Name: Analyse fonctionnelle du circuit dalimentation des larves dans Drosophila /i (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T16:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez l'analyse fonctionnelle du circuit d'alimentation des larves de Drosophila melanogaster. Cette méthode combine tests comportementaux et microscopie à immunofluorescence pour étudier les liens entre architecture neuronale et comportement.

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Les auteurs tiennent à remercier le Fonds de recherche du Président de l&#39;Université de Saint Louis attribué à WSN

Une. Entretien de Cages Population <ol><li> Maintenir les cages de la population à 25 ° C sur un cycle lumière-obscurité de 12 h. Tant que les groupes témoins et expérimentaux sont exposés aux mêmes conditions d&#39;éclairage, alors cette technique peut être réalisée dans un environnement de laboratoire standard. </li><li> Permettre aux femmes de nuit pondent des œufs sur les pommiers plaques jus-agar. </li><li> Recueillir les larves nouvellement écloses par le maintien des plaques avec des oeufs nouvellement déposés à 25 ° C pendant 24 heures. Placer une petite cuillerée de levure dans le centre de la plaque d&#39;attirer larves écloses. </li><li> Recueillir 1 er stade larvaire qui ont migré dans la pâte de levure dans le centre de la plaque de jus de pomme. Utilisez une spatule en métal pour la transférer sur une plaque de jus de pomme frais. La pâte de levure supplémentaires peuvent être ajoutées pour assurer une alimentation suffisante il est jusqu&#39;à ce que les tests sont réalisés. des plaques à base de jus de raisin peut également être utilisé à la place de plaques à base de jus de pomme. </li><li> Obtenir la fin de 2 ème-début 3e stade larvae en permettant 1er larvaires à l&#39;âge de 40-48 heures. Dans cette gamme les taux d&#39;alimentation sont constants 13. L&#39;âge peut être confirmé par un examen de la bouche des crochets comme il ya des changements distincts dans cette structure avec chaque mue larvaire. </li><li> Late 2 3 ème stade larvaire précoce-ème sont recueillis pour des analyses de comportement par doucement et longuement lavage des plaques à base de jus de pomme à l&#39;eau et à recueillir les larves sur un filtre à mailles. Les larves sont ensuite transféré dans une plaque de gélose. </li><li> Toutes les analyses sont effectuées en parallèle en utilisant des animaux témoins et expérimentaux. </li></ol> 2. Paradigm comportementale - Locomotion <ol><li> Placez un seul 3 ème stade larvaire sur un substrat de gélose à 2% dans une boîte de culture de tissu de 100 mm et permettre à la larve de s&#39;acclimater pendant 30 sec. Les larves utilisent leurs sclérites cephalopharyngeal (bouche crochets) pour propulser leur corps à travers la surface du substrat agar. Cela se fait sur une plaque séparée, parce que jet est plus difficile de visualiser les contractions du corps dans la solution de levure en tant que l&#39;animal est pratiquement la même couleur que la levure. </li><li> Observer et noter chaque postérieur au mouvement antérieur sur le substrat pour une période de 1 min. n = 20 pour chaque génotype. Pas plus de 10 animaux doivent être testés par plaque. </li></ol> 3. Comportement Paradigm - Alimentation <ol><li> Utilisation de mousses Inox # 5 pinces, transférer soigneusement la 3 ème stade larvaire de la plaque de gélose locomotrice au centre d&#39;une plaque d&#39;agar-remplie recouvert avec 5 ml de la solution de levure de boulanger 2% activé. Assurez-vous que la solution est homogène que la levure se dépose au fil du temps. Lorsque dans la solution de levure, les larves en grande partie rester en place et l&#39;alimentation, ce qui facilite l&#39;observation du comportement. Le taux de bouche contractions de crochet est en corrélation directe avec la quantité de nourriture ingérée 14. </li><li> Laisser larve de s&#39;acclimater pendant 30 sec. </li><li> Observer et noter le nombre debouche contractions de crochet pour une période de 1 min. n = 20 pour chaque génotype. </li></ol> 4. Les dissections Gut larvaires <ol><li> Faire une solution de formaldéhyde de fixation 4% EM-grade 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et placer dans un verre de tache 3 puits. </li><li> Disséquer soigneusement errant fin 3 e stade larvaire tripes dans un plat en verre de 3 puits en utilisant une solution PBS 1x, en s&#39;assurant que chaque fois que le proventricule est laissée intacte. Avec une pince, tenir l&#39;extrémité postérieure, et l&#39;autre, maintenir les crochets buccaux. Tout en maintenant le immobile extrémité postérieure, tirez doucement sur la bouche des crochets pour accéder aux tripes. Retirez tous les tissus associés (glandes salivaires, le cerveau, le corps gras, etc), puis transférer chaque intestin à l&#39;antenne 3 puits contenant le correctif de formaldéhyde. Errant 3 e stade larvaire sont utilisés parce que, à ce stade de développement, la larve cesse de s&#39;alimenter en préparation pour la nymphose, et le proventricule est effacé de la levure. </li> &lt;li&gt; Incuber tripes à 4 ° C pendant une nuit dans une boîte de culture de tissu opaque. </li><li> Avant de retirer la solution de formaldéhyde de fixation des puits, enlever le caecum gastrique et couper l&#39;intestin moyen ~ 150 um 2 du proventricule de sorte que les projections peuvent clairement être considérées sans obstacle. </li><li> Retirer formaldéhyde solution dans les puits et les remplacer par 1x PBT (1x PBS, 0,1% de sérum albumine bovine libre de protéase, X-100 0,1% de Triton) solution tampon. Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Placer les échantillons de tissus sur un rotateur mécanique tout en faisant des lavages. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 1 h à 10 -6 M 5-HT pour améliorer la signalisation de la sérotonine. Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Des études antérieures ont démontré que cette concentration de 5-HT exogène n&#39;affecte pas l&#39;architecture neuronale ou la densité de varicosités dans les analyses immunohistochimiques et augmente simplement le rapport signal à bruit de 15 à 16. </li><li> Incuber à 4 et# 176; C pendant une nuit dans l&#39;anticorps primaire anti-sérotonine (monoclonal dirigé à la souris ou au lapin polyclonal). Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Placer les échantillons de tissus sur un rotateur mécanique tout en faisant des lavages. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 90 min dans l&#39;anticorps secondaire (Alexa Fluor 568 de chèvre anti-souris ou anti-IgG de lapin, dilution 1:400). Laver soigneusement les tripes 6x pendant 10 min dans 1x PBT. Placer les échantillons de tissus sur un rotateur mécanique tout en faisant des lavages. </li><li> Incuber dans du carbonate de sodium 4 mM pendant 10 min sur un agitateur mécanique, puis monter à 4% de carbonate de sodium gallate/20 mM de n-propyle, et vue en fluorescence. Le carbonate de sodium est utilisé pour convertir les échantillons à la mémoire tampon et le pH utilisé dans le milieu de montage médias. </li><li> Capturer des images d&#39;échantillons de tissus immunocolorées à un grossissement de 400X pour analyse. </li></ol> 5. Analyse de Neural Circuits <ol><li> fibres de neurites ont été quantifiés (nombre et taille des variceset le degré de ramification) en utilisant Neuroleucida et Neuroexplorer. Toutefois, cela peut également être réalisée manuellement ou en utilisant Simple Neurites Tracer (une application qui peut être téléchargée en ligne gratuit). </li><li> Tracer les projections de fibres individuelles du cerveau vers le proventricule et de quantifier le nombre de varicosités, les branches et le nombre de grandes varicosités par unité de longueur. Les fibres axonales saillie du cerveau sont regroupés dans le nerf recurrens et ne sont pas accessibles pour l&#39;analyse jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le proventricule où ils se séparent et fasciculées. </li></ol>

<ol><li>Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+neurotransmitters+act+like+growth+factors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Why do neurotransmitters act like growth factors?</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 Forthcoming.</li>
<li>Herlenius, E., Lagercrantz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+and+neuromodulators+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum.+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters and neuromodulators during early human development.</a> Early Hum. Dev. 65, 21-37 Forthcoming.</li>
<li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li>
<li>Sodhi, M., Sanders-Bush, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin and brain development.</a> International Review of Neurobiol. 59, 111-174 (2004).</li>
<li>Goldberg, J., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+the+neurotransmitter+serotonin+during+development+of+the+Helisoma+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system.</a> Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).</li>
<li>Goldberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+regulation+of+neurite+outgrowth+in+identified+neurons+from+mature+and+embryonic+Helisoma+triyolvis%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis.</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).</li>
<li>Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+selectively+inhibits+growth+cone+motility+and+synaptogenesis+of+specific+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons.</a> Sci. 226, 561-564 (1984).</li>
<li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Dev. Neurosci. 32, 217-237 Forthcoming.</li>
<li>De Vry, J., Schreiber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+selected+serotonin+5-HT+1+and+5-HT+2+receptor+agonists+on+feeding+behavior%3A+possible+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).</li>
<li>Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+can+eat%3A+Establishing+the+existence+of+a+central+pattern+generator+for+feeding+in+third+instar+larvae+of+Drosophila+virilis+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).</li>
<li>Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+stomatogastric+nervous+system+associated+with+the+foregut+in+Drosophila+melanogaster+and+Calliphora+vicin+third+instar+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae.</a> J. Morphol. 269, 272-282 (2008).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Bhatt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+actions+of+dopamine+on+the+development+of+a+serotonergic+feeding+circuit+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Cent+NeuroSci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster.</a> Biomed Cent NeuroSci. 13, 26(2012).</li>
<li>Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+larval+feeding+behavior+in+Drosophila+melanogaste%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste.</a> Genet. Res. 24, 163-173 (1975).</li>
<li>Joshi, A., Mueller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+higher+feeding+rate+in+Drosophila+due+to+density-dependent+natural+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection.</a> Evolution. 42, 1090-1093 (1988).</li>
<li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li>
<li>Sykes, P., Condron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+sensitivity+to+serotonin+of+Drosophila+varicosities+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system.</a> Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+inC.+elegansand+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+sensing+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">Temperature sensing across species.</a> Pflugers Archives. 454, 777-791 (2007).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Développement aberrant du circuit stomatogastrique sérotoninergique, qui se produit à la fin de l&#39;embryogenèse, aura une incidence sur sa fonction mature. Les changements dans l&#39;architecture des neurites innervant l&#39;intestin peut être corrélée à la sortie fonctionnelle du circuit, qui est le taux d&#39;alimentation (mesurée par la bouche contractions de crochet dans une solution de levure) (Figure 1). L&#39;utilisation du système bipartite UAS-Gal4 chez la drosophile permet de cible...

Drosophile est un système modèle extrêmement puissant pour étudier le développement des circuits neuronaux en raison du temps de génération rapide, à faible coût expérimental, et la capacité de manipuler et contrôler les facteurs génétiques et environnementaux. Neurogenèse, recherche de chemin neuronal et la synaptogenèse sont conservés entre l&#39;homme et la drosophile, par conséquent les mécanismes de création, le maintien et la modification des circuits de neurones sont conservés ainsi. Neurotransmetteurs classiques, tels que la sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) peuvent servir de facteurs de croissance avant l&#39;adoption de leurs rôles en tant que molécules de signalisation dans le circuit neuronal maturité 1-3 Des études antérieures ont montré que les niveaux perturbée 5-HT au cours de l&#39;embryogenèse modifier la connectivité des neurones matures 4. D&#39;autres ont montré que l&#39;application ectopique de la 5-HT aux neurones en culture Helisoma réprimer la croissance des neurites ainsi que la synaptogenèse 5-7. En Drosophila, développement des niveaux de 5-HT sont en relation inverse avec le nombre et la taille des varicosités ainsi que le degré de aborization, le long de la longueur des neurites en saillie à partir de l&#39;intestin antérieur du SNC 8. Neurotransmission sérotoninergique a été montré pour moduler les comportements alimentaires dans diverses espèces, y compris chez la drosophile 9.8. Le circuit d&#39;alimentation de la drosophile est un circuit relativement simple qui peut être utilisé comme modèle pour mettre en corrélation la sortie fonctionnelle (d&#39;alimentation) avec des modifications dans la mise au point des projections axonales à partir du cerveau de l&#39;intestin antérieur. Schoofs et al. ont montré que l&#39;alimentation des larves de drosophile est régie par des générateurs de motifs centraux qui influencent la musculature 10. Bien que l&#39;anatomie musculaire spécifique n&#39;est pas complètement élucidé, il a été démontré que le nerf antennaire, nerf maxillaire, et le nerf accessoire prothoracic sont responsables des cibles musculaires impliqués dans lecomportement alimentaire. La plupart des données concernant la musculature et le nerf anatomie de l&#39;alimentation des invertébrés est limité pour les larves de Calliphora. Le taux d&#39;alimentation des larves de deuxième stade peut être évaluée par la rétraction des sclérites cephalopharyngeal (bouche crochets), et est reproductible et à haut débit. Les plaques cephalopharyngeal sont innervés par les fibres du centre de neurones 5-HT par l&#39;intermédiaire du nerf frontal. Le proventricule, ou l&#39;intestin antérieur, est innervée par des fibres sérotoninergiques (recurrens nerf) qui fasciculés dans l&#39;intestin moyen et sont responsables de contractions de l&#39;intestin antérieur (figure 1) 11-12. Les changements dans la ramification axonale, et le nombre et la taille des varicosités le long de la longueur des neurites, peuvent être quantifiés en utilisant des techniques d&#39;immunohistochimie. La manipulation de la 5-HT neuronale au cours du développement, soit directement, soit indirectement, peut modifier la sortie fonctionnelle de ce circuit d&#39;alimentation, qui peut être évalué et en corrélation avec l&#39;évolution de la morphogy de l&#39;architecture des neurites.

<table><tbody><tr><td>Microscope Eclipse E-800 Nikon</td><td>Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuroleucida</td><td>MBF Biosciences</td><td>NL-15</td><td>Utilisé pour analyser l’architecture des fibres intestinales, pas besoin d’avoir</td></tr><tr><td>Northern Eclipse</td><td>Empix Inc</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>G-2E/C TRITC EX 528-553</td><td>Nikon Instruments</td><td>96312</td><td>Filtre pour anticorps</td></tr> <tr><td>secondaire spécifiqueN.A. 0,75 ; L. 0,72 mm ; Prisme DIC : 40xI, 40x I-C ; </td><td>Instruments Nikon à</td> ressort <td>MRH00400</td><td>Objectif utilisé pour l’imagerie</td></tr> Simple <tr><td>Neurite Tracer</td><td>NIH Image J</td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer">http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer</a></td></tr></tbody></table>

analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans drosophila</i

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Le circuit d&#39;alimentation sérotoninergique chez Drosophila melanogaster de larves peut être utilisé pour étudier les substrats neuronaux d&#39;une importance critique au cours de la mise au point du circuit. Utilisation de la sortie fonctionnelle du circuit, l&#39;alimentation, les changements dans l&#39;architecture neuronale du système stomatogastrique peut être visualisée. Le comportement alimentaire peut être enregistrée par l&#39;observation du taux de rétraction des crochets de la bouche, qui reçoivent l&#39;innervation du cerveau. comportement locomoteur est utilisé en tant que contrôle physiologique pour l&#39;alimentation, étant donné que les larves utilisent leurs crochets de la bouche à parcourir à travers un substrat de gélose. Les changements dans le comportement alimentaire peuvent être corrélées avec l&#39;architecture axonale des neurites innervant l&#39;intestin. Utilisation de l&#39;immunohistochimie, il est possible de visualiser et de quantifier ces modifications. Une mauvaise manipulation des larves pendant paradigmes de comportement peut modifier les données car ils sont très sensibles aux manipulations. Imagerie appropriée de l&#39;architecture des neurites innervantl&#39;intestin est critique pour la quantification précise du nombre et de la taille des varicosités ainsi que de l&#39;étendue de noeuds de branche. L&#39;analyse de la plupart des circuits de permettre seulement à la visualisation de l&#39;architecture des neurites ou des effets comportementaux, mais ce modèle permet de corréler la sortie du circuit fonctionnel avec les déficiences de l&#39;architecture neuronale.

Le circuit d&#39;alimentation sérotoninergique dans la larve de drosophile peut servir de modèle extrêmement efficace pour observer l&#39;influence de certains facteurs sur le développement du système nerveux. En quantifiant le taux d&#39;alimentation, il est possible de relier l&#39;architecture axonale du circuit d&#39;alimentation dont la sortie fonctionnelle (figure 1). Le dosage locomotrice est utilisé en tant que contrôle physiologique pour les rétractions de la bouche des crochets, étant...

Le circuit de l&#39;alimentation chez la drosophile larves melanogaster propose un modèle simple mais puissant qui permet de modifier la fréquence d&#39;alimentation pour être en corrélation avec des modifications dans les circuits neuronaux stomatogastrique. Ce circuit est composé de neurones sérotoninergiques centraux qui envoient des projections vers les crochets buccaux ainsi que l&#39;intestin antérieur.

Analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser le modèle biologique de Drosophila afin de corréler les comportements observés avec des modifications de l'architecture neuronale. Cela est réalisé en premier lieu en mettant en place des cages de population d'adultes de Drosophila pour collecter des larves. L'étape suivante de la procédure consiste à évaluer les capacités locomotrices des larves en fin de deuxième stade à début de troisième stade larvaire.La troisième étape consiste à évaluer le comportement alimentaire des larves en observant l'extension et le retrait de leurs crochets buccaux. La dernière étape consiste à disséquer et à préparer des échantillons ventriculaires confirmés de larves en fin de troisième stade larvaire à l'aide de techniques d'immunohistochimie. En définitive, les résultats peuvent montrer comment les anomalies de l'architecture neuronale durant le développement sont liées aux changements comportementaux grâce à l'utilisation combinée de tests comportementaux et de microscopie d'immunofluorescence.Les implications de cette technique s'étendent à une meilleure compréhension du développement de l'architecture neuronale, ce qui permet de mieux comprendre l'évolution des maladies neurologiques. La réalisation de la procédure sera assurée par Prag Bot, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Maintenir les cages de population de drosophiles à 25 degrés Celsius selon un cycle lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.À condition que les groupes témoin et expérimentaux soient exposés aux mêmes conditions d'éclairage, cette technique peut être réalisée dans un laboratoire standard. À l'aide de populations établies, recueillir les larves en laissant les femelles pondre leurs œufs toute la nuit sur des plaques d'agar au jus de pomme. Changer la plaque le matin et déposer une petite quantité de levure au centre de la plaque recueillie.La levure attirera les larves écloses ; laissez les œufs se développer pendant 24 heures à 25 degrés Celsius, puis, le jour suivant, récupérez les larves de premier stade à partir de la pâte. À l’aide d’une spatule métallique, transférez les larves sur une plaque fraîche contenant du jus de pomme ou du jus de raisin. Vous pouvez ajouter de la pâte de levure supplémentaire pour nourrir les larves jusqu’à ce que les tests soient effectués afin de collecter les larves de deuxième stade et de troisième stade précoce ; laissez les larves de premier stade vieillir de 40 à 48 heures.Pendant cette période, les taux d'alimentation sont constants pour la collecte. Les larves de troisième stade tardif sont élevées dans des bouteilles. Élever des larves de troisième stade tardif sur des plaques de jus peut être nocif en raison de l'accumulation de résidus agricoles dans le système gastrique somatique.L'âge des larves peut être confirmé par la morphologie des crochets buccaux, car cette structure présente des modifications distinctes. À chaque mue larvaire, recueillir les larves en fin de deuxième et début de troisième stade larvaire en lavant doucement et abondamment la plaque de jus avec de l'eau, puis en versant les larves dans un filtre en maille, avant de procéder à l'analyse comportementale. Placer une seule larve en fin de deuxième ou début de troisième stade sur un substrat à 2 % d'acér, dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres, et laisser les larves s'acclimater pendant exactement une minute, soit 30 secondes.À l’aide d’un compteur, comptabilisez chaque mouvement de l’arrière vers l’avant sur le substrat et notez chaque contraction qui se produit sur les trois quarts de la longueur du corps de l’animal. Lorsque la larve oscille d’un côté à l’autre sans changer réellement de position, ces mouvements ne sont pas comptabilisés. Parfois, une contraction complète de l’avant vers l’arrière provoque un déplacement vers l’arrière similaire à la locomotion vers l’avant.La locomotion rétrograde est également évaluée. Remplacez la plaque d'essai après avoir testé au maximum 10 animaux au total. Effectuez au moins 20 enregistrements par condition expérimentale.Évaluer chaque larve utilisée dans le test de locomotion dans le test d’alimentation à l’aide d’une pince en inox numéro cinq. Transférer délicatement une larve depuis la plaque contenant le milieu agar pour la locomotion vers le centre d’une plaque contenant de l’agar recouverte de cinq millilitres d’une solution homogène de levure.Dans la solution de levure, les larves resteront principalement en place et leur alimentation est directement corrélée au taux de contractions des crochets buccaux, visibles sous forme d'extensions et de rétractions du céphalon et des sclérites pharyngés. Laissez les larves s'acclimater pendant 30 secondes, puis enregistrez pendant une minute le nombre de contractions des crochets buccaux à l'aide d'un compteur. Commencez par charger du formaldéhyde fraîchement préparé de qualité EM à 4 % dans du PBS dans une lame porteuse à trois alvéoles en verre. Ensuite, transférez une larve de troisième stade en phase de déambulation dans une boîte de dissection contenant du PBS.Avec une pince, maintenez l'extrémité postérieure, et avec l'autre, saisissez les crochets buccaux tout en maintenant l'extrémité postérieure immobile. Tirez délicatement sur les crochets buccaux pour accéder aux intestins. Retirez tous les tissus associés tels que les glandes salivaires, le cerveau, le corps gras, etc.Ensuite, transférez chaque tube digestif dans la boîte de culture à trois puits contenant la solution de fixation au formaldéhyde. Incubez les tubes digestifs à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans une boîte de culture opaque. Le jour suivant, avant de retirer la solution de fixation, retirez les cæques gastriques et sectionnez le mésentéron près des ventricules antérieurs afin que les projections puissent être clairement observées sans entrave.Remplacez maintenant le fixateur par un XPBT et laissez les tissus incuber pendant 10 minutes avec un mouvement doux de balancement. Effectuez ce lavage PBT six fois. Ensuite, ajoutez de la sérotonine, ce qui renforcera la signalisation sérotoninergique sans affecter l'architecture neuronale.Incubez ensuite les intestins pendant une heure à quatre degrés Celsius sans agitation. Après une heure, lavez soigneusement les intestins avec du PBT six fois afin d'éliminer l'anticorps primaire. Incubez ensuite les intestins toute la nuit à quatre degrés Celsius avec l'anticorps primaire anti-sérotonine.Le lendemain, répétez les six lavages au PPT puis effectuez l'incubation avec l'anticorps secondaire à quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Utilisez un Alexa Fluor 568 anti-IgG de chèvre anti-US à une dilution de 1/400 ou un anti-IgG de lapin à une dilution de 1/400. Éliminez l'anticorps secondaire en utilisant le protocole de lavage au PBT, puis incubez les intestins dans du carbonate de sodium à quatre millimolaire avec agitation douce pendant 10 minutes.Les intestins peuvent ensuite être montés dans du gallate de propyle 4 % N avec du carbonate de sodium 20 millimolaire comme tampon et observés en fluorescence à un grossissement de 400 x pour l'analyse. Évitez de prendre des images à l'extrémité postérieure des ventricules prouvés car ces fibres sont étroitement regroupées. Les fibres plus postérieures dans l'intestin moyen sont plus ramifiées car elles fasciculent une fois qu'elles pénètrent dans le tissu.Les fibres neuritiques peuvent être quantifiées à l'aide de logiciels commerciaux tels que Neuro Lucita et Neuro Explorer, soit manuellement, soit à l'aide de logiciels librement accessibles. Des images de traçage de nérites simples mais peu nettes rendront difficile la distinction entre la fibre et les varicosités, et ne devraient pas être utilisées si l'architecture de la fibre se distingue clairement du fond. En revanche, si des varicosités individuelles peuvent être identifiées le long de la longueur du nérite, le prélèvement est adapté à l'analyse.En outre, si des varicosités individuelles peuvent être identifiées parmi le reste de la fibre, cela constitue un autre indicateur d'une image de qualité pour l'analyse. Les fibres axonales provenant du cerveau sont regroupées dans le nerf récurrent et ne conviennent pas à l'analyse tant qu'elles n'ont pas atteint le ventricule prouvant, où elles se séparent et innervent. Analysez toutes les fibres, à l'exception de celles qui se trouvent en dehors de la plage de mise au point.Dans certains cas, les fibres s'incurvent entre plusieurs plans de mise au point ; il faut alors suivre les projections individuelles des fibres depuis le cerveau jusqu'aux ventricules prouvés, compter les varicosités et les branches, puis calculer la fréquence des grandes varicosités par unité de longueur. L'étude du circuit sérotoninergique de l'alimentation est efficace pour analyser l'influence de facteurs particuliers sur le développement du système nerveux. En quantifiant la fréquence d'alimentation, il est possible de relier l'architecture axonale du circuit alimentaire à sa sortie fonctionnelle.Le test de locomotion ne montre aucune différence dans les réponses locomotrices entre les génotypes contrôles et mutants. Si les mutations n'affectent que le circuit alimentaire, le corps elliptique mutant est ouvert. EBO trois présente un défaut structurel dans le corps elliptique du complexe central.La souche parentale de type sauvage. L'analyse CSWU a révélé que l'EO trois entraîne une diminution de l'alimentation, tandis que la locomotion n'est pas affectée. Les défauts de développement chez les mutants EO trois ont altéré l'architecture des urates dans l'intestin.Ces larves présentaient un ramification plus importante ainsi que davantage de varicosités, petites et grandes, le long de la longueur de l'urate. Remarquez les nœuds de ramification au niveau des flèches, les varicosités au niveau des têtes de flèches et les grandes varicosités au niveau de l'astérisque. Ces modifications de la ramification neuronale ont été quantifiées pour une analyse statistique.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas endommager les larves ni les échantillons de tissus disséqués.

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