Immunohistochimie des larves de drosophile

<em>Drosophila</em> Larval IHC

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila Larval IHC

3.2: Drosophila Maintenance

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08:29 min

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May 10, 2013

Overview

L’immunohistochimie (IHC) est une technique utilisée pour observer la présence et la localisation de protéines dans les tissus. Les larves de drosophiles sont particulièrement propices à l’IHC en raison de la facilité de leurs procédures de marquage. Les larves sont de plus transparentes, de sorte que certains tissus peuvent être observés sans dissection.

En IHC, les protéines sont ultimement détectées grâces aux anticorps qui se lient spécifiquement aux « épitopes » contenus dans les protéines d’intérêt. Les tissus doivent être fixés avant le marquage pour préserver ces épitopes. De plus les cellules doivent être rendues perméables par l’addition de détergents afin de permettre aux anticorps de pénétrer les membranes. Cette vidéo donne une vision détaillée des réactifs, outils et procédures nécessaires au marquage de tissus larvaires disséqués, procédures comprenant les étapes de fixation, de blocage et de marquage. Cette vidéo présente également les techniques de montage de tissus pour la microscopie à fluorescence. Elle se termine en donnant quelques exemples de leur vaste domaine d’applications (ainsi que quelques variations).

Procedure

La Drosophila melanogaster est un organisme modèle faisant l’objet de nombreuses études en raison de sa polyvalence et de sa facilité d’utilisation.

L’immunohistochimie effectuée sur les préparations de larves de drosophile est une méthode très utile pouvant fournir des informations sur la présence, l’emplacement et la co-localisation de protéines.

Cette vidéo portera sur les méthodes essentielles de dissection, fixation, blocage et montage de tissus larvaires de drosophile et fournira des exemples d’utilisation.

L’immunohistochimie est un procédé qui utilise des anticorps modifiés pour cibler des protéines spécifiques dans les tissus, se lier à elles et finalement permettre leur observation.

L’immunohistochimie des larves de drosophiles repose sur la qualité de la dissection. Celle-ci demande de la précision et de la rapidité en raison de la sensibilité des tissus de larves.

La dissection est généralement effectuée dans une solution tampon de phosphate ou « PBS » (phosphate buffered saline en anglais).

Après l’extraction, les organes sont placés temporairement dans une solution saline de PBS ayant le même pH que le pH interne de la larve.

La dissection est suivie par la fixation au cours de l’IHC de larves de drosophile.

La fixation est un procédé suivant lequel un tissu est placé dans une solution à base de formol dilué, étape qui conduit à sa préservation.

Cette solution de fixation empêche la dégradation enzymatique des protéines dans le tissu.

Suite à la fixation, plusieurs étapes de lavage ont lieu au cours du processus d’immunomarquage ; ces lavages utilisent du PBS contenant du Triton-X, appelé PBS-T.

Le Triton-X100 apporte une faible quantité de détergent qui altère la tension de surface et perméabilise la cellule, permettant l’entrée d’anticorps et autres réactifs.

Après la fixation et les lavages, le tissu est prêt pour le blocage.

La solution de blocage contient des protéines qui se lient au tissu et occupent des sites de fixation non-spécifiques auxquels les anticorps adhèreraient en leur absence. Le blocage permet d’éviter un faux positif pour le signal de protéines.

Apres le blocage, le tissu est prêt pour le marquage.

Le marquage inclut un anticorps “primaire” hautement spécifique qui se fixe à une protéine cible appelée antigène.

Un anticorps « secondaire » conjugué à une molécule marqueur se lie à l’anticorps primaire.

La molécule marqueur émet un signal localisé – souvent fluorescent – qui peut être observé.

Après chaque étape d’incubation des anticorps, l’excès d’anticorps non liés spécifiquement est éliminé par rinçage.

Après le marquage, l’échantillon doit être monté.

Le tissu doit être monté avec soin sur des lames afin d’observer les résultats du marquage.

Une résine ou milieu de montage est utilisé pour recouvrir le tissu.

L’échantillon est alors prêt pour l’observation au microscope.

Maintenant que nous avons présenté les principes de l’immunohistochimie de la drosophile, nous sommes prêts pour observer son déroulement.

Dans cette vidéo, nous porterons notre attention sur les réactifs, les outils et les procédés utilisés pour l’immunohistochimie du cerveau de la larve de drosophile, en commençant par la fixation.

Le procédé que nous employons utilise le cerveau entier et est connu comme le « whole mount staining » ou marquage sur organe entier.

Bien que les techniques de dissection diffèrent suivant les types de tissus considérés pour l’expérience, les principales étapes de l’IHC restent les mêmes donc nous passerons directement à l’étape de fixation.

Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.

Une fois la dissection du cerveau de larve achevée, retirez la solution de PBS à l’aide d’une pipette.

Ajoutez le fixateur et incubez selon votre propre protocole. Pour le cerveau, utilisez une durée de 23 minutes.

Après la fixation, rincez vos échantillons quatre fois au PBS-T.

Incubez vos échantillons dans une solution de blocage pendant au moins 30 minutes à température ambiante.

Equilibrez les cerveaux dans la solution de montage pendant une heure.

Après équilibration, transférez les cerveaux sur une lame en utilisant une pipette p200 dont la pointe de pipette a été coupée.

Placez des pièces d’espacement autour de l’échantillon afin d’éviter qu’il ne soit écrasé.

Placez une lamelle sur l’échantillon.

Scellez les bords de la lamelle au vernis à ongles. Les cerveaux de larves sont maintenant prêts à l’observation par immunohistochimie.

Maintenant que nous avons décrit l’immunohistochimie des cerveaux de drosophile, explorons d’autres manières d’utiliser les procédures de l’IHC.

Des techniques de dissection et de fixation alternatives peuvent être employées pour la préparation des larves de drosophiles pour l’imagerie.

Dans cette expérience, les chercheurs veulent comprendre comment les cellules génèrent leurs formes spécifiques.

Ils font cela en suivant les morphologies des cellules terminales de la trachée des larves.

Les chercheurs utilisent une lignée de mouches mutantes qui exprime la GFP.

L’expression de la GFP est induite dans l’échantillon par exposition à la chaleur dans un bain d’eau-marie.

Les larves sont choisies sous microscope de dissection à fluorescence.

Les mouches émettant de la fluorescence indiquent l’activation de la GFP.

Ces mouches sont soumises à une forme alternative de fixation par la chaleur et aucune dissection n’est nécessaire.

Après l’utilisation d’un logiciel pour aider au traçage, les morphologies cellulaires des branches de trachées et l’intensité lumineuse sont identifiées.

L’ovaire de la drosophile est un excellent modèle pour comprendre comment les cellules souches interagissent avec leur environnement cellulaire.

L’IHC des ovaires de drosophiles commence par l’identification des femelles de drosophile par la présence d’ovaires, par opposition aux testicules qui sont visibles chez les mâles.

Les larves femelles recueillies sont transférées dans des cupules individuelles où elles sont soigneusement disséquées afin d’obtenir une structure contenant les ovaires, connue en tant que corps gras.

Les corps gras sont fixés et marqués. Puis, après disposition des tissus sur les lames, les ovaires sont séparés du tissu de corps gras. Après le montage et l’observation des lames, le marquage fluorescent révèle l’emplacement des cellules somatiques et des cellules germinales primordiales dans l’ovaire larvaire.

L’immunohistochimie des larves de drosophiles a de nombreux parallèles avec l’IHC de la pupe et de l’adulte.

Par exemple, les chercheurs peuvent utiliser l’IHC pour observer les rétines de drosophile à différentes étapes de développement: larvaire, pupale et adulte; et peuvent ainsi illustrer la différence entre les procédures d’immunohistochimie pour ces différentes étapes.

Les résultats montrent les différentes étapes du développement de la rétine de drosophile.

L’immunohistochimie de la larve de drosophile est un outil ayant de nombreuses applications et variations. Dans cette vidéo, nous avons couvert les procédures d’immunomarquage des larves comprenant la dissection, la fixation, le marquage et le montage. Merci de votre attention!

Transcript

Drosophila melanogaster is a widely studied model organism due to its versatility and facility of use.

Immunohistochemistry performed on Drosophila larval preparations is an invaluable method that can provide information on the presence, location, and the co-localization of proteins.

This video will cover the essential methods for the dissection, fixation, blocking, and mounting of Drosophila larval tissue and examples of their applications.

Immunohistochemistry is a process that uses modified antibodies to target, bind, and ultimately visualize specific proteins in tissue.

Immunohistochemistry of Drosophila larva hinges on proper dissection, which demands accuracy and timeliness due to the sensitivity of larval tissue.

Dissection is typically done in phosphate buffered saline, or “PBS” for short.

Upon extraction organs are temporarily placed in PBS – a saline solution with the same pH as the internal pH of the larva.

After dissection the next step in Drosophila larva IHC is fixation.

Fixation is a process where tissue is placed in a diluted formaldehyde-based solution, which preserves tissue.

This fixing solution prevents the enzymatic breakdown of proteins in tissue.

Following fixation, several washing steps occur throughout the immunostaining process using PBS containing Triton-X, called PBST.

Triton-X100 provides a small amount of detergent that serves as a surface tension breaker and permeabilizes the cell, allowing antibodies and other reagents to enter.

After fixation and washing, the tissue is ready for blocking.

Blocking solution contains proteins that bind to tissue and occupy non-specific binding sites to which the target-specific antibodies would otherwise adhere. Blocking helps to prevent a false positive protein signal.

After blocking the tissue is prepared for staining.

Staining incorporates highly-specific “primary” antibody that binds to a target protein called an antigen.

A “secondary” antibody conjugated to a reporter molecule binds the primary antibody.

The reporter molecule emits a localized signal that can be visualized, which is often fluorescent in nature.

Following each antibody incubation step, excess antibody is washed off to remove any antibodies that have bound nonspecifically.

After the staining process, the sample must be mounted.

In order to see the results of staining, the tissue must be carefully mounted onto slides.

A thick reagent or mounting medium is used to encase the tissue.

The sample is then ready to be viewed under the microscope.

Now that we’ve gone through the principles of Drosophila immunohistochemistry, we’re ready to see how it’s done.

In this video we’ll focus on the reagents, tools, and processes used in the immunohistochemistry of the Drosophila larval brain beginning with fixation.

The process we are following uses the entire brain and is known as whole mount staining.

While the dissection procedure differs depending on the tissue type used for the experiment, the major steps of IHC remain the same so we’ll skip to the fixation step.

Once dissection of larval brains is complete, remove PBS with a pipette.

Add fixative and incubate for according to your specific protocol, for brains use 23 min.

Following fixation, wash samples four times in PBST.

Incubate samples in blocking solution for at least 30 min room temperature.

Using the appropriate dilutions, incubate in primary antibody solution overnight at 4 °C.

After the incubation period wash brains four times in PBST with a pipette tip at room temperature.

Incubate the samples in secondary antibody overnight at 4 °C in the dark to prevent the fluorophores from bleaching.

Again, wash brains four times in PBST.

Equilibrate the brains in mounting medium for one hour.

After equilibration transfer the brains to a slide using a p200 pipette with the tip cut off.

Place spacers around the sample to prevent it from being crushed.

Place a coverslip over the samples.

Seal the slip edges with nail polish. Larval brains are now ready to be visualized with immunohistochemistry

Now that we’ve covered the immunohistochemistry of Drosophila brains, let’s go through some alternative ways of applying IHC procedures.

Alternative dissection and fixation techniques can be used to prepare Drosophila larva for imaging.

In this experiment, researchers want to learn how cells generate specific shapes.

They do this by tracing the morphologies of larval tracheal terminal cells.

The researchers take advantage of a mutant fly line that expresses GFP.

The GFP expression is induced by exposure to heat in a water bath

Larvae are selected under a dissection microscope with fluorescence.

Flies emitting fluorescence indicate successful activation of GFP.

These flies are submitted to an alternative form of fixation by heat; no dissection is necessary.

After using software to assist tracing, cellular morphologies of tracheal branches and lumen are identified .

The Drosophila ovary is an excellent model for understanding how stem cells interact with their cellular environment.

IHC of Drosophila ovaries begins by identifying Drosophila females by presence of ovaries versus testes, which are apparent in males.

Collected female larvae are transferred to individual wells where they are carefully dissected to obtain a structure known as the fat body, which houses the ovaries.

Fat bodies are fixed and stained, and then – after placing the tissue on slides – the ovaries are separated from fat body tissue. After mounting and visualizing the slides, fluorescent staining reveals the location of somatic cells and primordial germ cells in the larval ovary .

Immunohistochemistry of Drosophila larvae has many parallels to pupal and adult IHC.

For example, researchers can use IHC to look at Drosophila retinas at different developmental stages: larval, pupal, and adult, thereby illustrating the difference between pupal, larval, and adult immunohistochemistry procedures.

Results show the various stages of development of Drosophila retinas.

Immunohistochemistry of Drosophila larva is a tool with a large amount of applications and variations. In this video we covered the procedures for immunostaining larvae including dissection, fixation, staining, and mounting. Thanks for watching!