Name: Ablation dune cellule unique de huit cellules dembryons de crustacés amphipodes les Parhyale hawaiensis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Apprenez l'ablation de blastomères uniques chez Parhyale hawaiensis pour l'étude du développement embryonnaire crustacé. Cette méthode permet d'explorer l'évolution et la biologie du développement.

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Nous remercions Rayhan Arif et Hassaan Shahawy pour le travail de la caméra, Tripti Gupta et Frederike Alwes à l&#39;aide d&#39;affiner la technique d&#39;ablation de la cellule, et les membres du laboratoire Extavour pour les informations sur les données, la vidéo et manuscrit. Ce travail a été partiellement financé par l&#39;Institut des cellules souches de Harvard (semences nombre de Grant SG-0057-10-00) de la Fondation Ellison médical (New Scholar nombre Award AG-NS-07010-10) à la CGE, et bourses de recherche du Collège Harvard ARN.

Les commentaires qui pourraient être utiles dans l&#39;exécution de certaines mesures sont indiquées en italique. Une. Jour 1: Préparation des matériaux <ol><li> Préparer les documents suivants (voir le tableau des matériaux et de l&#39;équipement): <ul><li> 15 cm et 22 cm de pipettes Pasteur </li><li> Diamant scribe </li><li> eau de mer artificielle filtrée (salinité entre 0,0018 à 0,0020) contenant 1 mg / ml d&#39;amphotéricine B (1:100 d&#39;une solution stock de 100 mg / ml), 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (1h50 d&#39;une solution mère contenant 5000 unités / ml de pénicilline et 5,000 mg / ml de streptomycine) </li><li> Filtre à eau de mer artificielle (salinité entre 0,0018 à 0,0020) sans additifs </li><li> un récipient en matière plastique à grande pour les couples de logement (au moins 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> petits (3 ou 5 cm) des boîtes de Pétri bordées de Sylgard </li><li> petits (3 ou 5 cm) des boîtes de Pétri </li><li> un verre de montre ou de verre plaque multi-puits </li><li> forceps (nous utilisons le forceps émoussé dérivés vientm old Dumont # 5 pinces qui ont été accidentellement endommagés dans d&#39;autres procédures de laboratoire, que nous avons réutilisés en utilisant une pince à aiguiser pierre à faire en sorte que les extrémités de la pince sont lisses, que les deux dents sont de même longueur, et qu&#39;elles n&#39;ont plus pointes. Pinces très fines, comme les nouveaux Dumont # 5 forceps, sont indésirables car ils peuvent blesser les embryons et / ou des femmes.) </li><li> pipette Pasteur avec fin élargi (étape 1.2 dessous) </li><li> un outil de recherche sur l&#39;embryon constitué d&#39;un mince fil de tungstène courbe intégré dans l&#39;extrémité mince d&#39;une pipette Pasteur (peut être remplacé par un autre de mettre en œuvre, voir 1.3 ci-dessous) </li><li> une pipette de bouche avec une petite ouverture (voir l&#39;étape 1.4 ci-dessous) </li><li> une aiguille de verre fabriqué à partir d&#39;un capillaire en verre tiré (voir étape 1.5 ci-dessous) </li></ul> Pas de substances toxiques pour les êtres humains sont utilisés dans ce protocole. Cependant, les chercheurs doivent s&#39;assurer qu&#39;ils portent des gants ou autres vêtements de protection comme l&#39;exige la guidel de gestion des risquesines de leur institution. </li><li> Pour faire la pipette élargi Pasteur, premier score autour d&#39;une pipette 15 cm de Pasteur à l&#39;endroit où la pipette commence à se rétrécir avec une pointe en diamant, envelopper la région a reçu de la pipette dans une serviette Kimwipe ou papier pour protéger les doigts, puis soigneusement rompre la pointe sur la ligne de score. Tenez l&#39;extrémité cassée de la pipette sur une flamme du brûleur Bunsen pendant plusieurs secondes pour lisser les bords. L&#39;ouverture doit être légèrement plus étroite que la largeur maximale de la pipette. </li><li> Pour rendre l&#39;outil de dissection de fil de tungstène, insérer un fil de tungstène dans l&#39;extrémité d&#39;un 15 cm pipette Pasteur en verre, et maintenez brièvement sur flamme d&#39;un brûleur Bunsen pour faire fondre le verre, fixant le fil en place. Utilisez une pince à courbe doucement l&#39;extrémité du fil en forme de crochet. Voir Figure 3 pour un exemple d&#39;une forme appropriée pour cet outil. </li><li> Pour faire une petite ouverture pour la bouche pipette, tirez l&#39;extrémité mince d&#39;une pipette Pasteur 22 cm en deux vo pièceser une flamme, et rompre la pointe de la petite extrémité. Insérer dans l&#39;extrémité du porte-pipette de la bouche. </li><li> Ajoutez l&#39;aiguille de verre qui sera utilisé pour perforer les blastomères d&#39;intérêt au cours de la procédure d&#39;ablation à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguille. Une aiguille de forme appropriée est représentée sur la Figure 4. Cette aiguille a été tiré sur un extracteur d&#39;aiguilles Sutter P97 utilisant un programme avec des paramètres 2x (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 20, temps = 250) + 1X (chaleur = 566, tirez = 100, vitesse = 100, temps = 250). Le programme et l&#39;instrument spécifique utilisé pour faire l&#39;aiguille peuvent varier, mais l&#39;aiguille doivent avoir une pointe fine, mais aussi être suffisamment solide pour ne pas casser lorsqu&#39;il est poussé contre le chorion de l&#39;embryon. </li></ol> 2. Jour 1: Couples Rassemblement Parhyale accouplement <ol><li> Utilisez la pipette Pasteur élargi (étape 1.2 ci-dessus) pour recueillir l&#39;accouplement P. couples hawaiensis du grand récipient de culture, et les transférer dans un récipient contenant séparé cpencher en eau de mer artificielle. Il n&#39;est pas nécessaire que cette eau de mer filtrée. Il est préférable de recueillir des paires de contact dans l&#39;après-midi plus tard et de laisser les couples à la température ambiante (20-23 º C) pendant la nuit, de sorte que le lendemain matin, la plupart des embryons aura été récemment fécondé et déposé, et donc au début du clivage des stades appropriés pour ablation. Recueillir au moins 20 paires de contact pour s&#39;assurer que certaines femmes seront munis embryons au stade de clivage début le lendemain matin. </li></ol> 3. Jour 2: Rassemblement Parhyale embryons <ul><li> Le lendemain matin, infuser l&#39;eau de mer artificielle filtrée (FASW) de CO 2. Certaines des femmes auront nagé sans leurs hommes pendant la nuit, de recueillir ces femmes séparées et anesthésier les dans FASW / CO 2. Les mâles non appariés restants peuvent être retirés à partir du récipient d&#39;accouplement paire et retournés à la grande culture. Couples reproducteurs restants peuvent être enregistrés pour la collecte des embryons plus tarddans la journée ou le lendemain. </li><li> Transférer une seule femelle anesthésié portant des embryons à un verre de montre dans FASW / CO 2. Toutes les femmes séparées auront probablement déposé des œufs, qui sera visible à l&#39;oeil nu comme rose pâle ou sphéroïdes pourpre à travers les plaques coxales transparentes des femmes (figure 1A). Pour déterminer si les embryons sont à des stades précoces de clivage et donc approprié pour blastomère ablation, le chercheur devra éliminer les embryons de la poche incubatrice et les examiner sous un microscope. </li><li> Affichage de la procédure sous un microscope de dissection, saisir les plaques coxales long d&#39;un côté du corps avec des pinces. Les embryons seront visibles dans la poche incubatrice ventrale entre ces plaques coxales (figure 1B). </li><li> Insérez l&#39;outil de fil mince, courbe (Figure 3; étape 1.3 ci-dessus) dans l&#39;extrémité postérieure de la poche incubatrice, et soulevez doucement le fil vers l&#39;extrémité antérieure de la poche incubatrice de séparer le couvainrevêtements de poche (ceux-ci sont modifiés appendices ventraux appelés oostégites 30), l&#39;ouverture de la poche et desserrer les embryons. Les embryons qui sont dans la première heure ou d&#39;être mis sont tous enfermés dans une membrane transparente très mince qui sera facilement être perturbé par l&#39;outil de fil; cette membrane disparaît d&#39;environ 2-3 heures après la ponte, et les embryons ne sont pas liés à l&#39;autre ou à la femelle en aucune façon partir de ce point tout au long de l&#39;embryogenèse. Si les chercheurs trouvent gênant ou difficile à manoeuvrer l&#39;outil métallique courbé pour éliminer les embryons de la poche incubatrice, une alternative mise en œuvre peut être utilisé, à condition que les mouvements sont doux et pas de pression sévère est appliquée sur les embryons ou la poche incubatrice. Autres outils appropriés pour éliminer les embryons de la poche incubatrice comprennent forceps émoussé ou un capillaire de verre scellée à une extrémité et lissée. </li><li> Utilisez une pipette 15 cm inchangé Pasteur à injecter de l&#39;eau à travers la poche de couvée ouvert, poussant til embryons, ce qui devrait se déposer au fond du verre de la montre. Transférer la femelle pour nettoyer FASW (sans CO 2) pour permettre la récupération avant sa réintroduction à la culture principale. Femelles multiples peuvent être placés dans le même bac de récupération, mais permettent femmes à se remettre complètement avant de les renvoyer à la culture principale, comme ils peuvent être mangés par d&#39;autres animaux si elles sont encore partiellement anesthésiés. </li><li> Utilisez une pipette 15 cm inchangé Pasteur pour transférer les embryons dans une boîte de Pétri avec FASW propre, et voir au microscope afin de déterminer leur stade embryonnaire. Embryons qui sont séparés lors de la troisième clivage (étape 4 de 5), qui sont appropriés pour cette procédure. Il devrait également être possible d&#39;appliquer ce protocole à n&#39;importe quel stade de clivage avant la formation de disque embryonnaire (stades 7 au 8 mai). </li></ul> 4. Jour 2: Ablation cellules isolées <ol><li> Remplissez boîte de Pétri Sylgard doublée d&#39;une couche superficielle de FASW. Utilisez une inchangée 15 cm pi Pasteurpette de transférer un seul embryon à la plaque. </li><li> En utilisant une pince émoussée, rouler doucement l&#39;embryon d&#39;identifier la cellule à l&#39;ablation (Figures 2A et 2B). Le précurseur g de la lignée germinale peut être identifié comme le plus petit micromere, qui se trouve au sommet de la plus petite Mav de macromere. En outre, g ne touche pas directement la cellule en, qui est le micromere directement en face de lui, comme les micromères précurseurs de mésoderme ml et la part de mr une bordure de cellule dans le milieu de l&#39;embryon. Mr le blastomère à droite de g, et ml est la micromere à la gauche de g. Les macromères sœurs de mr, ml, et en sont les précurseurs de l&#39;ectoderme Er, El, et Ep respectivement. </li><li> Avec des pinces dans le left la main si le chercheur est droitier (ou dans la main droite si le chercheur est gaucher), orienter l&#39;embryon avec la cellule d&#39;intérêt vers la droite (ou à gauche si le chercheur est gaucher), et saisir doucement l&#39;embryon entre la pince pour le stabiliser. </li><li> En utilisant une aiguille tirée de verre (de l&#39;étape 1.5 ci-dessus, la figure 4), la perforation doucement la cellule d&#39;intérêt. Ne pas insérer l&#39;aiguille trop loin, afin de ne pas pousser l&#39;aiguille dans les cellules voisines ou en dessous de la cellule d&#39;intérêt. L&#39;aiguille n&#39;a plus qu&#39;à percer le chorion et la membrane de la cellule sous-jacente, et n&#39;a pas besoin de s&#39;étendre profondément dans la cellule à ablater. </li><li> Échanger l&#39;aiguille utilisée pour percer l&#39;embryon pour la fin de verre d&#39;une pipette de bouche avec une amende tiré pointe de la pipette Pasteur (étape 1.4 ci-dessus). Maintenez la pointe de la pipette à proximité du trou créé dans la cellule d&#39;intérêt, et appliquer une aspiration très doux. </li><li> Très presser doucement l&#39;embryon avec la pince. Comme le contenu du blastosimple est poussé hors du chorion par le trou créé à l&#39;étape 4.4, sucer dans la bouche pipette pour permettre une vue dégagée de l&#39;embryon. Si le trou est suffisamment grand, le noyau de la cellule perforé peut être vu à émerger aussi bien. C&#39;est un bon contrôle pour s&#39;assurer que le contenu des cellules entières ont été supprimés et ne peuvent pas être régénérée. </li><li> Observer attentivement l&#39;embryon comme le blastomère d&#39;intérêt est retiré. La bordure de la cellule perforé va reculer vers le trou dans le chorion, ce qui rend les intersections des cellules sous-jacentes visibles. Continuer à appliquer une pression jusqu&#39;à ce que tout le blastomère d&#39;intérêt a été éliminée. Utilisez une pince à rouler l&#39;embryon de gauche à droite et de confirmer visuellement que toutes les blastomère d&#39;intérêt est allé. </li><li> Utilisation d&#39;un non modifiée 15 cm pipette Pasteur, transférer l&#39;embryon pour nettoyer FASW + (FASW + 1 mg / ml d&#39;amphotéricine B, 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine). </li><li> Soulever des embryons de blastomères-ablation dans des puits individuelsd&#39;une assiette propre de 48 puits dans FASW +, changer 50% de FASW aux antibiotiques complété + quotidien. Dans nos mains embryons survivent et se développent bien, même après l&#39;ablation, à une gamme de températures de 18 à 28 º C. Les chercheurs devraient élever leurs embryons à une température pour laquelle ils ont une surface propre (mais pas nécessairement stérile) sur lequel élever les embryons avec une perturbation minimale. Pour être en mesure de comparer le calendrier des événements de développement dans des embryons de blastomères-ablation avec des contrôles, nous renvoyons le lecteur à l&#39;information de la mise en scène de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C 4, 25 º C 4, et 26 º C 5,6. </li></ol>

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<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Nous décrivons un protocole pour l&#39;ablation d&#39;emploi et l&#39;élimination physique complète de blastomères simples à partir des stades de clivage début de l&#39;amphipode P. hawaiensis. Nous démontrons l&#39;utilisation de ce protocole en supprimant la seule ligne de cellules germinales précurseur g à partir d&#39;un embryon au stade de huit cellules, et montrons que l&#39;ablation a été un succès en confirmant l&#39;absence de cellules filles de g dans l&#39;embryogenè...

Le Parhyale hawaiensis amphipode crustacé a émergé au cours de la dernière décennie comme un organisme modèle prometteur avec un grand potentiel pour une utilisation dans la recherche en biologie évolutive du développement 1. Parmi les arthropodes, la plupart des systèmes modèles sont des insectes, et la plus étudiée de ces derniers est la mouche Drosophila melanogaster. D. melanogaster est un membre de l&#39;ordre des insectes diptères, et que ces affiche de nombreuses caractéristiques embryologiques qui sont dérivées par rapport à ceux des insectes ramification basale 2. En outre, les insectes sont imbriqués dans le sous-embranchement Pancrustacea 3, ce qui signifie que les insectes ont leurs plus proches parents dans le groupe de longue date &quot;naturel&quot; appelé pancrustaceans, et que ce groupe est paraphylétique. Cela suggère que, en plus de ramification basale modèles d&#39;insectes, les études d&#39;autres crustacés sont nécessaires pour avoir une vue plus large de l&#39;histoire de l&#39;évolution des traits développement d&#39;unmécanismes moléculaires nd qui ont été si bien étudiés dans D. melanogaster. Cependant, très peu de crustacés ont été bien établies pour l&#39;analyse de laboratoire expérimental de développement. L&#39;amphipode P. hawaiensis est un système de modèle de laboratoire très docile, prête à une gamme de techniques expérimentales. Amphipodes affichent de nombreuses fonctionnalités uniques dans leur superorder mère Peracarida (trémies de plage, gammares, et crevettes ainsi), et sont donc censés être relativement dérivé dans ce groupe de crustacés. Néanmoins, la relative facilité de manipulation génétique embryonnaire et fonctionnel offert par Parhyale faire cet amphipode un ajout précieux à l&#39;inventaire actuel des organismes modèles. Comme un animal de laboratoire, P. hawaiensis offre de nombreux avantages. Les animaux sont tolérantes à un large éventail de températures et de salinité, et survivent bien dans les grandes cultures de l&#39;eau de mer artificielle 1. Il est facile de distinguer entrhommes et les femmes een basées sur les différences morphologiques évidentes, plus particulièrement, les grands crochets, les appendices du tronc antérieures que les hommes utilisent pour saisir les femelles pendant l&#39;accouplement. Pour les travaux embryologique et développement, P. hawaiensis a plusieurs caractéristiques très attrayantes. Embryogenèse dure environ dix jours et le temps de la maturité sexuelle est d&#39;environ six semaines à 28 ° C (mais notez que Parhyale survit bien à des températures allant d&#39;environ 20-30 ° C, et que la stadification de développement détaillé est disponible pour les embryons soulevées à 18 º C 4 , 25 ° C 4, et 26 ° C 5,6). Les adultes s&#39;accouplent toute l&#39;année dans le laboratoire, si des embryons sont disponibles à tout moment de l&#39;année. Les femelles pondent 2-20 (en fonction de l&#39;âge des femmes) œufs fécondés dans une poche incubatrice ventrale située entre les premières paires de pattes (figures 1A et 1B), et il est possible de rassembler ces embryonss très tôt dans le développement sans tuer la femelle ou d&#39;endommager les embryons (figure 1C). Les embryons survivent dans l&#39;eau filtrée de mer artificielle jusqu&#39;à l&#39;éclosion, peuvent être fixés pour l&#39;expression du gène ultérieur ou l&#39;analyse histologique 7, et une table de transfert détaillée permet une identification précise des progrès grâce au développement 5. Protocoles robustes ont été utilisés pour effectuer l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes par hybridation in situ 8-15 ou immunomarquage 4,16,17 dans, knockdown fonctionnelle par interférence ARN 13,15 ou morpholinos 12, et la lignée germinale stable transgénèse 18. Utilisation du système de transgenèse, une expression inductible 14 et l&#39;amplificateur piège 19 méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la fonction de gènes dans P. hawaiensis. Bien que la séquence du génome accessible au public n&#39;est actuellement pas disponible, un transcriptome contenant des transcriptions produites au cours de l&#39;ovogenèse et de l&#39;embryogenèse a abeillen de novo assemblées et annotées 20, et déposés dans une base de données consultable 21, ce qui facilite la découverte de gènes. En somme, P. hawaiensis est un organisme modèle très maniable adapté à de multiples approches expérimentales et génétiques à la compréhension du développement. Contrairement aux clivages syncytial début de D. melanogaster, P. embryons de hawaiensis clivent holoblastically après la fécondation (figure 2A). analyse traçage de Lineage a montré que par la troisième clivage, chacune des tiers blastomères de clivage est particulièrement malheureuse pour donner naissance à l&#39;un des trois feuillets embryonnaires ou la lignée germinale 6 (figure 2B). Ces données, ainsi que les données de puces à ADN 22, analyses lignée cellulaire 6,23, et les expériences d&#39;isolement de blastomère 4 ont suggéré que les potentiels de développement sont séparés à au moins certains tiers clivage blastomères par héritage asymétrique de cell déterminants du devenir. En conséquence, dans des expériences blastomère d&#39;ablation, dans lequel le précurseur de la lignée germinale (appelée &quot;g&quot; dans le Parhyale lignée cellulaire nomenclature 6) a été éliminé à l&#39;étape de cellule huit, les embryons n&#39;avaient pas les cellules germinales à des stades de développement ultérieurs 4, comme indiqué par l&#39;absence de cellules exprimer la protéine Vasa, qui est un marqueur de la lignée germinale dans la plupart des métazoaires 24. En revanche, les expériences somatiques d&#39;ablation blastomères ont montré que P. embryons de hawaiensis possèdent également des capacités réglementaires importantes, telles que les sorts de mésoderme ou ectoderme blastomères précurseurs ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants 25. Comment réglementaire remplacement du destin cellulaire peut se produire, et la mesure de l&#39;adoption autonome du destin cellulaire par blastomères somatiques, reste inconnu. Techniques embryologiques expérimentales telles que blastomère ablation peuvent être utiles dans compréding l&#39;autonomie relative et nonautonomy des décisions du destin cellulaire 26,27 et sont donc d&#39;un intérêt dans l&#39;étude de P. hawaiensis embryogenèse. Dans les expériences qui ont démontré le remplacement de régulation de l&#39;ectoderme et mésoderme lignées, ablation blastomère a été réalisée par injection 28 et excitation ultérieure de colorants phototoxiques 25. Bien que cette technique est efficace pour tuer le blastomère (s) injecté, il ne supprime pas complètement le corps de cellules mortes de l&#39;embryon. En outre, des différences ont été observées entre les données de la lignée de cellules recueillies jusqu&#39;aux stades de l&#39;embryogenèse de gastrulation par injection blastomères avec des traceurs de la lignée fluorescentes 28,29, et les données recueillies par la suite blastomères perturbés par le développement des mêmes stades embryonnaires 23. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d&#39;ablation pour certaines applications. Nous avons déjà publié les résultats de la lignée cellulaire analyse des embryons dont les cellules simples ont été soumises à une ablation manuellement 23. Toutefois, les opérations délicates nécessaires pour éliminer blastomères simples à partir d&#39;embryons de stade de clivage début n&#39;ont pas encore été entièrement décrit. Nous présentons ici un protocole de collecte de P. embryons de hawaiensis et ablation manuelle d&#39;un seul blastomère d&#39;un embryon au stade de huit cellules. Le but de cette méthode est de parvenir à l&#39;élimination complète du corps de la cellule de l&#39;embryon, permettant l&#39;observation des comportements cellulaires et les compétences du destin cellulaire des cellules restantes au cours de l&#39;embryogenèse et le développement post-embryonnaire. Notre protocole montre l&#39;enlèvement du précurseur g de la lignée germinale (figure 2C), mais peut être appliquée à n&#39;importe quelle cellule au stade huit cellules, ou à des blastomères étapes de clivage précédents. En principe, ce protocole pourrait être appliquée pour éliminer les cellules individuelles à partir d&#39;embryons à un stade préliminaire de clivage d&#39;Other clivage holoblastically invertébrés marins.

<table><tbody><tr><td>Pipette Pasteur 15 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Pour le transfert d’embryons intacts et ablatés au blastomère d’une boîte à l’autre.</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur 22 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Pour la fabrication d’embouts de pipette buccale.</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 3 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Utilisez-en une partie non altérée pour collecter et stocker les embryons ; enduisez-en une couche de Sylgard (voir ci-dessous) pour créer une surface de travail pour les ablations de blastomères.</td></tr><tr><td>Plaques 48 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Pour la culture d’embryons après ablation.</td></tr><tr><td>Filtres pour bouteilles 0.2 & micro ; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>Pour la création de FASW (Voir ci-dessous).</td></tr><tr><td>Bec Bunsen</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Pour la création d’un outil en fil de tungstène et d’une pipette à pointe fine.</td></tr><tr><td>Scribe diamant</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>Pour la création de pipettes Pasteur à large ouverture pour collecter des couples.</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11050-10 Outils pour les sciences fines</td><td>Pour maintenir les femelles anesthésiées lors du retrait des embryons de la poche à couvain. Il n’est pas nécessaire qu’il s’agisse de pinces Dumont à pointe fine - les pointes peuvent être au moins aussi émoussées que celles des pinces dont le numéro de catalogue est indiqué ici.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amphotéricine B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>Ajouter à FASW jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml, et utiliser cette solution pour cultiver des embryons ablatés au blastomere.</td></tr><tr><td>Capillaires en verre de 4 po de long, 1/0,58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles pour percer le blastomère à ablater.</td></tr><tr><td>Verre de montre en verre de 300 mm de diamètre</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70543-30 Microscopie électronique Sciences</td><td>À utiliser pour prélever des embryons de la poche de couvain de femelles anesthésiées.</td></tr><tr><td>Eau de mer artificielle Instant Ocean (ASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>Make ASW en dissolvant le sel dans de l’eau désionisée à une salinité de 1,022-1,024.</td></tr><tr><td>Eau de mer artificielle filtrée Instant Ocean (FASW)</td><td>Écosystèmes</td><td>aquatiques Instant Ocean IS160</td><td>Utilisation 0.2 &micro ; m filtres pour stériliser ASW. Préparer en petites quantités (< 250 ml) au besoin.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Pour casser en toute sécurité l’extrémité fine des pipettes Pasteur modifiées pour recueillir des couples.</td></tr><tr><td>Adaptateur de pipette buccale</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Insérez la pointe de pipette Pasteur finement tirée à cette extrémité, à utiliser pour éliminer le contenu des cellules extrudées pendant la procédure d’ablation.</td></tr><tr><td>Tube de pipette buccale</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich</td><td>Coupez-le pour qu’il soit suffisamment long pour être confortablement suspendu autour de votre cou pendant la procédure d’ablation.</td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>Pour la fabrication d’aiguilles à partir de capillaires en verre pour perforer le blastomère à ablater.</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Solution Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>Ajouter à FASW à une concentration finale de 100 unités/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine, et utiliser cette solution pour cultiver des embryons ablatés au blastomere.</td></tr><tr><td>Poire en caoutchouc</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>100488-418 VWR</td><td>Pour l’utilisation de pipettes Pasteur pour le transfert d’embryons d’une boîte à l’autre.</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific</td><td>Maquiller selon les instructions du fabricant. Versez une couche de 2 à 5 mm d’épaisseur dans une boîte de Pétri de 3 cm pour créer une surface de travail pour les ablations de blastomères.</td></tr><tr><td>Fil de tungstène 0,004 pouces de diamètre</td><td>A-M Systems</td><td>719000 A-M Systems</td><td>Utilisez-le pour fabriquer un outil permettant de retirer des embryons de la poche à couvain des femelles anesthésiées.</td></tr></tbody></table>

ablation d&#39;une cellule unique de huit cellules d&#39;embryons de crustacés amphipodes les<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un petit crustacé trouvé dans les habitats marins intertidaux à travers le monde. Au cours de la dernière décennie, Parhyale a émergé comme un organisme modèle prometteur pour les études de laboratoire de développement, fournissant une comparaison de outgroup utile pour le modèle d&#39;arthropodes bien étudié organisme Drosophila melanogaster. Contrairement aux clivages syncytial de drosophile, les premiers clivages sont des Parhyale holoblastique. cartographie destin utilisant des colorants traceurs injectés dans blastomères précoces ont montré que les trois feuillets embryonnaires et la lignée germinale sont établis par le stade de huit cellules. A ce stade, trois blastomères sont condamnées à donner naissance à l&#39;ectoderme, trois sont condamnés à donner lieu à l&#39;mésoderme, et les deux blastomères restants sont les précurseurs de la ligne de l&#39;endoderme et le germe respectivement. Cependant, les expériences d&#39;ablation blastomères ont montré que les embryons Parhyale possèdent également capabiliti réglementaire importantees, de sorte que les sorts de blastomères ablation au stade de huit cellules peuvent être prises en charge par les descendants de certains des blastomères restants. Blastomere ablation a été précédemment décrit par l&#39;une des deux méthodes: l&#39;injection et l&#39;activation subséquente de colorants phototoxiques ou ablation manuel. Cependant, photoablation tue blastomères mais ne supprime pas le corps de cellules mortes de l&#39;embryon. Élimination physique complète des blastomères spécifiques peut donc être un procédé préféré d&#39;ablation pour certaines applications. Nous présentons ici un protocole pour l&#39;enlèvement manuel de blastomères simples de la scène à huit cellules d&#39;embryons Parhyale, illustrant les instruments et les procédures manuelles nécessaires à la suppression complète du corps de la cellule tout en gardant les blastomères restants vivant et intact. Ce protocole peut être appliqué à n&#39;importe quelle cellule Parhyale au stade huit cellules, ou à d&#39;autres stades de blastomères de clivage précoce. De plus, en principe, ce protocole pourrait être applicable à CLEA tôtembryons au stade Våge d&#39;autres invertébrés marins clivage holoblastically.

Après ablation réussie de seul troisième clivage P. micromères de hawaiensis comme décrit dans ce protocole, les micromères restants passent progressivement leurs positions légèrement de manière à occuper partiellement l&#39;espace précédemment occupé par le blastomère ablation. Par exemple, lorsque g est retiré, le voisin blastomères MR et ML décaler légèrement et venez partager les bordures de cellules latérales qui étaient auparavant en contact direct avec g...

Le hawaiensis amphipode Parhyale est un organisme modèle prometteur pour l&#39;étude de l&#39;embryologie crustacé et le développement des arthropodes et l&#39;évolution comparatives. Ce protocole décrit une méthode de suppression manuelle de blastomères simples à partir d&#39;embryons à un stade préliminaire de clivage de Parhyale.

Ablation d&#39;une cellule unique de huit cellules d&#39;embryons de crustacés amphipodes les<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Cette démonstration montre la technique permettant de retirer la cellule précurseur de la lignée germinale des embryons précoces dans la cosse. Crustacean parli sys parli est un organisme modèle émergent offrant un potentiel étendu pour la recherche en évolution et en développement. La plupart des arthropodes modèles sont des insectes, et celui qui a été le plus intensivement étudié est la drosophile Glip Melanogaster. Les insectes appartiennent au sous-embranchement Panc cresta, et l'étude d'autres crustacés en dehors des insectes permet d'obtenir une vision plus large de l'histoire évolutive des caractères développementaux et des mécanismes moléculaires qui ont été largement étudiés chez Drosophila.Cependant, très peu de crustacés ont été bien établis pour l'analyse expérimentale en laboratoire du développement. Parelli est un système modèle de laboratoire très maniable et représente donc un ajout précieux à l'inventaire des organismes modèles. En tant qu'animal de laboratoire, parli est très facile à maintenir et à manipuler.Il peut survivre efficacement dans de grandes cultures d'eau de mer artificielle, et il est facile de distinguer les mâles des femelles selon des différences morphologiques nettes. Notamment, les grandes appendices antérieurs crochus que les mâles utilisent pour saisir les femelles pendant l'accouplement, utiles pour les travaux de développement. Parelli présente plusieurs caractéristiques très intéressantes : les couples s'accouplent toute l'année, ce qui permet de recueillir des embryons à tout moment.Les femelles déposent des embryons dans la poche incubatrice située entre les premières paires de pattes, et il est possible de récupérer les embryons très tôt dans leur développement sans tuer la femelle ni endommager les embryons. Les embryons survivent dans de l'eau de mer artificielle filtrée jusqu'à l'éclosion, et un tableau de stades détaillé permet d'identifier précisément l'avancement du développement. On observe ici une sélection de stades du développement de l'embryon jusqu'à l'éclosion, allant jusqu'au stade à huit cellules.Chacune des cellules de l'embryon paral est spécifiquement destinée à l'une des trois couches germinales ou aux cellules germinales primitives. C'est la spécification de la population des cellules germinales qui présente un intérêt particulier dans cette démonstration. La cellule nommée G pour lignée germinale est connue comme étant le précurseur unique de la lignée germinale ; des expériences de traçage de lignage parli montrent que les descendants de G deviennent toutes les cellules germinales, et qu'aucun de leurs descendants ne fait partie des autres couches germinales.En outre, des expériences ont été réalisées en supprimant la cellule G de l'embryon sans endommager les autres cellules. Dans ces expériences, les embryons auxquels la cellule G avait été retirée ne présentaient pas de cellules germinales durant le reste de l'embryogenèse, comme en témoignait l'absence de cellules exprimant la protéine vasa, un marqueur de la lignée germinale chez les organismes modèles appartenant aux métazoaires. Nous allons maintenant montrer comment recueillir des embryons parli et ablater manuellement la cellule G à partir d'un embryon à huit cellules.Cette vidéo montre la suppression de G, mais peut être appliquée à n'importe quelle cellule au stade à huit cellules. Pour cette partie de la procédure, nous aurons besoin d'une pipette Pasteur dont l'extrémité a été élargie, d'une seconde pipette Pasteur non modifiée, d'eau de mer artificielle filtrée, d'un grand récipient pour loger les couples, de petites boîtes de Pétri, d'une plaque à puits en verre, de pinces et d'un outil de dissection composé d'un fin fil courbé fixé à l'extrémité d'une pipette Pasteur. Les gants de pipetage ne sont pas utilisés dans cette démonstration, mais n'oubliez pas d'ajouter des équipements de protection conformément à la gestion des risques de votre établissement. Pour fabriquer la pipette Pasteur élargie, effectuez d'abord une incision circulaire autour de la pipette à l'aide d'un stylo à diamant, puis cassez soigneusement l'extrémité.Tenez au-dessus d'une flamme pendant plusieurs secondes pour lisser les bords. L'ouverture doit être légèrement plus étroite que la largeur maximale de la pipette. Pour fabriquer l'outil de dissection en fil, insérez un fil de tungstène dans l'extrémité d'une pipette en verre et tenez au-dessus d'une flamme pour faire fondre le verre.Fixez le fil en place et utilisez une pince pour courber délicatement l'extrémité du fil afin de faciliter sa manipulation avec l'outil. L'extrémité recourbée doit mesurer légèrement plus de la moitié d'un centimètre. Ramassez les couples à l'aide de la pipette Pasteur élargie et transférez-les dans un récipient séparé contenant de l'eau de mer artificielle.Laisser les couples à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, saturer l'eau de mer artificielle filtrée avec du dioxyde de carbone. Rassembler les femelles séparées et les anesthésier dans cette eau.Transférez une femelle unique dans une plaque de verre contenant de l'eau de mer artificielle filtrée avec du dioxyde de carbone en observant au microscope stéréoscopique, puis saisissez les plaques coxales le long d'un côté du corps avec une pince. Les embryons sont visibles dans la poche d'incubation. Insérez l'outil de dissection en fil métallique à l'extrémité postérieure de la poche d'incubation et soulevez doucement le fil vers l'avant afin de séparer la couverture de la poche, ouvrant ainsi la poche et exposant les embryons.Utilisez une pipette Pasteur pour faire circuler de l'eau à travers la poche d'incubation ouverte, expulsant ainsi les embryons. Transférez la femelle dans de l'eau de mer artificielle filtrée sans dioxyde de carbone afin de lui permettre de se rétablir avant de la réintroduire dans la culture principale.Transférez les embryons dans une boîte de Pétri contenant de l'eau de mer artificielle filtrée et observez-les au microscope pour déterminer leur stade. Comme il est souvent difficile de déterminer le stade des embryons avant de les retirer de la femelle, nous devons généralement prélever des embryons sur plusieurs femelles afin d'obtenir un nombre suffisant d'embryons au stade approprié. Souvent, la méthode la plus simple pour obtenir des embryons à huit cellules consiste à collecter des embryons à des stades précoces et à attendre qu'ils atteignent le stade souhaité.En plus des embryons que nous avons déjà collectés pour la procédure d'ablation, nous aurons besoin d'une pipette de prélèvement, de pinces, d'eau de mer artificielle filtrée, d'une boîte de Pétri avec une couche de colle, d'une aiguille fabriquée à partir d'une capillaire en verre étirée, d'une pipette buccale avec une petite ouverture, de boîtes de Pétri propres et d'eau de mer artificielle filtrée contenant de l'amphotéricine et de la pénicilline-streptomycine pour l'embout de la pipette buccale. Chauffez une pipette longue à l'aide d'une flamme pour en former une pipette pasteurienne, puis cassez l'extrémité du petit bout que vous insérez à l'extrémité de la pipette buccale. Cette pointe possède la taille idéale pour la procédure.L'aiguille en verre, qui sera utilisée pour percer G lors de la procédure d'ablation, doit présenter une pointe fine, tout en étant suffisamment robuste pour ne pas se briser lorsqu'elle est poussée contre le chorion. On voit ici une forme couramment utilisée dans notre laboratoire. Pour l'ablation, nous devons d'abord identifier quelle cellule est G ; l'embryon situé à gauche montre G délimité en noir, et dans la section suivante, nous apprendrons à distinguer G des autres micro-miroirs.L'embryon à droite montre ce que vous devriez observer comme résultat d'une ablation réussie. Chez cet embryon, G a été ablaté, comme indiqué par le cercle noir, et seules trois micro-mères restent, manipulées à l'aide de pinces. Faites doucement rouler l'embryon pour observer et comparer les cellules.G peut être identifié comme le plus petit micromère reposant sur le plus petit macromère ; MAV peut être identifié comme le plus petit macromère en roulant l'embryon. De plus, G ne touche pas la cellule EN, qui est le micromère situé en face. Étant donné que les cellules el et er partagent une limite entre G et EN pour cet embryon, on peut observer que le plus petit micromère est situé à gauche et qu'il ne touche pas le micromère opposé.En roulant l'embryon, nous pouvons confirmer que ce micro-miroir est positionné sur le macro-miroir le plus petit. Situé maintenant en bas à gauche de l'embryon, nous pouvons l'identifier sans ambiguïté comme G et passer à l'ablation. En bref.Pour cette procédure, nous stabiliserons l'embryon avec une pince tout en perforant G à l'aide de l'aiguille en verre étirée. Ensuite, nous appliquerons une légère pression sur l'embryon à l'aide de la pince, ce qui provoquera l'expulsion du contenu de G hors de l'embryon par le trou que nous avons créé. Nous utilisons la pipette à bouche pour retirer le contenu de G une fois qu'il a quitté l'embryon, afin de pouvoir observer quand G a été complètement éliminé.Maintenant, détaillons cette procédure : remplissez la plaque de protection en soie avec une fine couche d'eau de mer artificielle filtrée. Transférez un embryon à huit cellules dans la plaque à l'aide d'une pipette Pasteur et de pinces. De la main gauche, orientez l'embryon de manière à ce que G soit dirigé vers la droite, puis saisissez délicatement l'embryon afin de le stabiliser à l'aide d'une aiguille en verre étirée ; percez doucement G sans insérer trop profondément l'aiguille, afin d'éviter de pousser celle-ci dans les macro-miroirs situés sous G. Changez alors l'aiguille de la main droite pour une pipette à bouche munie d'une pointe de pipette Pasteur étirée.Tenez la pointe de la pipette près du trou dans G et appliquez une aspiration très légère. Serrez délicatement l'embryon avec la pince tandis que le contenu de G est expulsé du chorion. Aspirez-le dans la pipette buccale afin d'obtenir une vue dégagée de l'embryon.Observer attentivement l'embryon. Lorsque le G est retiré, la bordure du G rétrécit vers le trou dans la corion, rendant visible l'intersection des cellules sous-jacentes. Continuer à appliquer une pression jusqu'à ce que tout le G ait été enlevé et utiliser la pince pour faire rouler l'embryon et vérifier visuellement que tout le G a disparu.À l’aide d’une pipette Pasteur, transférez l’embryon dans de l’eau de mer artificielle filtrée contenant de l’amphotéricine et du pénicilline-streptomycine. Renouvelez la moitié de l’eau entourant l’embryon chaque jour afin de prévenir toute infection. Voici un embryon avant et après ablation.Comme vous pouvez le constater, il y a un espace vide là où se trouvait G auparavant. Lorsque l'opération est réalisée avec délicatesse et que les embryons sont bien soignés après l'intervention, un grand pourcentage survit jusqu'à l'éclosion. Dans notre laboratoire, le taux de survie moyen est légèrement supérieur à 50 %

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Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Cette vidéo présente une méthode permettant d’isoler les blastomères de C. elegans des embryons précoces. Les cellules résultantes conviennent à la culture cellulaire ou aux expériences ex vivo.

C. elegans Dissection de blastomères : procédé d’extraction de la coquille d’œuf et de dissociation de cellules embryonnaires

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Ce protocole fournit des instructions étape par étape sur la façon de générer des embryons de poisson-zèbre parabiotique de différents antécédents génétiques. Lorsqu’elle est combinée aux capacités d’imagerie inégalées de l’embryon de poisson-zèbre, cette méthode fournit un moyen unique et puissant d’étudier les fonctions autonomes cellulaires par rapport aux fonctions non autonomes cellulaires pour les gènes candidats d’intérêt.

Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Le but de ce protocole est de génotype de l'anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l'embryon.

Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Les complexités tissulaires des systèmes multicellulaires confondent l'identification de la relation causale entre les indices extracellulaires et les comportements cellulaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour étudier le lien direct entre les indices contact-dépendants et les axes de division utilisant des blastomeres d'embryon de C. elegans et des perles adhésives de polystyrène.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Les manipulations embryologiques telles que la disparition et la transplantation de cellules sont des outils importants pour étudier le développement précoce. Ce protocole décrit un dispositif de transplantation simple et efficace pour effectuer ces manipulations chez des embryons de poisson zèbre.

Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

Les explantes de blastoderme de poisson-zèbre sont générées en isolant des cellules embryonnaires des centres de signalisation endogènes au sein de l’embryon précoce, produisant des amas cellulaires relativement naïfs facilement manipulables et cultivés ex vivo. Cet article fournit des instructions pour la fabrication de telles explants et démontre leur utilité en interrogeant les rôles de la signalisation nodale pendant la gastrulation.

Génération d’explants de blastodermes naïfs à partir d’embryons de poisson zèbre

Le développement embryonnaire nécessite une coordination à grande échelle du mouvement cellulaire. L’ablation laser médiée par l’excitation à deux photons permet l’ablation en 3 dimensions contrôlée spatialement de grands groupes de cellules profondes. De plus, cette technique permet de sonder la réaction des cellules qui migrent collectivement in vivo à des perturbations dans leur environnement mécanique.

Ablations volumiques profondes et spatialement contrôlées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la Gastrula du poisson-zèbre

Apprenez l'ablation de blastomères uniques chez Parhyale hawaiensis pour l'étude du développement embryonnaire crustacé. Cette méthode permet d'explorer l'évolution et la biologie du développement.

Ablation d'une cellule unique de huit cellules d'embryons de crustacés amphipodes les

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