Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de

L'objectif général de cette procédure est de disséquer et de préparer des testicules d'oph pour la microscopie. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les paires de testicules à partir de l'abdomen de mouches mâles. La deuxième étape consiste à déchirer les testicules au stade de développement approprié et à les écraser afin de libérer les cellules qu'ils contiennent.

Ensuite, les testicules écrasés sont fixés, puis incubés avec les anticorps primaires et secondaires. La dernière étape consiste à monter le tissu sur une lame pour l'observation en microscopie. Enfin, une microscopie en contraste de phase ou en immunofluorescence est utilisée pour observer les cellules à différents stades de la spermatogenèse afin de détecter d'éventuelles anomalies morphologiques, ainsi que pour visualiser la localisation subcellulaire de diverses protéines.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie du développement, notamment à l'identification des rôles critiques des protéines au cours de la spermatogenèse. La démonstration visuelle de la dissection des testicules de Drosophile est cruciale, car un débutant dans cette technique peut éprouver initialement des difficultés à localiser les testicules dans l'abdomen de la mouche. En outre, il est plus facile de montrer, plutôt que de décrire par des mots, la manière la plus efficace d'appliquer l'écrasement du tissu.

Pour commencer la dissection, anesthésiez les mouches dans un flacon ou un tube à l’aide d’un courant de dioxyde de carbone. Ensuite, transférez les mouches anesthésiées sur un tapis à mouches. Triez les mouches au microscope stéréoscopique à l’aide d’un petit pinceau pour collecter environ six à huit mâles oph du génotype souhaité.

Ensuite, retirez les ailes de chaque mouche à l’aide de pinces. Cela empêchera les mouches de flotter dans le liquide. Pendant la dissection, ajoutez 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS en une seule goutte sur une plaque de dissection recouverte de silicone et placée sur un fond noir.

Ensuite, orientez la pince vers l'extrémit­é antérieure d'une des mouches désarmées. Saisissez-la par le thorax et plongez-la dans la goutte de PBS. Repérez la structure brun foncé située à l'extrémit­é postérieure de l'abdomen ventral, puis utilisez une autre paire de pinces pour saisir les organes génitaux externes et les tirer vers l'arrière jusqu'à ce qu'ils se détachent de l'abdomen.

Dans la plupart des cas, les testicules, les vésicules séminales et la glande accessoire seront retirés de l'abdomen avec les organes génitaux externes. Toutefois, s'ils ne le sont pas, insérez une paire de forceps dans l'abdomen et extrayez délicatement les testicules. Séparez les testicules des glandes accessoires et des organes génitaux externes à l'aide de deux paires de forceps.

Différencier les testicules de type sauvage des tissus blancs adjacents par leur couleur jaune. Pour préparer l'échantillon en vue d'une observation en direct, utiliser une pince pour placer délicatement deux à trois paires de testicules dans une goutte de quatre à cinq microlitres de PBS sur un coverslip carré en verre. Ensuite, déchirer.

Ouvrez chaque testicule avec une pince à un niveau approprié afin de maximiser la présence des types cellulaires germinaux souhaités dans la préparation. Le contenu des testicules s'écoulera par la zone déchirée sur la lame. Pendant l'étape d'écrasement destinée à enrichir en spermatogonies et en spermatocytes, déchirez les testicules à proximité de leur extrémité apicale pour favoriser cet enrichissement.

Pour les spermatocytes et les spermatides, déchirez les testicules à un endroit légèrement basal par rapport au niveau un afin d'enrichir en cellules germinales plus matures. Ouvrez les testicules plus près de l'endroit où commence la courbure. L'étape suivante consiste à écraser les testicules en plaçant délicatement une lame de microscope sur la lamelle.

Ne pas appliquer de pression manuellement et éviter de piéger des bulles d'air. Utiliser l'échantillon dans les 15 minutes suivant sa préparation afin d'observer les cellules vivantes. En microscopie de contraste de phase, absorber délicatement l'excès de liquide sous la lamelle à l'aide d'un essuie-tout propre pour aplatir la préparation jusqu'à ce que les cellules germinales soient nettement au point.

Plonger rapidement les lames préparées contenant des testicules écrasés dans de l'azote liquide à l'aide d'une pince métallique, jusqu'à ce que les bulles cessent. Retirer immédiatement la lamelle avec une lame de rasoir. Ensuite, transférer les lames à l'aide de la pince métallique vers un porte-lames en verre prérefroidi rempli d'éthanol glacé à 95 %, puis conserver l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Transférez les lames équilibrées dans un porte-lames en verre rempli de formaldéhyde à 4 % dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 ou du PBST, et laissez-les à température ambiante pendant sept minutes. Ensuite, transférez les lames dans un porte-lames rempli de PBS. Lavez les lames dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante en éliminant la solution du porte-lames et en la remplaçant par une solution fraîche de PBS.

Répétez le lavage une fois. Éliminez le PBS et immergez les lames dans du PBST pendant 30 minutes à température ambiante afin de permeabiliser les membranes cellulaires. Lavez ensuite les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Tracez un cercle autour du tissu écrasé sur la lame à l’aide d’un stylo à barrière hydrophobe afin de confiner les solutions d’anticorps et de maintenir le tissu humide en tout temps pendant la réalisation de l’immunomarquage.

Ensuite, ajouter de 30 à 40 microlitres d'anticorps primaire dilué dans du PBST sur le tissu à l'intérieur du cercle. Incuber la lame dans une chambre humide et sombre pendant deux heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius après l'incubation avec l'anticorps primaire. Laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, ajouter 30 à 40 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué à la fluorescéine, dilué dans du PBS, sur le tissu et incuber à l’abri de la lumière pendant une à deux heures à température ambiante. Puis, laver les lames trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite 30 à 40 microlitres de solution DAPI sur le tissu à l’intérieur du cercle.

Placez délicatement une lame de couverture en verre sur le tissu, en prenant bien soin d'éviter de piéger des bulles d'air. Si des bulles d'air apparaissent, déplacez soigneusement la lame de couverture sans endommager l'échantillon jusqu'à ce que les bulles s'échappent par les bords. Absorbez l'excès de liquide aux bords de la lame à l'aide d'un chiffon de nettoyage.

Ensuite, scellez la lame avec du vernis à ongles et observez les cellules immuno-marquées au microscope fluorescent dans les trois à quatre heures suivant la préparation. Ce schéma illustre la localisation des différents niveaux de maturation cellulaire dans les testicules de drosophile. Le niveau un contient des cellules plus jeunes, au stade initial de la spermatogenèse, tandis que le niveau trois contient des cellules spermatiques plus matures.

Le niveau deux contient une population mixte de cellules germinales mitotiques et post-mitotiques. Une image correspondante en contraste de phase montre la libération de spermatogonies ainsi que de spermatocytes primaires précoces et tardifs lorsque les testicules sont déchirés au niveau un. La flèche jaune indique également la fusion de deux cellules ou plus interconnectées en raison d'une cytokinèse incomplète.

Un artefact de la procédure d’écrasement illustrée ici est une image correspondante en contraste de phase montrant la libération de spermatocytes primaires tardifs et de cellules post-mitotiques, notamment des spermatides rondes, des spermatides allongées et des spermatozoïdes matures, lorsque les testicules ont été déchirés au niveau deux. L'imagerie en contraste de phase des testicules écrasés peut également être utilisée pour identifier facilement les défauts présents dans les abondantes spermatides rondes. Des spermatides sauvages, possédant un noyau unique clair en phase, sont montrées ici attachées à un agrégat mitochondrial unique sombre en phase, d'une taille approximativement équivalente.

En revanche, les spermatides issues des testicules de Aun contiennent plusieurs petits noyaux et un gros agrégat mitochondrial en raison d'une cytocinèse défaillante et d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes. Les images en niveaux de gris présentées ici proviennent d'une préparation de testicules écrasés, colorées avec des réactifs permettant d'identifier en couleur les microtubules, l'ADN et les centrosomes. Les images combinées montrent un spermatocyte en division, un vaste champ de spermatides arrondis et un faisceau de spermatozoïdes matures. Une fois maîtrisée, la préparation des échantillons pour la microscopie en contraste de phase peut être réalisée en 20 à 30 minutes.

La préparation des échantillons pour la microscopie en immunofluorescence peut être réalisée en six heures si elle est effectuée correctement. En plus du traitement des testicules d'oph pour la microscopie, les testicules disséqués peuvent être utilisés alternativement pour l'analyse biochimique des protéines.