Name: Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de lespace spectroscopie de corrélation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Apprenez à mesurer les coefficients de diffusion des protéines membranaires marquées à l'EGFP dans des cellules vivantes en utilisant la spectroscopie de corrélation d'images k-ICS. Cette méthode permet d'étudier la dynamique membranaire en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par une Lundbeck Junior Group Leader Bourse de LNN. PWW reconnaît le soutien financier de la subvention du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et. Nous remercions également le danois moléculaire Bioimaging Centre à l&#39;Université du Danemark du Sud pour l&#39;accès à la filature microscopie disque.

Acquisition des protéines EGFP-marqué dans la membrane du plasma pour l&#39;analyse des CIEk peut être fait sur un microscope à épifluorescence, une configuration de TIRF ou sur un microscope à disque rotatif fixé à acquérir des images de la membrane d&#39;intérêt. La taille de pixel caméra ainsi que le temps entre les trames d&#39;image sont nécessaires pour l&#39;analyse. Les séquences d&#39;images de 100-1,200 images à un taux de 4-30 Hz cadre peuvent être utilisés pour l&#39;analyse. Au cours de l&#39;acquisition, il est important de maintenir la membrane à l&#39;orientation tout au long de la durée de l&#39;imagerie et de se concentrer sur une fraction de la membrane à plat dans laquelle la fluorescence est uniformément répartie. Déménagement vésicules, dépassant les régions membranaires et des organites cellulaires peut être cultivé plus tard dans le processus d&#39;analyse. Le temps d&#39;acquisition doit être choisi de sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de dérive ou du mouvement de la cellule. Pour obtenir les scripts de code CCI pour MATLAB, communiquez avec Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La première fois que le code est utilisé CIEk, MAT ouvertLAB et cliquez sur le fichier, puis définissez le chemin, puis cliquez sur ajouter des sous-dossiers et trouver le dossier sur l&#39;ordinateur dans lequel le code CIEk se trouve. Puis cliquez sur OK, enregistrer et fermer. Maintenant, continuez avec l&#39;analyse des cultures décrites dans les points suivants. 1. Importer la séquence d&#39;images d&#39;intérêts dans un programme d&#39;analyse d&#39;imagerie comme une pile TIFF Enregistrez le fichier avec le nom: stack1.tif. <ol><li> Sélectionnez une région rectangulaire d&#39;intérêt (ROI) à la partie plate de la membrane à l&#39;exclusion des organites cellulaires mobiles et dépassant les régions de la membrane. La taille de la récolte est choisi de telle sorte que suffisamment de statistiques sont générées pour bien k 2 parcelles. </li><li> Recadrage de la région et de sauver la récolte en tant que fichier TIFF dans un dossier approprié. S&#39;il ya plusieurs cultures par le même film, utiliser un incrément de nombre, par exemple «stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Placez le dossier contenant les cultures localementsur l&#39;ordinateur, pas sur un serveur, tout en faisant l&#39;analyse des CCI. </li></ol> 2. Importez les cultures dans le logiciel d&#39;analyse de One by One pour effectuer l&#39;analyse <ol><li> Ouvrir MATLAB et le type &quot;icsgui&quot; dans la fenêtre de commande et appuyez sur ENTRÉE. ICS GUI est le nom de l&#39;exécutable pour le programme d&#39;interface graphique utilisateur de spectroscopie de corrélation de l&#39;image. </li><li> Dans l&#39;interface graphique de ICS cliquez sur l&#39;onglet &quot;CIEk&quot;. Une capture d&#39;écran de la fenêtre d&#39;analyse est représenté sur la figure 1. </li><li> Trouver le dossier avec le nom du dossier &quot;code MATLAB&quot; et sélectionnez le fichier avec le nom de fichier &quot;Scripts&quot; et l&#39;ouvrir en double-cliquant dessus. Sinon, cliquez droit sur le fichier et sélectionnez &quot;ouvrir avec MATLAB&quot; ou allez dans Fichier, ouvert dans MATLAB et ouvrez le fichier son. Ce fichier est appelé Editor. </li><li> Dans le livre de l&#39;éditeur de &quot;données CCI de charge ensembles&quot;, puis copier ou nom de fichier de type et l&#39;emplacement du dossier dans la ligne de commande qui commenceavec img = par exemple &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. Dans la ligne de commande ci-dessous l&#39;emplacement du dossier définir le nombre d&#39;images à analyser - par exemple [1:500]. Utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données. S&#39;il ya dérive accent dans des cadres plus tard, ceux-ci devraient être exclus de l&#39;analyse. </li><li> Dans l&#39;éditeur cliquez sur &quot;enregistrer&quot; puis cliquez sur &quot;évaluer cellule&quot;. L&#39;ensemble de données est maintenant chargé dans dans le logiciel d&#39;analyse. </li><li> Dans la fenêtre Analyse CIEk dans l&#39;interface graphique, entrez les paramètres de l&#39;analyse: <ol><li> Décochez boîtes &quot;de cellules T&quot;. </li><li> Entrez le nombre de décalages dans le temps à analyser. Le nombre de retards de temps (τ) aura un effet sur la parcelle de diffusion et doit être choisi de telle sorte que l&#39;intrigue de diffusion est linéaire. Commencez par entrer 25, puis diminuer à l&#39;endroit où le tracé de diffusion est linéaire. τ est le nombre de décalages dans le temps de l&#39;analyse des CIEk compare et un décalage dans le temps est le temps bntre une trame et la suivante. La plus petite valeur qui donne un tracé linéaire doit être sélectionné. Le nombre maximum de décalages dans le temps est choisi de telle sorte que d&#39;un ajustement linéaire est obtenue, en choisissant une valeur plus élevée de produire des données qui ne peuvent pas être montés en ligne. </li><li> Entrez la valeur maximale k 2 (voir cercle 1 dans la figure 1), il est habituellement de 20-50. Un bon k 2 intrigue est un complot dans lequel il ya de nombreux points qui sont répartis le long d&#39;une ligne de données. Commencez par entrer 70, puis diminuer après avoir évalué les k 2 et de diffusion des parcelles et sélectionnez la valeur la plus faible de la grappe de points de données autour d&#39;une ligne droite. La valeur de 2 k est l&#39;amplitude au carré de la k-vecteur spatial dans l&#39;espace de Fourier. Initialement, l&#39;analyse doit être répétée jusqu&#39;à ce que les meilleures valeurs sont déterminées, puis utiliser les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données, mais toujours vérifier que les réglages sélectionnés donnent un bon ajustement aux données: bien k 2 parcelleset un terrain de diffusion linéaire. </li><li> Cliquez sur &quot;paramètres de magasins et de procéder&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;oui&quot; pour afficher tous les graphiques. </li><li> Cliquez sur &quot;série d&#39;images de charge&quot; (voir cercle 2 de la figure 1), puis cliquez sur &quot;espace de travail&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;imgSerCrop&quot;, puis cliquez sur &quot;Importer à partir d&#39;espace de travail&quot;. </li><li> Entrez les paramètres de collecte du système d&#39;imagerie. Dans la &quot;taille de pixel&quot; boîte entrer la taille du pixel projeté pour le système de formation d&#39;image à laquelle les piles d&#39;images sont acquises. Pour AQP3-EGFP, 0.111 ont été utilisés. Dans la zone &quot;Entrer l&#39;heure (s) entre les images&quot;, 0,1150 a été utilisé pour AQP3-EGFP. </li><li> Cliquez sur &quot;sélectionner ROI&quot;, entrer &quot;1&quot;, cliquez sur OK et &quot;utiliser l&#39;image entière&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;analyse Do CIEk&quot; et cliquez sur Oui pour faire &quot;filtrage immobile&quot;. Résultats s&#39;ouvriront automatiquement comme des images. </li><li> Réduire la fenêtre des paramètres, de minimiser les informations de cellule window, et minimiser la fenêtre de photophysique. Dans la fenêtre dynamique, vérifiez que l&#39;intrigue de la dynamique montre un ajustement linéaire des données à une ligne avec une pente négative ce qui signifie que les points de données en corrélation et la diffusion libre peuvent être assumées. Enregistrer le coefficient de diffusion pour le laps de temps spécifique et k 2 paramètres (il n&#39;est pas nécessaire de noter l&#39;écart-type de l&#39;ajustement). Les points de données dans les k 2 parcelles doivent être regroupés autour de la ligne pour le moment donné traîne. </li><li> Cochez la case &quot;Enregistrer figures ouvertes que des images&quot;, puis cliquez sur &quot;Sauvegarder figures ouvertes que les images&quot; pour enregistrer des fichiers en résultant. Enregistrer dans un nouveau dossier sous C: Users Documents AQP3diffusion. Cliquez sur &quot;données actuelles clair&quot; et continuer avec l&#39;analyse de la prochaine récolte. </li></ol></li></ol> 3. Moyen du coefficient de diffusion calculé est calculée pour obtenir une vue d&#39;ensemble des données analysées <ol><li> Entrez les coefficients de diffusion individuels de chaque ROI dans un spreadsheet (assurez-vous de noter le τ et k 2 valeurs), utilisez les noms des cultures que fixé ci-dessus. </li><li> Calculer le coefficient de diffusion moyenne et écart-type à l&#39;aide d&#39;un tableur. </li><li> Effectuez un test de Kolmogorov-Smirnov ou étudiants t-test pour évaluer les différences statistiques en utilisant un niveau de signification de 5%. Quantitave comparaisons entre les cellules (par exemple traitées vs non traitées) peuvent être faites. </li><li> Ouvrez la version de feuille de calcul des parcelles de diffusion qui a été généré par le logiciel d&#39;analyse pour chaque culture, et la moyenne des données pour chaque condition pour chaque décalage. Générer un nouveau terrain de diffusion moyenne pour présenter dans des documents ou des présentations. </li></ol>

<ol><li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-Space+image+correlation+spectroscopy%3A+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+Applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li>
<li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li>
<li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li>
<li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce document présente un aperçu détaillé étape par étape de la façon d&#39;appliquer la méthode d&#39;analyse des CIEk pour déterminer les coefficients de diffusion à partir d&#39;images de microscopie de protéines marquées avec des protéines fluorescentes. L&#39;analyse est indépendant du choix de la sonde avec une très large gamme dynamique de la densité de marquage et peut donc également être appliquée à des protéines marquées avec des points quantiques ainsi que des colorants et des protéines fluorescentes telles que...

L&#39;organisation spatio-temporelle quatre dimensions et la mobilité latérale des protéines membranaires plasmatiques sont strictement réglementées et peuvent jouer un rôle dans la fonction de la protéine, l&#39;activité et les interactions protéine-protéine. Diffusion latérale des protéines de la membrane de plasma, a traditionnellement été étudiée en calculant les coefficients de diffusion pour les particules individuelles à partir de l&#39;imagerie time-lapse de point quantique ou un colorant des protéines marquées de la membrane plasmique 2-4. Cette approche nécessite l&#39;insertion d&#39;une étiquette extracellulaire dans le plasma protéine membranaire de point quantique ou un marquage par un colorant, qui peut compromettre le pliage et la fonction des protéines et, par conséquent, ne peut être réalisé pour certaines protéines. Le volume stérique d&#39;un point quantique a été montré pour ralentir la diffusion de la protéine 5 et plus, seule une infime fraction des protéines de la population sont étiquetés avec des points quantiques, et on ne sait pas si cette fraction est représentatif pour l&#39;ensemble de un groupe de protéines de membrane de plasma. Tra de particules simplescking (SPT) des mesures de coefficients de diffusion de la série d&#39;image de protéines marquées de points quantiques consiste à cartographier les positions des pics de représentation des particules avec deux dimensions gaussien Convient suivis par de vastes algorithmes d&#39;analyse. L&#39;analyse est de calcul très intense, ce qui nécessite de courbe non linéaire étendu raccord à chaque trame d&#39;image d&#39;une séquence time-lapse à des approximations de la fonction microscope d&#39;étalement de point (typiquement deux dimensions gaussiennes spatiale) et la liaison subséquente des positions des particules dans les trajectoires des particules décrivant l&#39; mouvement des molécules simples 6,7. Une technique de corrélation d&#39;images récemment mis au point, k-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation (CCI) permet des mesures relativement simples de coefficients de diffusion de fluorescence protéines marquées de la membrane plasmique. La possibilité de calculer systématiquement les coefficients de diffusion des protéines membranaires avec des protéines fluorescentes marquées par CIEk est un outil unique qui maintientplusieurs avantages par rapport quantique traditionnelle dot analyse SPT: Aucune insertion de balises et temps extracellulaires consommateurs étiquetage extracellulaire est nécessaire (lignées de cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent être utilisés); les coefficients de diffusion sont extraites à partir du pool total de protéines fluorescentes par rapport à un sous-ensemble marqué avec des points quantiques; analyse est simple, sans la nécessité de suivre certaines protéines et l&#39;analyse peut être effectuée en utilisant un code existant sans nécessiter de programmation supplémentaire de l&#39;utilisateur. La méthode est rapide car il s&#39;agit d&#39;une technique de calcul de moyenne, qui permet un calcul rapide et le calcul des coefficients de diffusion. Ces mesures de diffusion rapide de la population en protéines complètent l&#39;information de transport moléculaire plus détaillée obtenue pour un sous-ensemble de la population par les méthodes SPT laborieux. temps CIEk corrélation microscopie de fluorescence des séquences d&#39;images qui ont d&#39;abord été transformées à l&#39;espace de Fourier, et ainsi sépare flfluctuations uorescence raison de photophysique de celles dues au transport moléculaire 1. En conséquence, les CCI peuvent déterminer la densité en nombre, de la vitesse d&#39;écoulement, et la diffusion des molécules marquées par fluorescence tout en étant biaisée par photoblanchiment complexe ou le clignotement des fluorophores. Cela rend CIEk un outil utile pour déterminer rapidement la dynamique de diffusion de protéines membranaires de cellules marquées par fluorescence, sans la nécessité d&#39;algorithmes d&#39;écriture personnalisées. En plus des protéines marquées par fluorescence, CIEk peuvent également être appliquées à des protéines de membrane quantiques point marqué 8. Cet article fournit une introduction étape par étape comment utiliser CIEk pour extraire les coefficients de diffusion des protéines de la membrane plasmique EGFP-marqués en démontrant comment placer la culture, comment utiliser le code et comment évaluer les tracés générés, dont la diffusion les coefficients sont extraits. A titre d&#39;exemple, les données obtenues par filage ensemble disque-microscopie en réflexion totale interne semi-fluorescenceMode nce (FRBR), d&#39;une protéine canal rénale de l&#39;eau aquaporine-3 (AQP3) étiqueté avec EGFP est présenté.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp ; region=DK">13752</a></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free medium</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp ; region=DK">D8418 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Appareil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à disque rotatif</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Appareil photo</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

facile mesure de coefficients de diffusion de egfp-marqués plasma protéines membranaires en utilisant k-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Diffusion latérale et la compartimentation des protéines de la membrane plasmique sont strictement réglementées dans les cellules et donc, l&#39;étude de ces processus va révéler de nouvelles perspectives à plasma fonction de la protéine de la membrane et de la réglementation. Récemment, k-image de l&#39;espace spectroscopie par corrélation (CCI) 1 a été développé pour permettre des mesures de routine de coefficients de diffusion directement à partir des images des protéines de la membrane plasmique marquées par fluorescence, qui ont évité les biais systématiques introduites par photophysique de la sonde. Bien que la base théorique pour l&#39;analyse est complexe, le procédé peut être mis en oeuvre par des non experts en utilisant un code librement disponible pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines. CIEk calcule une fonction de corrélation temporelle d&#39;une image de microscopie à fluorescence pile après transformation de Fourier de chaque image pour réciproque (k-) espace. Par la suite, une moyenne circulaire, logarithme naturel transformée linéaire et correspond à la fonction de corrélation donne le coefficient de diffusion. Cedocument fournit un guide étape par étape pour l&#39;analyse d&#39;image et la mesure des coefficients de diffusion via CIEk. D&#39;abord, une image d&#39;une séquence de protéines de membrane de plasma marqué par fluorescence de cadence élevée est acquise en utilisant un microscope à fluorescence. Puis, une région d&#39;intérêt (ROI) en évitant organites intracellulaires, les vésicules se déplaçant ou en saillie régions de la membrane est sélectionné. La pile de retour sur investissement est importé dans un code librement disponible et plusieurs paramètres définis (voir la section Méthode) sont définis pour l&#39;analyse des CCI. Le programme génère alors une «pente des pentes« complot des fonctions de corrélation de temps k-espace, et le coefficient de diffusion est calculée à partir de la pente de la courbe. Voici une procédure étape par étape CIEk pour mesurer le coefficient de diffusion d&#39;une protéine de membrane à l&#39;aide du rénale canal d&#39;eau aquaporine-3 marqués avec EGFP comme un exemple canonique.

Pour acquérir des piles d&#39;images convenant pour être analysés à l&#39;aide CIEk, des microscopes différents peuvent être utilisés. Il est possible d&#39;analyser des séquences d&#39;images à partir d&#39;un microscope à épifluorescence, ainsi que d&#39;une configuration de disque TIRF ou filage. La membrane doit être plat, sans grandes organites cellulaires mobile ou le déplacement des vésicules / objets. Cet article présente une séquence d&#39;images de laps de temps de AQP3 étiqueté avec EGFP dans des cellules MDC...

Ce document fournit un guide étape par étape pour la technique d&#39;analyse de fluctuation k-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation (CCI) pour mesurer les coefficients de diffusion des protéines marquées par fluorescence de la membrane plasmique des cellules de mammifères vivants.

Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les coefficients de diffusion des protéines membranaires dans des cellules vivantes. Cela est réalisé en faisant d'abord pousser des cellules exprimant la protéine marquée par GFP, puis en acquérant une séquence d'images en laps de temps sur un microscope à disque tournant, avec le foyer réglé sur la membrane plasmique. La deuxième étape consiste à sélectionner un recadrage dans la pile d'images où la membrane est plane et où il n'y a aucun organite en mouvement.Ensuite, la zone recadrée est analysée à l'aide d'un logiciel de spectroscopie de corrélation d'images basé sur des cas. La dernière étape consiste à calculer la moyenne des courbes de diffusion dans Excel. En définitive, la microscopie en temps réel combinée à des impulsions est utilisée pour mesurer le coefficient de diffusion d'une protéine membranaire.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biomécanique membranaire, comme la détermination des coefficients de diffusion des protéines membranaires dans différentes conditions. La première fois que le code kicks est utilisé, ouvrez MATLAB et cliquez sur Fichier. Ensuite, définissez le chemin d'accès, puis cliquez sur Ajouter avec sous-dossiers et recherchez le dossier sur l'ordinateur dans lequel se trouve le code kicks.Cliquez sur OK. Avant d'enregistrer et de fermer MATLAB pendant l'acquisition, il est important de maintenir la membrane au foyer tout au long de la durée de l'observation. Sélectionnez une région rectangulaire d'intérêt ou ROI sur la partie plane de la membrane où la fluorescence est uniformément répartie.Excluez les organites cellulaires en mouvement et les régions membranaires proéminentes. La taille du recadrage est choisie de manière à générer suffisamment de statistiques pour obtenir de bons tracés de K au carré. Recadrez la région et enregistrez le recadrage au format tiff.Enregistrez dans un dossier approprié. S'il existe plusieurs découpes provenant du même film, utilisez un incrément numérique, par exemple : découpe de la pile un, tiff, pile un, découpe deux, tif, etc. Pour effectuer l'analyse, ouvrez d'abord MatLab et saisissez ICS gooey dans la fenêtre de commande, puis appuyez sur Entrée ICS.GUI est le nom exécutable du programme d'interface graphique utilisateur d'analyse spectroscopique par corrélation d'image dans ICS Gooey. Cliquez sur l'onglet kicks. Recherchez le dossier portant le nom de dossier, code MATLAB.Accédez au fichier portant le nom scripts, puis ouvrez-le en double-cliquant dessus. Ce fichier s'appelle editor. Dans l'éditeur.Faites défiler pour charger les jeux de données de coups de pied. Ensuite, copiez ou saisissez le nom du fichier et l'emplacement du dossier dans la ligne de commande. Dans la ligne de commande située sous l'emplacement du dossier.Définissez le nombre d'images à analyser. Utilisez les mêmes paramètres pour tous les films consécutifs de la série de données. S'il y a une dérive de mise au point dans les images ultérieures.Ces éléments doivent être exclus de l'analyse dans l'éditeur. Cliquez sur enregistrer, puis sur évaluer. Le jeu de données est maintenant chargé dans le logiciel d'analyse, dans la fenêtre d'analyse des coups, dans l'interface graphique.Entrez les paramètres pour l'analyse en décochant d'abord les cases des cellules T. Ensuite, saisissez le nombre de décalages temporels à analyser. Saisissez le K carré maximal.Il est généralement compris entre 20 et 50 au départ. L'analyse doit être répétée jusqu'à ce que les meilleures valeurs soient déterminées, puis le paramètre retenu doit être utilisé pour tous les films consécutifs de la série de données. Vérifiez toujours que les paramètres sélectionnés fournissent un bon ajustement aux données, comme en témoignent des graphiques du khi-deux adéquats et un tracé de diffusion linéaire.Ensuite, cliquez sur les paramètres de stockage et poursuivez. Puis cliquez sur oui pour afficher tous les graphiques. Cliquez sur charger une série d'images, puis sur espace de travail.Sélectionnez le rognage de la série d'images avant de cliquer sur importer depuis l'espace de travail. Saisissez maintenant les paramètres de collecte du système d'imagerie dans la case taille du pixel. Indiquez la taille projetée du pixel pour le système d'imagerie avec lequel les piles d'images ont été acquises.Cliquez pour sélectionner les régions d’intérêt (ROI) et en définir une. Ensuite, cliquez sur « OK » et utilisez l’image complète. Cliquez sur « Analyser les kicks » et cliquez sur « Oui » pour appliquer le filtrage des particules immobiles.Les résultats s'ouvriront automatiquement sous forme d'images. Réduisez la fenêtre des paramètres, la fen�t�re d'information sur la cellule et la fenêtre de photophysique dans la fenêtre de dynamique. Vérifiez que le tracé de dynamique présente un ajustement linéaire des données selon une pente négative, ce qui signifie que les points de données sont corrélés et qu'une diffusion libre peut être supposée.Enregistrez le coefficient de diffusion pour le délai temporel spécifique et les paramètres de K au carré. Les points de données sur les graphiques de K au carré doivent être regroupés autour de la droite correspondant au temps donné. Cochez la case pour les délais, enregistrez les figures ouvertes en tant qu'images, puis cliquez sur enregistrer les figures ouvertes en tant qu'images pour sauvegarder les fichiers de résultats.Enregistrer dans un nouveau dossier, puis cliquer sur effacer les données actuelles et poursuivre avec l'analyse de la prochaine culture. En utilisant les noms des cultures définis précédemment, saisir les coefficients de diffusion individuels de chaque ROI dans un tableur et s'assurer d'indiquer le nombre de retards temporels et les valeurs K au carré. Calculer le coefficient de diffusion moyen et l'écart type à l'aide d'un programme de tableur.Effectuez un test MOV Smirnoff ou un test t de Student pour évaluer les différences statistiques. En utilisant un seuil de significativité de 5 %, des comparaisons quantitatives entre cellules peuvent être réalisées librement. La version tableur des graphiques de diffusion, générée par le logiciel d'analyse pour chaque culture, permet de faire la moyenne des données pour chaque condition et pour chaque décalage temporel.Générer un nouveau tracé de diffusion moyen pour présenter dans des articles ou des présentations. Les résultats présentés ici constituent une séquence d'images en lapse de temps de l'aquaporine trois marquée avec EGFP. Dans des cellules MDCK vivantes, qui sont des cellules épithéliales rénales, observées au microscope à disque rotatif avec le foyer réglé sur la membrane plasmique.Voici une image de la cellule avec des zones d'intérêt (ROI) d'exemple mises en évidence par des rectangles pour la sélection des zones. Il est important de recadrer en périphérie de la cellule, là où la membrane est uniforme et plane, afin que seule une diffusion bidimensionnelle soit visualisée. Il faut éviter les organites cellulaires, les vésicules et les prolongements membranaires, et il est essentiel pour l'analyse qu'il n'y ait aucun dérive pendant l'acquisition en laps de temps.Cette zone représentative a été exclue de l'analyse et des kicks, car il existe des vésicules en mouvement, pouvant contribuer au coefficient de diffusion. Un autre exemple de zone exclue, dans laquelle il y a un trou dans la membrane, est montré ici. Le tracé de diffusion d'une zone générée avec des kicks est présenté ici.Cette méthode peut être utilisée pour déterminer le coefficient de diffusion d'une protéine marquée avec une protéine fluorescente, un colorant ou des points quantiques. La pente de la courbe dans le tracé de diffusion est simplement l'opposée du coefficient de diffusion ; ici, le tracé de diffusion calculé pour l'aquaporine trois marquée avec EGFP est illustré avec un trop grand nombre d'intervalles de temps. Dans ce cas, l'analyse a été refaite, mais avec moins d'intervalles de temps afin que le tracé de diffusion soit linéaire.Un graphique carré de cas typique est présenté ici. Il s'agit de la courbe de corrélation moyennée radialement et transformée logarithmiquement pour un décalage temporel sélectionné à partir de ces graphiques K carrés. La pente est tracée en fonction des décalages temporels, et le résultat est le graphique de diffusion précédemment montré.Lors de l'inspection des graphiques de K carré, il est important que l'ajustement soit évalué à partir de ce graphique de K carré. On peut conclure que le domaine est trop petit et ne pouvait pas être analysé, car il aurait dû présenter une pente négative et une décroissance linéaire vers un bruit de fond. Ce graphique de K carré doit être réanalysé avec une valeur maximale de K carré réduite, puisque l'ajustement n'est plus satisfaisant, comme le montre l'augmentation des résidus pour les valeurs plus élevées de K carré.Dans ce cas, l'analyse doit être relancée en entrant une valeur maximale de K carré plus faible. Un graphique de diffusion moyen, obtenu à partir de 10 zones sélectionnées, est affiché ici. Ce graphique de diffusion a été extrait du fichier Excel provenant de l'analyse et de celui-ci.Le coefficient de diffusion de AQUAPORIN trois EGFP est calculé selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que la mesure du coefficient de diffusion de protéines membranaires après l'ajout de différents médicaments, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme les modifications du coefficient de diffusion après un traitement médicamenteux, ou s'il est probable qu'il existe des changements dans l'environnement lipidique et/ou dans les interactions protéine-protéine au niveau de la membrane.

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