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Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Analyse fonctionnelle du circuit d'alimentation des larves dans Drosophila

Full Text

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09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Le circuit de l'alimentation chez la drosophile larves melanogaster propose un modèle simple mais puissant qui permet de modifier la fréquence d'alimentation pour être en corrélation avec des modifications dans les circuits neuronaux stomatogastrique. Ce circuit est composé de neurones sérotoninergiques centraux qui envoient des projections vers les crochets buccaux ainsi que l'intestin antérieur.

Transcript

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser le système de modèle de la drosophile pour corréler les sorties comportementales avec les changements dans l’architecture neuronale. Ceci est accompli en mettant d’abord en place des cages de population de drosophiles adultes pour collecter les larves. La prochaine étape de la procédure consiste à évaluer les capacités locomotrices des larves de la fin du deuxième au début du troisième stade.

La troisième étape consiste à évaluer le comportement alimentaire des larves en observant l’extension et la rétraction de leurs crochets buccaux. La dernière étape consiste à disséquer et à préparer des échantillons ventriculaires éprouvés de larves du troisième stade supérieur à l’aide de techniques immunohistochimiques. En fin de compte, les résultats peuvent montrer comment les aberrations de l’architecture neuronale au cours du développement sont liées aux changements de comportement grâce à l’utilisation combinée de tests comportementaux et de microscopie d’immunofluorescence.

Les implications de cette technique s’étendent vers une meilleure compréhension du développement de l’architecture neuronale, ce qui permet de mieux comprendre l’évolution des maladies neurologiques. La démonstration de la procédure sera faite par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Maintenez les cages de population de drosophiles à 25 degrés Celsius sur un cycle d’obscurité légère de 12 heures.

Tant que le groupe témoin et le groupe expérimental sont exposés aux mêmes conditions d’éclairage, cette technique peut être réalisée dans un laboratoire standard. À l’aide des populations établies, prélevez les larves en laissant les femelles pondre des œufs pendant la nuit avec du jus de pomme. Changez l’assiette le matin et placez une petite cuillerée de levure au centre de l’assiette recueillie.

La levure attirera les larves éclores, permettra aux œufs de se développer pendant 24 heures à 25 degrés Celsius et, le lendemain, recueillera les premières larves de stade de la pâte. À l’aide d’une spatule métallique, transférez les larves dans une assiette de jus de pomme frais ou de jus de raisin. De la pâte de levure supplémentaire peut être ajoutée pour nourrir les larves jusqu’à ce que les tests soient effectués pour recueillir les larves du deuxième et du troisième stade

.

Pendant cette période, les taux d’alimentation sont constants pour la collecte. Les larves du troisième stade tardif élèvent les larves dans des bouteilles. L’élevage de larves du troisième stade tardif sur des plaques de jus peut être nocif en raison de l’accumulation d’agri dans le système gastrique somatique.

L’âge d’une larve peut être confirmé par la morphologie du crochet buccal car il y a des changements distincts dans cette structure. Pour chaque moisissure larvaire, prélevez les larves de la fin du deuxième et du début du troisième stade en lavant doucement et abondamment la plaque de jus avec de l’eau et en versant les larves dans un filtre à mailles, puis procédez à l’analyse comportementale. Placez une seule larve de la fin du deuxième au début du troisième stade sur un substrat à 2 % d’acer dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres, et laissez les larves s’acclimater pendant 30 secondes pendant exactement une minute.

À l’aide d’un compteur, chaque mouvement postérieur à antérieur sur le substrat marque chaque contraction qui se produit sur les trois quarts du corps de l’animal. Lorsque les larves se balancent d’un côté à l’autre, mais ne changent pas réellement de position, ces mouvements ne sont pas marqués. Parfois, une contraction complète de l’avant vers l’arrière génère un mouvement vers l’arrière comme une locomotion vers l’avant.

La locomotion à reculons est également notée. Remplacez la plaque de test après avoir testé un total de 10 animaux au maximum. Effectuer au moins 20 enregistrements par condition expérimentale.

Noter chaque larve utilisée dans l’essai locomoteur dans l’essai d’alimentation à l’aide d’inox émoussé. Numéro cinq, une pince à épiler. Transférez soigneusement une larve de la plaque agricole locomotrice au centre d’une plaque remplie d’agri recouverte de cinq millilitres d’une solution de levure homogène.

Dans la solution de levure, les larves resteront en grande partie en place et l’alimentation est directement corrélée au taux de contractions du crochet buccal, qui sont considérées comme l’extension et la rétraction des droits de scle pharyngée du céphalon Permettez aux larves de s’acclimater pendant 30 secondes, puis pendant une minute, enregistrez le nombre de contractions du crochet buccal à l’aide d’un compteur. Commencez par charger du formaldéhyde de qualité 4 % EM fraîchement préparé dans du PBS dans un verre à trois puits. Transférez ensuite une larve errante du troisième stade dans une boîte de dissection avec PBS.

Avec une pince, tenez l’extrémité postérieure et avec l’autre, tenez les crochets buccaux tout en maintenant l’extrémité postérieure immobile. Tirez doucement sur les crochets buccaux pour accéder aux tripes. Retirez tous les tissus associés comme les glandes salivaires, le cerveau, le corps adipeux, etc.

Transférez ensuite chaque intestin dans le plat à trois puits contenant le fixateur de formaldéhyde. Incuber les intestins à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans une boîte de culture de tissus opaque. Le lendemain, avant de retirer la solution de fixation, retirez la seca gastrique et coupez l’intestin moyen près des ventricules éprouvés afin que les projections puissent être clairement vues sans obstacle.

Maintenant, remplacez le fixateur par un XPBT et laissez les tissus incuber pendant 10 minutes avec un léger balancement. Effectuez ce lavage PBT six fois. Ensuite, ajoutez de la sérotonine, qui améliorera la signalisation de la sérotonine sans affecter l’architecture neuronale.

Ensuite, incubez les tripes pendant une heure à quatre degrés Celsius sans basculer. Au bout d’une heure, lavez soigneusement les intestins avec du PBT six fois comme cela a été fait pour éliminer l’anticorps primaire. Ensuite, incubez les intestins pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps primaire anti-sérotonine.

Le lendemain, répétez les six lavages PPT et poursuivez avec l’incubation secondaire de l’anticorps à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Utilisez un à 400 Alexa floor 5 68 chèvre anti-US, ou un à 400 anti lapin IgG. Retirez l’anticorps secondaire à l’aide du régime de lavage PBT, puis incubez les intestins dans quatre millimolaires de carbonate de sodium avec un léger balancement pendant 10 minutes.

Les intestins peuvent ensuite être montés dans du gallate de propyle à 4 % N avec du carbonate de sodium de 20 millimolaires comme tampon et visualisés sous fluorescence à un grossissement de 400 x pour l’analyse. Évitez de prendre des images à l’extrémité postérieure des ventricules éprouvées, car ces fibres sont étroitement regroupées. Plus de fibres postérieures dans l’intestin moyen sont plus ramifiées car elles fasciculent une fois qu’elles pénètrent dans le tissu.

Les fibres de neurite peuvent être quantifiées à l’aide de logiciels commerciaux tels que neuro lucita et neuro Explorer, en les calculant manuellement ou en utilisant le logiciel disponible gratuitement. De simples images de traceur de nérite qui ne sont pas claires rendront difficile la distinction entre la fibre et les varicosités et ne doivent pas être utilisées si l’architecture de la fibre se distingue clairement de l’arrière-plan. Et si des varicosités individuelles peuvent être identifiées le long de la longueur de la nérite, la préparation est appropriée pour l’analyse.

De plus, si des varicosités individuelles peuvent être identifiées à partir du reste de la fibre, c’est un autre indicateur d’une image de qualité pour l’analyse. Les fibres axonales projetées du cerveau sont regroupées dans le nerf de récidive et ne peuvent pas être analysées jusqu’à ce qu’elles atteignent le ventricule éprouvé où elles se séparent et s’innervent. Le système gastrique stéamatique Analysez toutes les fibres à l’exception de celles hors de portée.

Dans certains cas, les fibres se courbent entre plusieurs plans de foyer, tracent les projections de fibres individuelles du cerveau vers les ventricules éprouvées et comptent les varicosités et les branches, puis calculent la fréquence des grandes varicosités par unité de longueur. L’étude du circuit alimentaire sérotoninergique est efficace pour analyser l’influence de facteurs particuliers sur le développement du système nerveux. En quantifiant le taux d’alimentation, il est possible de relier l’architecture axonale du circuit d’alimentation à sa sortie fonctionnelle.

Le test locomoteur ne montre aucune différence dans les réponses locomotrices entre les génotypes témoins et mutants. Si les mutations n’affectent que le circuit d’alimentation, le corps ellipsoïde mutant s’ouvre. EBO trois présente un défaut structurel dans le corps ellipsoïde du complexe central.

La souche parentale de type sauvage. Le CSWU a révélé que l’OE trois entraîne une diminution de l’alimentation alors que la locomotion n’est pas affectée. Les défauts de développement des mutants de l’OE trois ont affecté l’architecture urate de l’intestin.

Ces larves présentaient plus de ramifications ainsi que plus de varicosités, petites et grandes, le long de la longueur de l’urate. Notez les nœuds de branche au niveau des flèches, les varicosités au niveau des pointes de flèches et les grandes varicosités au niveau de l’astérisque. Ces changements dans la ramification neuronale ont été quantifiés pour l’analyse statistique.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas endommager les larves ou les échantillons de tissus disséqués.

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