Name: Évaluer les changements dans volatils anesthésie générale sensibilité des souris après lintervention pharmacologique local ou systémique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Apprenez à évaluer la sensibilité aux anesthésiques volatils chez la souris après intervention pharmacologique locale ou systémique. Cette méthode utilise le réflexe de redressement pour mesurer l'inconscience et l'efficacité des agents.

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Ce travail a été soutenu par R01 et T32 GM088156 HL007713-18. Nous tenons à remercier Bill Pennie et Michael Carman de l&#39;Université de Pennsylvanie recherche Instrumentation Boutique pour leur aide dans le montage de notre appareil de réflexe de redressement.

Toutes les procédures impliquant des animaux décrits ci-dessus ont été approuvés par l&#39;Université du comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de la Pennsylvanie. Une. Vue d&#39;ensemble de l&#39;appareil d&#39;essai <ol><li> L&#39;appareil d&#39;essai se compose de 24 chambres claires acrylique cylindriques de 10 cm de longueur et de 5 cm de diamètre (volume total de 200 ml). Cette taille est appropriée pour une souris adulte typique de 25 g. Chambers ont des ports à chaque extrémité pour l&#39;entrée et sortie de gaz. L&#39;extrémité de sortie est amovible de sorte que les animaux peuvent être facilement chargés dans la chambre. les sabords de gaz sont soigneusement scellées avec du ruban téflon, tandis que les joints toriques en caoutchouc sont utilisés pour sceller l&#39;extrémité amovible des chambres cylindriques. </li><li> Chaque chambre est montée sur un support qui se trouve à l&#39;intérieur d&#39;un bain d&#39;eau. Le support est monté de telle sorte que seule la partie inférieure des chambres (au-dessous des entrées de gaz) est immergée. Pour la stabilité, l&#39;extrémité arrière de la chambre repose sur un support de telle sorte que l&#39;ensemble de chamber se trouve horizontalement. Cette garantit un contact de l&#39;ensemble de chambre à la salle de bain. </li><li> un tube de polyéthylène relie un réservoir d&#39;oxygène à un vaporisateur d&#39;anesthésique, puis passe à travers un L / débitmètre 10 min. Le tube se divise en 25 résistances de faible diamètre d&#39;une longueur égale à assurer un écoulement égal est délivré à chacun des 24 chambres et à un analyseur d&#39;agent. </li><li> Les conduites de vide sortent chaque chambre à l&#39;extrémité opposée de l&#39;entrée de gaz. Cela favorise un écoulement unidirectionnel qui élimine réinhalation de dioxyde de carbone expiré. Les lignes de vide se combinent à un collecteur de se connecter à une ligne d&#39;aspiration en interne. Une valve pop-off le long de la ligne de vide principale assure des conditions de pression atmosphérique dans chaque chambre. </li><li> Le bain est rempli avec suffisamment d&#39;eau pour communiquer pleinement le fond de chaque chambre. L&#39;eau est mise en circulation à travers le bain et maintenu à une température constante de 37 ° C par une pompe. </li></ol> 2. Vérifiez le système avant l&#39;exposition <ol><li> Cdiable ce que la température du bain d&#39;eau est de 37 ° C tout au long de la baignoire. </li><li> Couler de l&#39;oxygène à un débit de 5 L / min (200 ml / min par l&#39;agent analyseur chambre +). Immerger chaque chambre sous l&#39;eau et de chercher les bulles ou entrée d&#39;eau dans la chambre, les deux qui sont indicatifs de fuites. Scellez toutes les fuites avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Pour chaque chambre, connecter un ml / min de 500 mètres d&#39;écoulement en ligne après la chambre pour s&#39;assurer que les flux sont équilibrés entre chacune des lignes de gaz 25. Cela assure que les flux d&#39;entrée de 5 L / min seront distribués uniformément de sorte que chaque chambre reçoit l&#39;écoulement 200 ml / min. Toute chambre pas recevoir le flux prévu devrait avoir son entrée et la sortie des tubes vérifier les obstructions. </li><li> Calibrer l&#39;analyseur d&#39;agent pour assurer une lecture de 0,00% d&#39;isoflurane quand 100% d&#39;oxygène circule. </li></ol> 3. Implant Température transpondeur <ol><li> Une semaine avant l&#39;accoutumance, anesthésier chaque souris avec 2% d&#39;isoflurane. </li><li> Stériliser la zone dorsale du cou avec de la bétadine. </li><li> Injecter un transpondeur sous-cutanée de température entre les omoplates à l&#39;aide de l&#39;aiguille d&#39;injecteur préemballé stérile. </li><li> Surveiller le site d&#39;injection par jour pendant l&#39;infection et la migration du transpondeur. </li></ol> 4. Habituer les animaux de test Chambers <ol><li> Quatre jours avant la première évaluation, placer toutes les souris dans des chambres individuelles pour 2 heures avec un courant de 100% d&#39;oxygène. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.1 par jour pendant quatre jours avant l&#39;évaluation pour éviter les effets de confusion de stress dû à un nouvel environnement. </li></ol> 5. Effectuer l&#39;intervention pharmacologique que vous souhaitez tester pour les effets sur la sensibilité anesthésique <ol><li> Cette intervention peut être une injection stéréotaxique dans une partie spécifique du cerveau 24, une injection intraveineuse ou intrapéritonéale 25, ou à la livraison d&#39;un médicament à une zone spécifique du cerveau par une canule 26. </li><li> Du fait que ces procédures peuvent eux-mêmes modifier la sensibilité anesthésique par rapport à un animal naïf, un groupe témoin approprié devrait subir le même mode opératoire avec des injections de véhicule. </li><li> Veiller à ce que l&#39;intervention pharmacologique a une suffisamment longue durée d&#39;action si vous envisagez de faire un pas à pas l&#39;augmentation et / ou diminution de la détermination de la sensibilité anesthésique, comme indiqué à l&#39;étape 6 ci-dessous, sinon, passez à l&#39;étape 7. </li></ol> 6. Évaluer anesthésique sensibilité en utilisant le pas à pas CE 50 Détermination de l&#39;induction et de l&#39;émergence <ol><li> Placez chaque animal dans des chambres individuelles avec un courant de 100% d&#39;oxygène. </li><li> Régler la concentration d&#39;isoflurane à 0,4% * pendant 15 min. Pendant les 2 dernières minutes de cette période, évaluer réflexe de redressement de chaque animal en roulant doucement la chambre jusqu&#39;à ce que la souris est placé sur le dos. Le réflexe de redressement est considérée comme intacte si et seulement si la souris est capable de restaurer tousde ses pattes sur le plancher de la chambre à moins de 2 min. <ol><li> * Notez que 0,4% d&#39;isoflurane est une dose subhypnotic chez les souris C57BL/6J. Si des souris perdent leur réflexe de redressement lors de la première étape, la dose initiale était trop grande et doit être réduite les jours suivants. </li></ol></li><li> Enregistrer l&#39;état du réflexe de redressement pour chaque souris et analyser chaque souris pour les données de température. Un enregistrement de modèle est représenté dans le tableau 1. </li><li> Augmenter la concentration d&#39;isoflurane par ~ 0,05% pendant 15 minutes et répéter l&#39;étape 7.2. Continuer ainsi jusqu&#39;à ce que tous les animaux ont perdu leur réflexe de redressement. </li><li> Facultatif: répétez la même procédure pour diminuer les doses isoflurane étape par étape jusqu&#39;à ce que tous les animaux ont retrouvé leur réflexe de redressement (voir l&#39;étape 6.3). </li><li> Pour mettre fin à l&#39;expérience, éteignez l&#39;isoflurane et rincer tout le système avec 100% d&#39;oxygène pendant 15 min. Cela aidera à prévenir l&#39;hypoxie que les souris récupérer avant d&#39;être retournées à leurs cages et protéger la experimenter de toute exposition anesthésique. </li><li> Facultatif: si le nombre d&#39;animaux ou le nombre de concentrations anesthésiques est limité en raison du manque de ressources ou de temps, les estimations, en particulier des paramètres de la courbe d&#39;ajustement de la pente peuvent avoir sous-estimé la colline faussement estimation basse, d&#39;erreur. Dans de tels cas, il peut être nécessaire de répéter la mesure de la sensibilité anesthésie décrit dans les étapes 6.1 à 6.6 sur un maximum de deux jours expérimentales supplémentaires pour obtenir pleinement le paramètre de la véritable pente de Hill et son estimation d&#39;erreur correspondant. </li></ol> 7. Évaluer les changements à court terme dans anesthésique sensibilité avec le temps à l&#39;émergence <ol><li> Placez chaque animal dans des chambres individuelles avec un courant de 100% d&#39;oxygène. </li><li> Régler la concentration d&#39;isoflurane à 1,2%, ce qui correspond à l&#39;induction ED 99 pour la souris C57BL/6J de type sauvage 20. Maintenir pendant 30-60 minutes en fonction de la durée prévue de l&#39;action de l&#39;intervention aiguë. </li><li> Confirmez LORR danstous les animaux en roulant doucement chaque chambre jusqu&#39;à ce que les souris sont placées sur le dos. </li><li> Désactiver l&#39;isoflurane et le débit 100% d&#39;oxygène. Mesurer le temps jusqu&#39;à ce que chaque animal retrouve son réflexe de redressement. Ceci est défini par la mise en place de l&#39;ensemble des quatre pattes sur le plancher de la chambre et confirmé par la présence de trois essais consécutifs avec un réflexe de redressement intact. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Bien que l&#39;évaluation de LORR en un seul clic est une tâche apparemment simple, il est néanmoins essentiel de maintenir des conditions physiologiques identiques entre les sujets afin de recueillir des données fiables à partir d&#39;un groupe d&#39;animaux. L&#39;, appareil de LORR haute capacité strictement réglementé présenté ici propose une façon de normaliser les expériences et de maximiser l&#39;efficacité. En suivant les principes de base de la thermorégulation et la distribution de débit égal, ce système peut ...

Anesthésiques généraux sont définis par leur capacité à provoquer un état réversible de l&#39;hypnose dans une grande variété d&#39;espèces, encore une explication quant à la façon dont une telle classe diversifiée de médicaments peut tout obtenir un point de terminaison singulier reste insaisissable. Un certain nombre de théories ont été avancées au fil des ans, à partir de la corrélation entre Meyer-Overton pouvoir anesthésiant et solubilité dans les lipides, ce qui suggère des perturbations généraux de la membrane de base à l&#39;hypnose 1,2. Des données plus récentes suggèrent que les cibles de protéines affectant la signalisation neuronale contribuent à des effets anesthésiants. Les souris se sont avérées être un modèle indispensable à l&#39;exploration de ces théories en raison de l&#39;homologie entre la souris et la réactivité de l&#39;anesthésique humain. Bien que la souris ne peut pas être interrogé sur sa conscience subjective sous anesthésie générale, certains réflexes primitifs servent mesures de substitution utiles de rongeur hypnose. Dans les premiers jours suivant la naissance, les souris développent un redressement resp réflexiveonse qui les empêche d&#39;être passivement placé en décubitus dorsal 3. La dose d&#39;anesthésie au cours de laquelle une souris perd son réflexe de redressement est bien corrélée avec des doses hypnotiques humaines 4. Évaluation de la perte de réflexe de redressement (LORR) est devenu un standard de laboratoire largement utilisé pour tester la sensibilité anesthésie chez les souris ainsi qu&#39;une variété d&#39;autres espèces, y compris chez le rat, cochon Guinée, lapin, furet, moutons, chien et 5-8. La dose d&#39;un anesthésique administré à laquelle LORR aura lieu pour les membres d&#39;une espèce est extrêmement cohérent, mais il peut être déplacé de manière significative par des facteurs environnementaux. Par exemple, les rats privés de sommeil sont plus sensibles à la fois aux anesthésiques volatiles et intraveineuse 9 et le rat avec la capacité aérobie élevée sont moins sensibles à l&#39;isoflurane 10. L&#39;hypothermie a également été montré une diminution de la dose de nombreux anesthésiques nécessaires à l&#39;hypnose dans un large spectre d&#39;espèces de 11 à 14. Pourà identifier de manière fiable la dose anesthésique à qui LORR se produit dans un groupe d&#39;animaux de laboratoire, il est essentiel que l&#39;environnement d&#39;évaluation être soigneusement contrôlée pour minimiser le stress, maintenir euthermia, et de livrer des quantités égales de drogue à tous les sujets. Sans surprise, les facteurs génétiques sont également connus pour modifier la sensibilité anesthésie 15-18. Par conséquent, une attention particulière devrait également être accordée au contrôle pour le fond génétique 19. Nous avons mis au point un appareil qui assure la livraison de gaz anesthésique identique à chacun des 24 souris tout en maintenant un environnement constant de C 37 o. Le design cylindrique transparente de nos chambres d&#39;exposition permet une évaluation de LORR rapide et une intégration facile des mesures physiologiques télémétriques. Ce système a été montré pour mesurer avec précision l&#39;isoflurane, halothane et le sévoflurane induction CE 50 et le temps de l&#39;émergence de souris de type sauvage 20. Nous avons également utiliséce système pour observer les changements dans la sensibilité anesthésie chez la souris avec des mutations génétiques et des lésions hypothalamiques ciblées 21-23. Nous décrivons ici deux façons de sensibilité anesthésie peut être évaluée après une intervention pharmacologique utilisant notre appareil dans un environnement contrôlé. L&#39;état d&#39;équilibre de phénotypage volatile induction anesthésique et de la sensibilité de l&#39;émergence nécessite 8-10 heures et est donc mieux adaptée pour des études dans des conditions expérimentales qui ne changent pas, comme dans les interventions pharmacologiques chroniques ou de longue durée d&#39;action. Toutefois, pour les traitements à action rapide dont les effets se dissiper au fil du temps, nous présentons également une procédure simple pour évaluer les changements de réflexe de redressement suivantes microinjections stéréotaxique ciblées ou des traitements de drogues injectables qui ont une incidence significative émergence anesthésie. Ces tests représentent un petit sous-ensemble des applications potentielles de ce système dans un environnement contrôlé, qui pourrait être adapté pour n&#39;importe quel nombre de subjects d&#39;une variété d&#39;espèces de recevoir tout type de thérapeutique par inhalation.

<table><tbody><tr><td>Nom du réactif</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>Airgas</td><td>OX300</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td></td><td>Tout anesthésique volatil d’intérêt peut être substitué</td></tr><tr><td>Nom du matériau Numéro de catalogue de l’entreprise</td><td></td><td></td><td>Commentaires Débitmètre</td></tr><tr><td>massique - 10 SLPM</td><td>Omega Engineering</td><td>FMA-A2309</td><td></td></tr><tr><td>Débitmètre massique- 500 SCCM</td><td>Omega Engineering</td><td>FMA-A2305</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur d’agent anesthésique/indicateur de gaz</td><td>AM Bickford</td><td>FI-21 Riken</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à eau de chauffage</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-175</td><td></td></tr><tr><td>Transpondeurs de température</td><td>BMDS</td><td>IPTT-300</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de température RF</td><td>BMDS</td><td>DAS-6007</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluer les changements dans volatils anesthésie générale sensibilité des souris après l&#39;intervention pharmacologique local ou systémique

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Un critère souhaitable de l&#39;anesthésie générale est l&#39;état d&#39;inconscience, aussi connu comme l&#39;hypnose. Définir l&#39;état hypnotique chez les animaux est moins simple qu&#39;elle ne l&#39;est chez les patients humains. Un substitut du comportement largement utilisé pour l&#39;hypnose chez les rongeurs est la perte du réflexe de redressement (LORR), ou le moment où l&#39;animal ne répond plus à leur instinct inné d&#39;éviter la vulnérabilité de décubitus dorsal. Nous avons développé un système d&#39;évaluation LORR dans 24 souris simultanément tout en contrôlant soigneusement pour les facteurs de confusion potentiels, y compris les variations de température et différents flux de gaz. Ces chambres permettent une évaluation fiable de la sensibilité anesthésie mesurée par la latence pour revenir du réflexe de redressement (RORR) après une exposition anesthésie fixe. Sinon, en utilisant par étapes augmente (ou diminue) de la concentration anesthésique, les chambres permettent également la détermination de la sensibilité de la population à induction (ou l&#39;émergence), telle que mesurée parCE 50 et la pente de Hill. Enfin, les chambres environnementales contrôlées décrites ici peuvent être adaptés pour une variété d&#39;utilisations alternatives, y compris la livraison inhalé d&#39;autres médicaments, des études de toxicologie et simultanée surveillance en temps réel des signes vitaux.

La figure 1 montre l&#39;utilité du dosage LORR étape par étape pour déterminer les effets à long terme d&#39;une intervention pharmacologique. Acide iboténique (IBA) est un agoniste de la glutamatergique N-méthyl-D-aspartate (NMDA) qui est souvent utilisé comme un excitotoxine à provoquer des lésions neuronales permanentes. Ici nous avons injecté 10 nl de 1% IBA bilatérale dans la zone préoptique ventro (VLPO) de souris C57BL/6J une semaine avant le test. La majorité des neurones dans ce noyau exposer ...

Perte du réflexe de redressement a longtemps servi comme un substitut de comportement standard pour la perte de conscience, aussi appelé l&#39;hypnose, chez les animaux de laboratoire. Altérations de la sensibilité anesthésique volatil causés par des interventions pharmacologiques peuvent être détectés avec un système d&#39;évaluation à haut débit soigneusement contrôlé, qui peut être adapté pour la livraison de toute thérapeutique inhalé.

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer les modifications de la sensibilité anesthésique après une intervention pharmacologique. Cela est réalisé en vérifiant d'abord attentivement les chambres d'exposition afin de garantir un débit de gaz et une température uniformes. La deuxième étape consiste à habituer les animaux aux chambres.Ensuite, l'intervention pharmacologique d'intérêt est réalisée. La dernière étape consiste à évaluer les modifications de la sensibilité anesthésique en analysant le réflexe d'écriture de l'animal en réponse à une exposition anesthésique. En définitive, les tests du réflexe d'écriture permettent de mettre en évidence les différences de sensibilité anesthésique induites par des interventions pharmacologiques à action longue ou courte durée.Bien que ce système puisse fournir des informations sur les modifications de la sensibilité anesthésique chez la souris, il peut également être utilisé chez diverses espèces pour étudier les effets de tout agent thérapeutique inhalé. L'appareil de test est composé de 24 chambres cylindriques transparentes en acrylique, de 10 centimètres de longueur et de 5 centimètres de diamètre. Cette taille convient à une

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Les mesures électroniques de von Frey constituent une alternative efficace et améliorée aux filaments de von Frey classiques, car elles permettent de mesurer rapidement et précisément les changements des seuils de retrait mécanique des rongeurs aux stimuli de pression appliqués en continu avant et après un événement inflammatoire.

Mesure des changements de sensibilité tactile dans la patte postérieure de souris à l’aide d’un appareil électronique de von Frey

Nous décrivons un protocole pour examiner l'évolution de l'hyperalgésie et de tolérance chez les souris induite par les opioïdes. Sur la base de la mesure des réponses nociceptifs thermiques et mécaniques des animaux naïfs et traités par la morphine, il permet de quantifier l'augmentation de la sensibilité à la douleur (hyperalgie) et diminuer de l'analgésie (tolérance) associée à l'administration d'opiacés chronique.

L&#39;évaluation de la tolérance induite par la morphine hyperalgésie et analgésique chez la souris utilisant thermiques et mécaniques nociceptifs modalités

Les réponses allergiques, caractérisé par l'activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d'IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d'Evans pour suivre l'évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique.

Mesure de l&#39;anaphylaxie locaux chez la souris

Ce protocole est destiné à permettre aux chercheurs de mener des expériences conçues pour tester ces aspects de la dépendance en utilisant les tests de préférence de lieu conditionné et de sensibilisation comportementale locomotrice.

Évaluation de la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne et de préférence de place conditionnée chez la souris

Ici, nous présentons un protocole permettant d’administrer plus sûrement et plus efficacement du gaz anesthésique à des souris à l’aide d’un système d’anesthésie numérique à faible débit utilisant un vaporisateur à injection directe entraîné par seringue.

Utilisation d&#39;un système d&#39;anesthésie numérique à faible débit pour les souris et les rats

La stimulation du nerf vague s’est avérée avoir une forte efficacité pour diminuer l’inflammation périphérique. Ici, nous présentons un protocole modifié de stimulation du nerf vague qui permet des examens plus approfondis des mécanismes anti-inflammatoires cholinergiques dans des réponses inflammatoires limitées.

Augmentation du temps de récupération et une diminution de LPS administration à étudier les mécanismes de stimulation du nerf vague dans les réponses inflammatoires limitées

Nous avons développé un protocole pour évaluer le bien-être chez les souris au cours de procédures à l’aide de l’anesthésie générale. Une série de paramètres du comportement indiquant les niveaux de bien-être ainsi que les métabolites de glucocorticoïdes ont été analysés. Le protocole peut servir comme une aide générale pour estimer le degré de sévérité d’une manière scientifique, axée sur l’animal.

Évaluation systématique du bien-être chez les souris pour les procédures utilisant l’anesthésie générale

Les tranches de cerveau ex vivo peuvent être utilisées pour étudier les effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées aux entrées afférentes. L’optogénétique est utilisée pour activer indépendamment les afférences thalamocorticales et corticocorticales au néocortex non primaire, et les réponses synaptiques et réseau sont modulées avec l’isoflurane.

Activation optogénétique des voies afférentes dans les tranches de cerveau et modulation des réponses par des anesthésiques volatils

Cet article décrit une méthode de modélisation de l’anesthésie intraveineuse totale (TIVA) pendant la chirurgie de résection du cancer chez la souris. L’objectif est de reproduire les principales caractéristiques de l’administration de l’anesthésie aux patients atteints de cancer. La méthode permet d’étudier comment la technique anesthésique affecte la récidive du cancer après une chirurgie de résection.

Un modèle murin in vivo d’anesthésie intraveineuse totale pendant une chirurgie de résection du cancer

La mouche des fruits (Drosophila melanogaster) est largement utilisée pour la recherche biologique et toxicologique. Pour étendre l’utilité des mouches, nous avons développé un instrument, le réseau d’anesthésie en série, qui expose simultanément plusieurs échantillons de mouches à des anesthésiques généraux volatils (AGV), ce qui permet d’étudier les effets collatéraux (toxiques et protecteurs) des VGA.

Le réseau d’anesthésie en série pour l’étude à haut débit d’agents volatils utilisant Drosophila melanogaster

Apprenez à évaluer la sensibilité aux anesthésiques volatils chez la souris après intervention pharmacologique locale ou systémique. Cette méthode utilise le réflexe de redressement pour mesurer l'inconscience et l'efficacité des agents.

Évaluer les changements dans volatils anesthésie générale sensibilité des souris après lintervention pharmacologique local ou systémique (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluer les changements dans volatils anesthésie générale sensibilité des souris après l'intervention pharmacologique local ou systémique

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