Name: Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique laide dun In Vitro Respect de dosage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez comment évaluer l'effet inhibiteur de Streptococcus salivarius sur l'adhérence de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales CCL 23. Cette méthode in vitro permet d'étudier les mécanismes probiotiques contre les infections.

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Ce travail a été soutenu par un financement du Programme opérationnel de soutien de l&#39;infrastructure du gouvernement victorien Institut de recherche et enfants Murdoch.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Une partie essentielle de ce test est d&#39;ajouter les concentrations appropriées de S. salivarius et les pneumocoques dans les sections 3.1.7 et 3.1.12. Les concentrations sont estimées en utilisant les lectures de DO mais l&#39;inoculum exacte ne sont pas déterminés jusqu&#39;à plaques sont comptés le jour suivant. Pour cette raison, nous recommandons d&#39;effectuer des courbes de croissance pour mesurer OD et les numérations viables (UFC / ml) au fil du temps pour toutes les souches bactériennes utilisées ...

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une bactérie à Gram positif qui peut causer des infections comme la pneumonie, l&#39;otite moyenne et la méningite. Il est une cause majeure de maladie chez les enfants dans les pays à faible revenu et responsables d&#39;environ 800 000 décès d&#39;enfants de moins de cinq ans chaque année 1. Les pneumocoques sont souvent effectuée dans le nasopharynx de jeunes enfants. Bien que cette colonisation est généralement considéré comme asymptomatique, elle précède infection pneumococcique et sert de réservoir pour les bactéries dans les populations humaines 2. Vaccination antipneumococcique conjugué réduit efficacement le transport des sérotypes contenus dans le vaccin. Cependant, il ya plus de 90 sérotypes de pneumocoques, et la vaccination peuvent conduire au remplacement de sérotype, dans lequel l&#39;élimination des sérotypes vaccinaux est suivie par une hausse dans le transport et les maladies causées par des sérotypes non vaccinaux 3. En outre, dans certaines populations à haut risque, le pneumocoquecolonisation se produit souvent très tôt dans la vie, avant l&#39;administration de la première dose de vaccin de 4,5. Récemment, l&#39;utilisation de probiotiques a été proposée comme une stratégie supplémentaire pour inhiber la colonisation pneumococcique 6,7. Tests in vitro d&#39;adhérence ont été utilisées pour examiner l&#39;adhésion à pneumocoques 8,9. Ces essais ont été adaptés pour étudier l&#39;impact du probiotique Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sur l&#39;adhésion à pneumocoques 10. En plus de LGG et autres bactéries d&#39;acide lactique, Streptococcus salivarius, un habitant courant de la cavité orale, a été étudiée en tant que probiotique potentiel pour les voies respiratoires en raison de son potentiel et aptitude à inhiber les pneumocoques et d&#39;autres agents pathogènes respiratoires in vitro 11 colonisation - 13. Le protocole présenté ici décrit un essai d&#39;adhérence utilisée pour étudier les effets de la S. salivarius K12 sur l&#39;adhésion à pneumocoquespour la lignée de cellules épithéliales humaines CCL-23. Avant d&#39;utiliser dans l&#39;essai, isolats de pneumocoques ont été évalués pour les capacités d&#39;adhérence, la croissance et les propriétés d&#39;adhérence peuvent varier considérablement parmi les isolats 10,14. Courbes de croissance des pneumocoques et S. salivarius ont été réalisées afin de déterminer la phase semi-logarithmique et la concentration de l&#39;estimation (unités formant des colonies ou CFU / ml) par la densité optique (DO, figure 1). Il est recommandé d&#39;examiner la croissance en compte viable et OD pour chaque isolat avant l&#39;utilisation dans le dosage. Ce test peut être effectué dans un laboratoire avec des équipements standard et de l&#39;équipement de culture de tissus. Dans ce protocole, les effets de trois doses de S. salivarius administré 1 heure avant l&#39;addition des pneumocoques sur l&#39;adhérence de S. pneumoniae PMP843, un sérotype 19F transport isolat provenant d&#39;un écouvillon nasopharyngé, sont examinés. Deux façons de quantifier les pneumocoques adhérent sont présentés: étalement sur gélose au sang pour dissuaderle mien comptes viables, et l&#39;extraction de l&#39;ADN et la détection du gène lytA pneumocoque par qPCR 15. Le protocole de l&#39;essai d&#39;adhérence de base peut être facilement modifié pour tester différentes doses ou le moment d&#39;administration de probiotiques et peut également être utilisé avec d&#39;autres souches de bactéries ou d&#39;espèces.

<table><tbody><tr><td>Média essentiel minimum (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>T-75 Flacon</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cellules CCL-23</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques de gélose au sang de cheval (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Les plaques de gélose au sang de mouton sont également acceptables</td></tr><tr><td>Bouillon Todd-Hewitt</td><td>Oxoid</td><td>CM0189</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>²² ;</td></tr><tr><td>Cuvettes jetables</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>L’héparine</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>se présente sous forme d’ampoules stériles à 5 000 UI/5 m/5 m/bbsp.</td></tr><tr><td>Épandeur stérile</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternativement, un épandeur de verre peut être trempé dans de l’éthanol à 96 % et stérilisé à la flamme avant chaque utilisation</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>²�</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>FDS 20 % solution</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA mini-kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>LytA F primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom made</td><td>5' -> 3' séquence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom made</td><td>5' -> 3' sequence&nbsp ; TCGTGCGTTTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA sonde</td><td>Eurogentec</td><td>Sur mesure</td><td>5' -> 3' séquence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, des fluorophores alternatifs peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 Plaque de détection&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>²� ;</td></tr><tr><td>Bandelettes de capuchon qPCR ultra-transparentes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mx3005 Système QPCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>*d’autres sources sont disponibles pour la plupart/tous les produits répertoriés</td><td></td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; in vitro</em&gt; respect de dosage

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

L&#39;adhésion de Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) à la épithélium du nasopharynx peut entraîner la colonisation et est considéré comme une condition préalable pour les infections à pneumocoques, comme la pneumonie et l&#39;otite moyenne. Tests in vitro d&#39;adhérence peuvent être utilisées pour étudier l&#39;attachement des pneumocoques à des cellules épithéliales monocouches et d&#39;enquêter sur les interventions possibles, comme l&#39;utilisation de probiotiques, d&#39;inhiber la colonisation pneumococcique. Le protocole décrit ici est utilisé pour étudier les effets de la probiotique Streptococcus salivarius sur l&#39;adhésion des pneumocoques à la lignée cellulaire epitheliale humaine CCL-23 (parfois dénommé cellules HEp-2). L&#39;essai comporte trois étapes principales: 1) la préparation des cellules épithéliales et bactériennes, 2) plus de bactéries épithéliales des monocouches de cellules, et 3) la détection des pneumocoques adhérent par les numérations viables (dilution en série et placage) ou quantitative PCR en temps réel (qPCR ). Cette technique est relativement simple et ne nécessite pas d&#39;équipement spécialisé autre qu&#39;une installation de culture de tissu. Le test peut être utilisé pour tester d&#39;autres espèces probiotiques et / ou des inhibiteurs potentiels de la colonisation pneumococcique et peut être facilement modifié pour répondre à d&#39;autres questions scientifiques concernant le respect pneumocoque et l&#39;invasion.

Les résultats d&#39;une expérience représentative dans laquelle les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae PMP843, un isolat coloniser 19F) ont été ajoutés à CCL-23 cellules 1 h après l&#39;addition de S. salivarius, et l&#39;adhésion pneumococcique a été quantifiée par comptage à la fois viable et lytA qPCR sont montrés dans le tableau 2. résultats étaient en accord entre les deux procédés à la fois pour le nombre absolu de bactéries (comme présenté UFC / ml) et le% d&#39;adh...

Les essais in vitro d&#39;adhérence peuvent être utilisés pour étudier la fixation de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales et d&#39;enquêter sur les interventions possibles tels que l&#39;utilisation des probiotiques pour inhiber la colonisation pneumococcique.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Respect de dosage

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la capacité d'une cellule probiotique de Streptococcus levarius à inhiber l'adhérence pneumococcique à une lignée de cellules épithéliales. Cette évaluation est réalisée en préparant d'abord des monocouches de cellules épithéliales CCL 23. Dans une plaque de 24 puits, levarius et pneumocoques sont ensuite ajoutés séquentiellement à la monocouche, puis les cellules sont incubées.Dans la dernière étape, les puits sont lavés pour éliminer les bactéries non adhérentes. Les cellules épithéliales CCL 23 sont lysées et le contenu des puits est récupéré. En fin de compte, l'impact de salivarius sur l'adhérence pneumococcique peut être évalué en quantifiant le nombre de pneumocoques associés aux cellules.Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine des maladies infectieuses, comme de savoir si des probiotiques peuvent inhiber l’adhérence de pathogènes bactériens tels que le pneumocoque. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons commencé à étudier l'utilisation potentielle de Lactobacillus hypnosis, GG et d'autres probiotiques dans le tractus respiratoire. Jane Manning et Zen présenteront cett

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce protocole est un test simple adhésion bactérienne consistant à compter le nombre de colonies bactériennes formant des unités qui sont collées sur des cellules cultivées. Le test est robuste, indépendante de l'adhésine étudié, et de nombreuses variations sont utilisés dans la plupart des laboratoires travaillant sur la pathogenèse bactérienne.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

Source : Jagau, H. et al. Infection à pneumocoque des cellules endothéliales humaines primitives en flux constant. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la visualisation en temps réel de l’attachement du pneumocoque aux chaînes du facteur de von Willebrand (VWF) sur les cellules endothéliales dans des conditions de flux de milieu constant. Il décrit les étapes pour stimuler la libération de VWF, étiqueter les cordes et quantifier la liaison bactérienne.

Évaluation de l’attachement du pneumocoque aux cellules endothéliales humaines primaires sous un flux de milieu constant

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et...

Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

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Un test d’adhérence en phase solide pour évaluer la formation de biofilm

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La détection des interactions pathogènes hôte-bactérien basée sur l’adhérence phénotypique à l’aide de l’imagerie de marquage par fluorescence à haut débit ainsi que de méthodes d’analyse statistique automatisées permet une évaluation rapide des interactions bactériennes potentielles avec les cellules hôtes.

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Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la colonisation de souris avec pks+ Escherichia coli dans des conditions non inflammatoires, ainsi que des méthodes non invasives pour la validation de la colonisation et l’évaluation de l’expansion de pks+ E. coli dans les selles.

Colonisation avec Escherichia coli murine pks+ dans des conditions non inflammatoires

Découvrez comment évaluer l'effet inhibiteur de Streptococcus salivarius sur l'adhérence de Streptococcus pneumoniae à des monocouches de cellules épithéliales CCL 23. Cette méthode in vitro permet d'étudier les mécanismes probiotiques contre les infections.

Étude des effets des probiotiques sur la colonisation pneumococcique l'aide d'un

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