Analyse de l'apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

L’objectif global de cette procédure est d’analyser des embryons entiers de poisson-zèbre entre le stade de quatre cellules et 32 heures après la fécondation pour détecter la présence et l’emplacement de cellules apoptotiques. Ceci est accompli en enrobant d’abord les embryons au moment souhaité. Ensuite, les embryons sont fixes et perméables.

Ensuite, les embryons sont incubés avec un anticorps anti-caspase 3 de lapin, suivi d’un anticorps secondaire anti-lapin marqué par fluorescence pour marquer par fluorescence les cellules apoptotiques. Enfin, les embryons sont analysés par microscopie à fluorescence. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des différences dans le nombre et l’emplacement des cellules apoptotiques entre le contrôle et les embryons traités ou mutants par immunofluorescence.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’analyse des cellules apoptotiques par coloration orange Aine ou le test tunnel, est que le test Caspase 3 est une méthode hautement reproductible et relativement peu coûteuse pour les expériences dans lesquelles une documentation photographique et/ou une quantification des cellules apoptotiques sont nécessaires sur plusieurs échantillons. Shelly SOLs, une étudiante diplômée de mon laboratoire, et Christian Tono, un technicien de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Préparez 50 millilitres de 4 % de para formaldéhyde ou PFA en ajoutant de la poudre PFA, le bouclier XPBS de la lumière et remuez à 60 degrés Celsius pendant une heure pour dissoudre à quatre degrés Celsius pendant un mois ou à moins 20 degrés Celsius pendant deux ans.

Préparez 100 millilitres de méthylcellulose à 4 % en chauffant 30 millilitres d’eau à 80 degrés Celsius. Ajoutez ensuite quatre grammes de méthylcellulose et remuez pour dissoudre à température ambiante. De quatre heures à toute la nuit.

Portez le volume à 100 millilitres et mélangez à quatre degrés Celsius pendant une heure. Conservez-les à température ambiante, collectez les embryons immédiatement après la fécondation et laissez-les se développer jusqu’au point temporel souhaité entre le stade de quatre cellules et 32 heures après la fécondation ou HPF quatre embryons entre le stade de bourgeon caudal et 32 HPF. Retirez le corion en incubant les embryons dans 100 microlitres de 10 milligrammes par millilitre.

Pronase dans 10 millilitres d’un x eau d’œuf pendant 30 minutes. À température ambiante. Versez lentement la solution de pronase.

Ajoutez un x eau d’œuf et répétez le rinçage deux fois de plus. Transférez ensuite jusqu’à 40 embryons dans un tube de 1,5 millilitre et utilisez un millilitre d’un X-P-B-S-T pour rincer deux fois après avoir retiré tout sauf environ 100 microlitres de PBT. Ajouter un millilitre de 4 % de PFA.

Posez les tubes sur le côté dans un récipient de taille appropriée pour faciliter le transport et placez-les sur une bascule douce à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou jusqu’à une semaine après la fixation des embryons. Retirez la majeure partie de la solution PFA et ajoutez soigneusement un millilitre de méthanol 100 % glacé. Posez les tubes sur le côté et placez-les à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures.

Alternativement, les embryons peuvent être laissés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à 24 heures. Après l’incubation, laissez les embryons se déposer au fond du tube avant de retirer la majeure partie du méthanol et d’ajouter soigneusement un millilitre d’un XPBS avec 0,3 % de trite x et 1 % de DMSO. Retirez immédiatement le PDT et remplacez-le par un PDT frais.

Ensuite, posez les tubes sur le côté et balancez-les pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir soigneusement retiré la majeure partie de la PDT, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage et assurez-vous que l’embryon reste émergé en solution Secouez doucement pendant une heure à température ambiante. Ensuite, ajoutez un microlitre d’anticorps anti-caspase 3 de lapin et des anticorps non enragés supplémentaires.

Si vous le souhaitez, bercez doucement les embryons pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré la solution d’anticorps, ajoutez un millilitre de PDT pour rincer rapidement les embryons. Remplacez ensuite par du PDT frais et basculez doucement pendant 30 minutes à température ambiante.

Avant de répéter le lavage, retirez le lavage PDT et répétez l’étape de blocage. Ajoutez ensuite les anticorps secondaires conjugués Fluor quatre appropriés. Protégez-vous de la lumière et bercez-le doucement pendant une heure à température ambiante sous un microscope fluorescent avec le filtre approprié.

Analysez les embryons dans un XPDT. Si les commandes positives ont une fluorescence brillante avec un bruit de fond minimal, transférez-les dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres avec une fine couche de méthylcellulose à 4 % ou une lame de dépression avec une grosse goutte de méthylcellulose à l’aide d’une sonde inclinée. Orientez un embryon d’intérêt pour l’imagerie, en prenant des images qui représentent l’intensité de la fluorescence et les motifs observés dans la majorité des embryons de cet échantillon.

Cette figure montre que l’injection d’embryons avec de fortes concentrations d’ARNm codant pour le puissant proto-BH trois seulement. Des protéines telles que BIM ou NOA donnent rapidement naissance à la caspase trois active. Au stade de développement des quatre cellules, la mort embryonnaire se produit ensuite en l’espace d’une heure.

Aux stades ultérieurs du développement, l’intensité de la fluorescence est plus robuste. Par exemple, on voit ici des cellules positives à la caspase trois actives brillantes dans des embryons au stade sphérique qui ont été injectés avec des niveaux modérément toxiques d’ARNm codant pour le BH trois pro-apoptotique seulement. Le gène messager de Puma, l’ARN, codant pour le gène antia potto BCL deux a été co-injecté pour prouver que l’injection d’ARNm de Puma induit l’apoptose par la voie intrinsèque médiée par les mitochondries.

L’apoptose induite par l’IR et le poisson zèbre nécessitent la transcription médiée par P 53 de BH trois seuls gènes tels que le puma. Le retard dans l’apoptose induite par l’IR montré ici est cohérent avec l’exigence d’une transcription médiée par P 53. Le protocole caspase trois devrait donner lieu à un rapport signal sur bruit robuste.

Cette figure compare le résultat optimal du dosage de la caspase à trois résultats à deux résultats sous-optimaux courants qui surviennent lorsque des étapes critiques sont compromises, comme indiqué dans la section de discussion du protocole textuel. Le premier est un faible rapport signal/bruit dû à la fluorescence de fond dans les tissus animaux, et le second est la fluorescence du vitellus qui détourne l’attention du signal d’intérêt. Enfin, comme le montre ici, des expériences de co-marquage utilisant des lignées transgéniques exprimant la GFP, des tissus approximatifs subissant une apoptose, le transgénique OLE two EGFP VU, 12 line-tags, motoneurones et oligodendrocytes, et le transgénique elev L trois EEG FP line-tags, tous différenciant les neurones.

Les résultats suggèrent que les neurones et les oligodendrocytes sont sensibles à l’apoptose induite par l’IR à la suite de cette procédure. D’autres méthodes telles que la coloration avec des anticorps primaires spécifiques aux tissus et l’aspiration d’embryons peuvent être effectuées afin de déterminer l’identité exacte des cellules subissant l’apoptose.