Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l'aide d'un In Vitro Respect de dosage

L’objectif global de cette procédure est d’examiner la capacité d’un lèveur probiotique à cellules streptocoques à inhiber l’adhérence du pneumocoque à une lignée cellulaire épithéliale. Ceci est accompli en préparant d’abord les monocouches de cellules épithéliales CCL 23. Dans une plaque à 24 puits, les slovaires et les pneumocoques sont ajoutés à la monocouche en séquence et les cellules sont incubées.

Dans la dernière étape, les puits sont lavés pour éliminer les bactéries non adhérentes. Les cellules épithéliales du CCL 23 sont lysées et le contenu du puits est récolté. En fin de compte, l’impact du salivarius sur l’observance du pneumocoque peut être évalué en quantifiant le nombre de pneumocoques associés aux cellules.

Cette méthode aide à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies infectieuses, telles que la question de savoir si les probiotiques peuvent inhiber l’adhésion des agents pathogènes bactériens tels que le pneumocoque. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons commencé à étudier l’utilisation potentielle de l’hypnose des lactobacilles, du GG et d’autres probiotiques dans les voies respiratoires. La veille de la scission de l’expérience en culture de confluence, CCL 23 cellules épithéliales, puis les diluer dans un milieu préchauffé à une concentration de 150 000 cellules par millilitre dans un tube stérile de 50 millilitres.

Ensuite, ensemencez un millilitre de cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire traitée à 24 puits et incubez les cellules pendant la nuit. Ensuite, à l’aide d’une boucle de 10 microlitres, inoculez 10 à 12 colonies bien séparées de chaque culture bactérienne dans une aliquote de 10 millilitres de bouillon Todd Hewitt plus 0,5 % d’extrait de levure. Vortex brièvement et incuber les cultures pendant 14 à 16 heures le jour de l’expérience.

Vortex chacune des cultures bactériennes pendant trois à cinq secondes, puis ajoutez 100 microlitres de pneumocoques et 100 microlitres de salive dans des tubes préchauds étiquetés, contenant 10 millilitres de bouillon. Vortex les tubes inoculés pendant trois à cinq secondes et incubez à 37 degrés Celsius pour faire pousser les cultures jusqu’à la phase mi-logarithmique. Après avoir confirmé qu’au moins 80 % de la culture cellulaire CCL 23 est fluide, à l’aide de la pipette de transfert, retirer le milieu de chaque puits de la plaque à 24 puits, en inclinant légèrement la plaque pour éviter de perturber la monocouche cellulaire, puis laver les puits deux fois en ajoutant environ 500 microlitres de PBS préchauffé et en retirant délicatement le liquide à l’aide d’une pipette de transfert.

Inclinez la plaque pendant les lavages pour aider à préserver la monocouche après le deuxième lavage. Ajoutez 500 microlitres de milieu de préchauffage dans chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur pendant que vous préparez les cultures bactériennes. Tout d’abord, mesurez la densité optique d’un millilitre de la culture de lévare à 600 absorbants.

Transférez ensuite cinq millilitres de la culture de Sal Levarius dans un tube de 10 millilitres et centrifugez dans tube pendant quatre minutes à 1 870 G à température ambiante. Après avoir jeté le SNAT Resus, suspendre la pastille dans 200 à 1000 microlitres de chlorure de sodium à 85 % selon la lecture de la DO jusqu’à une concentration finale d’environ 1,5 fois 10 à la neuvième unité formant colonie par millilitre. L’ajout du bon nombre de bactéries est la partie la plus délicate de l’expérience, car le nombre réel de bactéries ajoutées n’est déterminé que lorsque le comptage des colonies est effectué le lendemain.

Transférez maintenant l’inoculum salivaire remis en suspension dans un tube de micro-fuge étiqueté haut. Diluez la concentration élevée à un à 10 et à 100 dans plus de chlorure de sodium à 85 % pour obtenir des concentrations moyennes et faibles d’alvar pour les tubes vortex d’essai entre les dilutions afin de créer les puits de contrôle de l’héparine. Retirez 40 microlitres de milieu de chaque puits de contrôle et ajoutez 50 microlitres d’héparine à une concentration finale de 100 unités par millilitre par puits.

Ajoutez 10 microlitres de chlorure de sodium à 85 % aux cellules CCL 23 uniquement, et les cellules CCL 23 plus pneumocoques ne puits que complètement vortex toutes les concentrations des zones SIV. Ajoutez ensuite 10 microlitres de 1 à 10 et 1 à 100 siv non dilués à différentes concentrations dans les puits appropriés pour favoriser le contact bactérien avec la cellule. Centrifugez la plaque pendant trois minutes à 114 G à température ambiante, puis incubez la plaque pendant une heure pendant que les cellules sont en incubation, diluez en série la salive au point 85 % de chlorure de sodium et utilisez un épandeur stérile pour disperser 100 microlitres de dilutions de 10 à moins cinq, de 10 à moins six et de 10 à moins sept en double sur des plaques de gélose au sang de cheval.

Cultivez les plaques en position inversée pendant la nuit vers la fin de la monocouche comme incubation des salves. Mesurez la densité optique de la culture pneumococcique, puis faites pivoter un millilitre de cellules. Resus suspend la pastille dans 300 à 2000 microlitres de chlorure de sodium à 85 % selon la lecture de la DO jusqu’à une concentration finale d’environ 150 millions d’unités formant colonies par millilitre.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de pneumocoques non dilués dans tous les puits sauf les puits de contrôle négatifs, centrifugez à nouveau la plaque à 24 puits, puis incubez les co-cultures pendant trois heures pendant l’étape d’incubation. Diluez et plaquez en série le stock de pneumocoque de la même manière que le salivarius. Après trois heures d’incubation, vérifiez les cellules au microscope pour tout effet cytopathique.

Retirez maintenant le milieu de chaque puits et lavez doucement les co-cultures trois fois avec un XPBS pour éliminer les bactéries non adhérentes, en prenant soin de ne pas déranger les monocouches. Ensuite, les cellules sont alimentées avec 200 microlitres de 0,1 % de dioxyde de carbone pendant sept minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de THB à chacun.

Pipetez le puits de haut en bas plusieurs fois et récoltez les suspensions cellulaires de chaque puits dans des microtubes à centrifuger étiquetés. Enfin, diluez en série les pneumocoques adhérents, puis comptez les colonies le lendemain sur les plaques de dilution appropriées. Pour quantifier les pneumocoques et les alvars dans ce tableau, les résultats d’une expérience représentative dans laquelle les pneumocoques ont été ajoutés à des cellules CCL 23 une heure après l’ajout de slovar sont présentés.

Les résultats A-Q-P-C-R étaient cohérents entre les deux méthodes pour le nombre absolu de bactéries et le pourcentage d’observance. Normalisé en fonction du nombre de pneumocoques adhérents dans les puits contenant uniquement des pneumocoques.

L’héparine est utilisée comme témoin car elle est connue pour inhiber l’observance du pneumocoque. Par conséquent, la réduction de l’observance d’environ 40 % ou plus dans les échantillons de pneumocoques et d’héparine par rapport au pneumocoque seul est indicative de la réussite du test. Comme la salive inhibe l’observance pneumococcique d’une manière dose-dépendante où la concentration élevée de salivarius d’environ 10 salive pour un pneumocoque a entraîné la plus faible observance pneumococcique.

Ces greffons démontrent l’adhérence des pneumocoques aux cellules CCL 23 lors de l’ajout de salive, une heure avant les pneumocoques simultanément, ou une heure après les pneumocoques. Alvar est plus efficace pour inhiber l’observance pneumococcique lorsqu’il est ajouté avant l’administration des pneumocoques, car les doses élevées et moyennes d’Alvar ont considérablement réduit l’observance pneumococcique dans l’essai de préédition. Alors que l’édition Coit et la post-édition ne disent que les fortes doses de Slovar inhibaient l’observance du pneumocoque.

Donc, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test in vitro pour mesurer l’inhibition de l’adhésion du pneumocoque par les zones cellulaires du streptocoque probiotique.