours) sont idéales pour examiner les cellules à travers les premières étapes de la spermatogenèse (par exemple de spermatogonies, spermatocytes et spermatides début d&#39;après-méiotiques), tandis que les mâles un peu plus âgés (2-5 jours) sont idéales pour examiner les cellules dans les dernières étapes de la spermatogenèse (en particulier, la maturité des spermatozoïdes). </li><li> Utilisez une pince pour enlever les ailes de chaque vol (pour empêcher les mouches de flotter dans le liquide lors de la dissection). </li><li> Ajouter ~ 500 ml d&#39;une solution saline tamponnée au phosphate (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3 mM de NaH 2 PO 4; PBS) dans une goutte d&#39;une dissection plat revêtu de silicone surun fond noir. Autres solutions aqueuses ont été utilisés avec succès pour testicules dissection 3. </li><li> Point de forceps vers la partie antérieure de la mouche, le saisir par le thorax, et la plonger dans la chute du PBS. Lors de la visualisation au microscope de dissection, utiliser une autre paire de pinces pour saisir et tirer des organes génitaux externes (structure brun foncé situé à l&#39;extrémité postérieure de l&#39;abdomen ventral) en arrière jusqu&#39;à ce qu&#39;il se détache de l&#39;abdomen. Dans la plupart des cas, les testicules, les vésicules séminales, et la glande accessoire seront retirés de l&#39;abdomen avec les organes génitaux externes, sinon, insérer une seule paire de pince dans l&#39;abdomen et démêler les testicules. </li><li> Séparez les testicules glande accessoire et organes génitaux externes en utilisant deux paires de pinces dans les menus déroulants PBS (figure 2). Testicules de type sauvage sont faciles à distinguer des tissus blancs voisins par leur couleur jaune. Procéder immédiatement à l&#39;étape 2. </li><li> Pour isoler les testicules des mâles de pharate (i.. E enfermé dans la coque de nymphose), une étape supplémentaire doit être effectué d&#39;abord qui consiste à retirer la volée de la coque de nymphose; cette étape a déjà été décrit ailleurs 31. Procéder à la dissection que pour les testicules adultes commençant à l&#39;étape 1.2. </li><li> Pour isoler les testicules des mâles larvaires, effectuer une modification d&#39;un protocole pour isoler ovaires larves de Drosophila 32. Brièvement, les larves mâle peut être distingué de larves femelle par la présence d&#39;une paire de grandes structures, ovales clairs (testicules larvaires) noyées dans le tiers postérieur du corps de la graisse. Pour isoler les testicules larvaires, écorcher partiellement ouvrir la larve mâle d&#39;isoler les testicules et la graisse du corps entourant de l&#39;abdomen comme décrit pour l&#39;isolement des ovaires larvaires. Procéder immédiatement à l&#39;étape 2 du protocole décrit ci-après, les testicules peuvent ensuite être retirés du corps de graisse juste avant le montage (étapes 2.3 ou 3.14) comme décrit pour les 32 ovaires. </li></ol><ol><li> Utilisez une paire de pinces pour placer doucement 2-3 paires de testicules dans une goutte de 4-5 ml de PBS sur une place couvercle en verre glissement. Notez que le rapport du nombre des testicules au volume PBS peut être nécessaire d&#39;ajuster: trop de liquide empêche les cellules de se propager correctement lorsque écrasé, alors que trop peu de liquide entraînera éclater leurs cellules quand écrasé. Facultatif: Utilisez le couvercle silicone glisse à minimiser l&#39;adhérence de tissu pour couvrir glissement dans l&#39;étape 3.2. </li><li> Utilisez une paire de pinces à déchirer chaque testicule à une position appropriée de façon à maximiser la présence des types de cellules de la lignée germinale souhaités dans la préparation (à noter que le contenu du testicule sera la plupart du temps de sortie de la région déchirée sur la lame pendant l&#39;écrasement étape.) pour enrichir les spermatogonies et spermatocytes, déchirer le testicule adjacent à son extrémité apicale (niveau 1, figure 2B). Pour enrichir les spermatocytes et spermatides, déchirer les testicules à une position légèrement base au niveau 1 (niveau 2, figure 2B). Pour enrichir les cellules de la lignée germinale plus matures, déchirer les testicules plus près de l&#39;endroit où la courbure commence (niveau 3, figure 2B). </li><li> Placez délicatement une lame de microscope en verre sur la lamelle à écraser les testicules, ne pas appliquer de pression manuellement le poids de la lamelle seul est suffisant pour obtenir un échantillon bien écrasé. Essayez d&#39;éviter les bulles d&#39;air. Facultatif: enduit utilisation poly-L-lysine lames de microscope pour promouvoir l&#39;adhésion du tissu à glisser dans l&#39;étape 3.2. </li><li> Utiliser la préparation immédiatement (de préférence dans les 15 minutes suivant la préparation) pour observer les cellules vivantes par microscopie à contraste de phase, par des mouches transgéniques avec expression des protéines marquées par fluorescence dans les testicules, les cellules vivantes peuvent être examinés par microscopie de fluorescence à cette étape. Sinon, procéder à la fixation et coloration d&#39;anticorps (protocole 3). </li><li> Mèche doucement tout excès de liquide sous la lamelle en utilisant un nettoyage wipe pour permettre l&#39;aplatissement de la préparation jusqu&#39;à ce que les cellules germinales sont nettement au point. </li></ol> 3. Formaldéhyde fixation et coloration des anticorps <ol><li> Aligner geler chaque diapositive contenant les testicules écrasés (du protocole n ° 2) en utilisant une paire de pinces métalliques à plonger brièvement dans de l&#39;azote liquide (azote liquide jusqu&#39;à ce que le bouillonnement cesse). </li><li> Retirer la lamelle immédiatement d&#39;utiliser une lame de rasoir. </li><li> Utilisez des pinces métalliques pour transférer des diapositives dans une grille coulissante en verre préalablement refroidi rempli de glace-froid à 95% d&#39;éthanol (grade spectrophotométrie, sans méthanol). Conserver à -20 ° C pendant 10 min. </li><li> Utiliser des pinces en métal de transférer les lames d&#39;un porte-lame de verre rempli de formaldehyde à 4% dans du PBS plus 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Stocker à température ambiante pendant 7 min. </li><li> Utilisez des pinces métalliques pour transférer des diapositives dans une grille coulissante en verre rempli de PBS. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 1x. Effectuer tous les lavages en rejetant la solution dans la grille coulissante en verre ( <em&gt; Dire. en le versant sur) et les remplacer par une solution fraîche. </li><li> Rejeter le PBS et plongez-lames dans du PBS-T pendant 30 min à température ambiante pour perméabiliser les membranes cellulaires. </li><li> Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 2x. </li><li> L&#39;étape (optionnelle) de blocage: Immerger les lames dans du PBS + 1% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante. </li><li> Utilisez un stylo de barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur la lame autour du tissu écrasé (facilement visible à l&#39;oeil nu), afin de limiter les solutions d&#39;anticorps (ajoutés dans les étapes 3.9 et 3.11). Le tissu doit être maintenue humide en tout temps pendant l&#39;exécution immunologique. </li><li> Ajouter 30 à 40 ml d&#39;anticorps primaire (dilué dans du PBS-T, 1:400 à 01:50, en fonction de l&#39;anticorps) de tissu à l&#39;intérieur du cercle. Si le blocage a été effectué, diluer l&#39;anticorps primaire dans du PBS-T plus 1% de BSA. L&#39;anticorps anti-gamma-tubuline (pour la coloration des centrosomes dans la figure 4) a été dilué 1:100. Incuber dans un sol humide, chambre noire (boîte en plastique par exemple. Ferméavec des serviettes humides de papier) pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à manger 3x de température. Si le blocage a été effectué, laver deux fois dans du PBS-T et une fois dans du PBS (5 min à température ambiante chacun). </li><li> Ajouter 30 à 40 ml d&#39;un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (dilué à 1:400 dans du PBS) pour le tissu et incuber dans l&#39;obscurité pendant 1-2 h à température ambiante. </li><li> Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 2x. </li><li> Ajouter 30 à 40 ml de solution de DAPI (0,2 mg / ml dans du PBS) pour le tissu à l&#39;intérieur du cercle. </li><li> Placez délicatement une lamelle de verre sur le tissu, en prenant soin d&#39;éviter la formation de bulles. Si des bulles d&#39;air doivent apparaître, déplacer soigneusement autour de la lamelle sans détruire la courge jusqu&#39;à ce que les bulles s&#39;échapper par les côtés de la lamelle. </li><li> Utilisez un chiffon de nettoyage pour effacer l&#39;excès de DAPI des bords de la diapositive. </li><li> Sceller la lamelle sur la lame à l&#39;aide de vernis à ongles transparent. </li><li> Utilisez cette préparationdans le 3-4 heures suivantes pour afficher les cellules immunocolorées par microscopie à fluorescence. Pour le stockage à long terme de diapositives (au moins jusqu&#39;à plusieurs semaines), utiliser un support de montage disque à base de glycérol avec DAPI, et conserver les lames à -20 ˚ C. </li><li> En variante, fixer les échantillons dans du methanol à la place du formaldehyde (en fonction de l&#39;antigène). Après avoir terminé l&#39;ensemble du protocole à l&#39;étape 3.2, plongez les lames de testicules écrasées dans du méthanol pendant 10 min à -20 ° C et passez à l&#39;étape 3.5 en avant. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Bien que les testicules des mouches de type sauvage peuvent être facilement identifiés en raison de leur couleur jaune (en revanche, les tissus blancs des voisins), les testicules des mouches mutantes blancs sont blancs et donc peuvent parfois être confondus avec l&#39;intestin. La plupart des souches transgéniques, qui sont généralement dans un fond blanc, ont également testicules blancs parce que le gène de mini-blanc trouvé dans les P-éléments ne favorise pas l&#39;accumulation de ...

Testicules chez la drosophile sont un système modèle idéal pour l&#39;étude de nombreux processus biologiques, y compris la régulation des cellules souches, la méiose, et le développement des spermatozoïdes 13-18. Les spermatocytes et leurs fuseaux méiotiques sont grandes et donc pratique pour l&#39;analyse cytologique, et les points de contrôle du cycle cellulaire détendu pendant la spermatogenèse faciliter l&#39;étude des mutations dans les gènes du cycle cellulaire. Différents types de cellules peuvent être observées dans la progression ordonnée le long de la longueur des testicules, et toute perturbation de la spermatogenèse peuvent conduire à des changements dans cet agencement global. Ces fonctionnalités, combinées à des outils génétiques chez la drosophile ont facilité l&#39;analyse mutationnelle de la spermatogenèse 21-23. Les étapes de la spermatogenèse chez la drosophile ont été bien définis. des cellules de la lignée germinale qui se développent de manière synchrone à l&#39;intérieur des kystes progresser séquentiellement à travers les étapes de la spermatogenèse le long de la longueur du testicule. Pendant boe la mitose et la méiose divisions des cellules germinales mâles, la cytokinèse se produit de manière incomplète de telle sorte que les cellules filles restent reliés par des ponts cytoplasmiques dits canaux périphériques (Figure 1). L&#39;extrémité apicale du testicule contient une population de cellules souches de lignée germinale qui donne lieu à des spermatogonies, qui subissent quatre divisions mitotiques avec la cytokinèse incomplète pour générer des kystes de 16 cellules de spermatocytes primaires. Après la phase S préméiotique, spermatocytes primaires entrent G2, une période de croissance prolongée de ~ 90 heures au cours de laquelle le volume cellulaire augmente ~ 25 fois. La progression à travers la méiose et de la méiose II I conduit à la formation de kystes de 32 cellules de spermatocytes secondaires et les kystes 64 cellulaires des spermatides haploïdes, respectivement. Les immatures, des spermatides rondes subissent un remodelage cellulaire pour former des spermatozoïdes matures. Cellules post-méiotiques, en particulier des faisceaux de s&#39;allongeant et spermatides matures, occupent une grande partie du volume du testicule. Til transports succès des spermatozoïdes fonctionnels à mouches femelles nécessite une coordination entre les différentes parties du système reproducteur masculin, qui est composé de plusieurs structures paires (les testicules, les vésicules séminales et des glandes accessoires) et un seul canal éjaculateur (Figure 2). Les spermatozoïdes sont produits dans les testicules et stockée dans les vésicules séminales jusqu&#39;à l&#39;accouplement 24. Les glandes accessoires contiennent des cellules sécrétoires qui produisent le liquide séminal. Le sperme migrer des vésicules séminales sont mélangés avec le liquide séminal dans le conduit éjaculatoire, qui est reliée à la fois les vésicules séminales et les glandes accessoires. Ce mélange de sperme et du liquide séminal est finalement pompé hors du mâle dans le vagin de la femelle voler à travers l&#39;ampoule de la éjaculatoire situé à l&#39;extrémité postérieure de l&#39;abdomen mâle 25. Protéines dans le liquide séminal sont essentiels pour un stockage prolongé des spermatozoïdes dans les organes spécialisés appelés spermathèque de la répétitionvoies roductive de Drosophila femmes 26. D&#39;excellentes méthodes pour l&#39;isolement de testicules de Drosophila et la visualisation de cellules à différents stades de la spermatogenèse sont disponibles dans la littérature scientifique 3-12. Nous ajoutons ici à cet ensemble de connaissances en présentant des exemples de ces protocoles avec une vidéo de démonstration d&#39;accompagnement. Le protocole de préparation des échantillons de testicules vivants pour la microscopie à contraste de phase est basé sur un procédé 27 décrit précédemment. Le protocole pour la fixation de formaldehyde et immunomarquage des testicules est également basée sur un procédé 28 décrit précédemment. Les approches décrites ici ont été utilisées dans de nombreuses études de la spermatogenèse chez la drosophile (par exemple, pour évaluer le rôle de la dynéine, un moteur de microtubule-minus extrémité dirigée, pendant la spermatogenèse chez la drosophile). En plus des protocoles de base, des suggestions sont prévus pour varying la dissection afin d&#39;enrichir de spermatogonies, spermatocytes, ou des spermatozoïdes matures. Différentes méthodes de traitement des testicules tels que les kystes soit restent intacts ou sont perturbés au besoin sont décrits. Un avantage à utiliser des testicules de Drosophila en tant que système modèle est que, par rapport à des ovocytes et des embryons de Drosophila, des anticorps et des colorants peuvent facilement pénétrer dans les cellules après leur dispersion à partir des testicules, et moins d&#39;étapes de lavage sont nécessaires, ainsi, les protocoles peuvent être effectuées en un temps relativement peu de temps.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Élastomère de silicone en deux parties pour la fabrication d’une boîte de dissection recouverte de silicone à partir d’une boîte de Pétri Kimax</td></tr>, <tr><td>stylo PAP Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Protecteur d’ongles transparent</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Réactif avec DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-gamma-tubuline de souris (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldéhyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Utiliser selon les instructions du fabricant pour siliconer les lamelles</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 mg/ml dans de l’éthanol à 75 % ; conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Essuie-glaces Kimwipes Fisher</td><td>Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Qualité biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Verre Coplin pot de coloration, bouchon à vis</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope simples dépolies</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope revêtues de poly-L-lysine</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>En option (pour remplacer les lames de microscope non traitées)</td></tr><tr><td>Verre de couverture carré</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri Kimax</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 Pince EMD</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Motif 5 Stéréoscope</td></tr> <tr><td></td><td>INOX Stemi 2000-CSCarl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Objectif Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X Objectif</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytologique analyse de la spermatogenèse: préparatifs en direct et fixes de<em&gt; drosophila</em&gt; testicules

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster est un système de modèle puissant qui a été largement utilisé pour élucider une variété de processus biologiques. Par exemple, des études à la fois la femme et lignées germinales mâles de Drosophila ont grandement contribué à la compréhension actuelle de la méiose ainsi que la biologie des cellules souches. Excellentes protocoles sont disponibles dans la littérature pour l&#39;isolement et l&#39;imagerie de ovaires et les testicules 12.03 Drosophila. Ici, les méthodes pour la dissection et la préparation des testicules chez la drosophile pour l&#39;analyse microscopique sont décrits avec une vidéo de démonstration d&#39;accompagnement. Un protocole pour isoler les testicules de l&#39;abdomen des mâles adultes et préparer des lames de tissu vivant pour une analyse par microscopie à contraste de phase ainsi que d&#39;un protocole pour la fixation et la coloration immunologique testicules pour l&#39;analyse par microscopie de fluorescence sont représentés. Ces techniques peuvent être appliquées à la caractérisation de mutants de drosophile qui présentent defects de la spermatogenèse, ainsi que dans la visualisation des localisations intracellulaires de protéines.

Un exemple d&#39;une paire convenablement disséqué des organes reproducteurs mâles de Drosophila est représenté sur la figure 2A. Testicules retirés de l&#39;abdomen de la mouche mâle adulte sont généralement attachés à la conduite de l&#39;éjaculation (brun, figure 2A &#39;) et une paire de glandes accessoires (vert, figure 2A&#39;) via une paire de vésicules séminales (bleu, figure 2A &#39;) . Pour séparer les testicules de la majeure partie ...

Méthodes pour isoler et préparer Drosophila testicules échantillons (vivre et fixe) pour l&#39;imagerie par contraste de phase et microscopie de fluorescence sont décrits ici.

Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicules

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

L'objectif général de cette procédure est de disséquer et de préparer des testicules d'oph pour la microscopie. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les paires de testicules à partir de l'abdomen de mouches mâles. La deuxième étape consiste à déchirer les testicules au stade de développement approprié et à les écraser afin de libérer les cellules qu'ils contiennent.Ensuite, les testicules écrasés sont fixés, puis incubés avec les anticorps primaires et secondaires. La dernière étape consiste à monter le tissu sur une lame pour l'observation en microscopie. Enfin, une microscopie en contraste de phase ou en immunofluorescence est utilisée pour observer les cellules à différents stades de la spermatogenèse afin de détecter d'éventuelles anomalies morphologiques, ainsi que pour visualiser la localisation subcellulaire de diverses protéines.Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie du développement, notamment à l'identification des rôles critiques des protéines au cours de la spermatogenèse. La démonstration visuelle de la dissection des testicules de Drosophile est cruciale, car un débutant dans cette technique peut éprouver initialement des difficultés à localiser les testicules dans l'abdomen de la mouche. En outre, il est plus facile de montrer, plutôt que de décrire par des mots, la manière la plus efficace d'appliquer l'écrasement du tissu.Pour commencer la dissection, anesthésiez les mouches dans un flacon ou un tube à l’aide d’un courant de dioxyde de carbone. Ensuite, transférez les mouches anesthésiées sur un tapis à mouches. Triez les mouches au microscope stéréoscopique à l’aide d’un petit pinceau pour collecter environ six à huit mâles oph du génotype souhaité.Ensuite, retirez les ailes de chaque mouche à l’aide de pinces. Cela empêchera les mouches de flotter dans le liquide. Pendant la dissection, ajoutez 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS en une seule goutte sur une plaque de dissection recouverte de silicone et placée sur un fond noir.Ensuite, orientez la pince vers l'extrémit&shy;&eacute; ant&eacute;rieure d'une des mouches d&eacute;sarm&eacute;es. Saisissez-la par le thorax et plongez-la dans la goutte de PBS. Rep&eacute;rez la structure brun fonc&eacute; situ&eacute;e &agrave; l'extr&eacute;mit&shy;&eacute; post&eacute;rieure de l'abdomen ventral, puis utilisez une autre paire de pinces pour saisir les organes g&eacute;nitaux externes et les tirer vers l'arri&egrave;re jusqu'&agrave; ce qu'ils se d&eacute;tachent de l'abdomen.Dans la plupart des cas, les testicules, les vésicules séminales et la glande accessoire seront retirés de l'abdomen avec les organes génitaux externes. Toutefois, s'ils ne le sont pas, insérez une paire de forceps dans l'abdomen et extrayez délicatement les testicules. Séparez les testicules des glandes accessoires et des organes génitaux externes à l'aide de deux paires de forceps.Différencier les testicules de type sauvage des tissus blancs adjacents par leur couleur jaune. Pour préparer l'échantillon en vue d'une observation en direct, utiliser une pince pour placer délicatement deux à trois paires de testicules dans une goutte de quatre à cinq microlitres de PBS sur un coverslip carré en verre. Ensuite, déchirer.Ouvrez chaque testicule avec une pince à un niveau approprié afin de maximiser la présence des types cellulaires germinaux souhaités dans la préparation. Le contenu des testicules s'écoulera par la zone déchirée sur la lame. Pendant l'étape d'écrasement destinée à enrichir en spermatogonies et en spermatocytes, déchirez les testicules à proximité de leur extrémité apicale pour favoriser cet enrichissement.Pour les spermatocytes et les spermatides, déchirez les testicules à un endroit légèrement basal par rapport au niveau un afin d'enrichir en cellules germinales plus matures. Ouvrez les testicules plus près de l'endroit où commence la courbure. L'étape suivante consiste à écraser les testicules en plaçant délicatement une lame de microscope sur la lamelle.Ne pas appliquer de pression manuellement et éviter de piéger des bulles d'air. Utiliser l'échantillon dans les 15 minutes suivant sa préparation afin d'observer les cellules vivantes. En microscopie de contraste de phase, absorber délicatement l'excès de liquide sous la lamelle à l'aide d'un essuie-tout propre pour aplatir la préparation jusqu'à ce que les cellules germinales soient nettement au point.Plonger rapidement les lames préparées contenant des testicules écrasés dans de l'azote liquide à l'aide d'une pince métallique, jusqu'à ce que les bulles cessent. Retirer immédiatement la lamelle avec une lame de rasoir. Ensuite, transférer les lames à l'aide de la pince métallique vers un porte-lames en verre prérefroidi rempli d'éthanol glacé à 95 %, puis conserver l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.Transférez les lames équilibrées dans un porte-lames en verre rempli de formaldéhyde à 4 % dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 ou du PBST, et laissez-les à température ambiante pendant sept minutes. Ensuite, transférez les lames dans un porte-lames rempli de PBS. Lavez les lames dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante en éliminant la solution du porte-lames et en la remplaçant par une solution fraîche de PBS.Répétez le lavage une fois. Éliminez le PBS et immergez les lames dans du PBST pendant 30 minutes à température ambiante afin de permeabiliser les membranes cellulaires. Lavez ensuite les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Tracez un cercle autour du tissu écrasé sur la lame à l’aide d’un stylo à barrière hydrophobe afin de confiner les solutions d’anticorps et de maintenir le tissu humide en tout temps pendant la réalisation de l’immunomarquage.Ensuite, ajouter de 30 à 40 microlitres d'anticorps primaire dilué dans du PBST sur le tissu à l'intérieur du cercle. Incuber la lame dans une chambre humide et sombre pendant deux heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius après l'incubation avec l'anticorps primaire. Laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, ajouter 30 à 40 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué à la fluorescéine, dilué dans du PBS, sur le tissu et incuber à l’abri de la lumière pendant une à deux heures à température ambiante. Puis, laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite 30 à 40 microlitres de solution DAPI sur le tissu à l’intérieur du cercle.Placez délicatement une lame de couverture en verre sur le tissu, en prenant bien soin d'éviter de piéger des bulles d'air. Si des bulles d'air apparaissent, déplacez soigneusement la lame de couverture sans endommager l'échantillon jusqu'à ce que les bulles s'échappent par les bords. Absorbez l'excès de liquide aux bords de la lame à l'aide d'un chiffon de nettoyage.Ensuite, scellez la lame avec du vernis à ongles et observez les cellules immuno-marquées au microscope fluorescent dans les trois à quatre heures suivant la préparation. Ce schéma illustre la localisation des différents niveaux de maturation cellulaire dans les testicules de drosophile. Le niveau un contient des cellules plus jeunes, au stade initial de la spermatogenèse, tandis que le niveau trois contient des cellules spermatiques plus matures.Le niveau deux contient une population mixte de cellules germinales mitotiques et post-mitotiques. Une image correspondante en contraste de phase montre la libération de spermatogonies ainsi que de spermatocytes primaires précoces et tardifs lorsque les testicules sont déchirés au niveau un. La flèche jaune indique également la fusion de deux cellules ou plus interconnectées en raison d'une cytokinèse incomplète.Un artefact de la procédure d’écrasement illustrée ici est une image correspondante en contraste de phase montrant la libération de spermatocytes primaires tardifs et de cellules post-mitotiques, notamment des spermatides rondes, des spermatides allongées et des spermatozoïdes matures, lorsque les testicules ont été déchirés au niveau deux. L'imagerie en contraste de phase des testicules écrasés peut également être utilisée pour identifier facilement les défauts présents dans les abondantes spermatides rondes. Des spermatides sauvages, possédant un noyau unique clair en phase, sont montrées ici attachées à un agrégat mitochondrial unique sombre en phase, d'une taille approximativement équivalente.En revanche, les spermatides issues des testicules de Aun contiennent plusieurs petits noyaux et un gros agrégat mitochondrial en raison d'une cytocinèse défaillante et d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes. Les images en niveaux de gris présentées ici proviennent d'une préparation de testicules écrasés, colorées avec des réactifs permettant d'identifier en couleur les microtubules, l'ADN et les centrosomes. Les images combinées montrent un spermatocyte en division, un vaste champ de spermatides arrondis et un faisceau de spermatozoïdes matures. Une fois maîtrisée, la préparation des échantillons pour la microscopie en contraste de phase peut être réalisée en 20 à 30 minutes.La préparation des échantillons pour la microscopie en immunofluorescence peut être réalisée en six heures si elle est effectuée correctement. En plus du traitement des testicules d'oph pour la microscopie, les testicules disséqués peuvent être utilisés alternativement pour l'analyse biochimique des protéines.

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Imagerie de protéines centrosomales pendant la spermatogenèse chez la drosophile est une méthode puissante pour identifier de nouvelles protéines essentielles pour la biologie centrosome ainsi que d'élucider la fonction particulière de joueurs connus dans ce processus.

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Ce protocole décrit la dissection et la culture de testicules intacts et de kystes germinaux à partir de pupes de Drosophila melanogaster. Cette méthode permet l’observation microscopique de la spermatogenèse ex vivo. De plus, nous décrivons un test pharmacologique de l’effet des inhibiteurs sur des étapes spécifiques du développement des cellules germinales dans les testicules nymphaux.

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L’objectif de cette technique de courge tubule est d’évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de mettre au point les spermatocytes de souris tout en préservant l’intégrité cellulaire. Cette méthode permet l’étude de toutes les étapes de la spermatogenèse et peut être facilement mis en œuvre aux côtés d’autres approches biologiques biochimiques et moléculaires pour l’étude de la méiose de souris.

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Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

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