Exemple de correction de la dérive Après 4D confocale imagerie time-lapse

La microscopie en lapse de temps permet de visualiser les processus de développement, de croissance ou de dérive de l'échantillon qui se produisent au cours de cette image. L'acquisition peut entraîner une incapacité à suivre ou à tracer les mouvements cellulaires ; le protocole suivant décrit l'utilisation d'un logiciel libre de traitement d'images pour corriger la dérive tridimensionnelle au fil du temps.

L'acquisition d'une série de sections optiques à différents plans focaux permet la génération d'un modèle tridimensionnel de l'échantillon. Cela peut être étendu à quatre dimensions en créant une série accélérée d'ensembles de données 3D. Dans les expériences de laps de temps à long terme, il est courant d'observer un déplacement de l'échantillon.

Cela peut être dû à des imprécisions de déplacement dans le matériel contrôlant la platine et les positions focales, ou dans d'autres cas, à une dérive provoquée par les mouvements induits par la croissance de l'échantillon ou par la souplesse du milieu de montage. Des méthodes existent pour compenser et limiter ces déplacements, grâce à de nombreuses améliorations apportées aux systèmes de mise au point matériels et à l'augmentation de la rigidité du milieu de montage. Toutefois, ces approches ne peuvent être appliquées dans de nombreux cas en raison de la configuration d'imagerie nécessaire pour assurer des conditions adéquates d'entretien et de croissance des échantillons. Pour la dérive des échantillons, nous avons développé un module complémentaire permettant d'utiliser la plateforme open source de traitement d'images Fiji.

Notre greffon de correction de dérive 3D est capable d'effectuer un recalage par corrélation de phase afin de corriger les mouvements induits par une dérive d'échantillon ou de système au cours d'expériences en laps de temps tridimensionnelles dans des expériences multicanal. Le greffon de correction de dérive 3D utilise un canal pour déterminer la correction nécessaire. Cette correction est ensuite appliquée à tous les canaux supplémentaires, ce qui permet le recalage du jeu de données en quatre dimensions.

Le logiciel Web gratuit open source. Fiji est un dérivé de distribution du programme ImageJ, qui contient des greffons préinstallés pour effectuer de nombreux traitements sur les données recueillies lors d'expériences de microscopie. Fiji offre une architecture de greffons plus simple et les inclut dans l'installation par défaut.

Une copie du bon plugin EG trois, que nous utiliserons pour cette analyse une fois l'installation terminée, ouvre Fiji. Fiji prend en charge l'importation d'un grand nombre de formats d'images de microscopie propriétaires. Cela peut être réalisé par glisser-déposer ou par l'intermédiaire des utilisateurs, l'environnement de microscopie ouvert.

Plugin d'importation de formats Bio. Si le jeu de données dépasse la taille de la mémoire installée sur votre système, ouvrez le fichier image sous forme de pile virtuelle et d'une option de gestion de la mémoire. Le jeu de données que nous utiliserons dans cette analyse a été généré à partir d'une expérience en série temporelle tridimensionnelle sur un poisson zèbre transgénique ACTA1-GFP, dans lequel le GFP est exprimé dans le muscle squelettique.

Pour visualiser les noyaux, cette lignée transgénique a été injectée avec le M cherry localisé dans le noyau afin de mieux représenter ces niveaux de fluorescence. Nous pouvons modifier les tables de correspondance pour chacun de ces canaux à l’aide de l’outil de canal de couleur. Au cours de la série temporelle acquise, il semble que l’échantillon de poisson fermeture éclair se soit déplacé dans le champ de vision. Pour corriger ce décalage, elle a ouvert le plugin de correction 3D du décalage dans le sous-menu d’inscription des plugins installés dans Fiji.

Les marqueurs de cellules qui sont soit largement exprimés dans un échantillon, soit non impliqués dans les événements cellulaires durant l'acquisition d'images constituent la meilleure source pour la correction de la dérive. Dans cet exemple, il s'agit de ACTA1, la fluorescence GFP dans le canal un. Si la mémoire de votre système est limitée, sélectionnez l'option de pile virtuelle et laissez le plugin Correct 3D drift s'exécuter.

Le jeu de données corrigé aura une taille de canevas plus grande par rapport à l'original, afin de tenir compte du déplacement de l'échantillon. La génération d'images de projection maximale des sections optiques permet de comparer la dérive qui a été supprimée de l'échantillon corrigé.

La projection d'intensité maximale supprime la dimension temporelle du jeu de données, mais constitue une méthode utile pour examiner rapidement les résultats de la correction de la dérive. Ici, nous observons les images de projection maximale pour chaque point temporel dans leurs jeux de données corrigés et non corrigés. Lorsque cette expérience en laps de temps est projetée sous forme d'une image unique, l'ampleur de la dérive pouvant survenir même au cours d'une courte expérience en laps de temps devient évidente.

Les corrections effectuées en enregistrant la dérive d'un canal de votre échantillon sont également appliquées à tous les autres canaux contenus dans cette pile d'images. La procédure de correction de la dérive si la mémoire est limitée sur votre système est légèrement modifiée. Sélectionnez l'option de pile virtuelle utilisée à la fois dans le format d'achat, le menu d'importation, et dans le menu contextuel du plugin de correction de la dérive 3D.

Lorsque vous sélectionnez cette option, vous êtes invité à choisir un emplacement où un module complémentaire peut exporter des fichiers d'image individuels pour chaque coupe de canal et chaque point temporel de votre expérience en lapse de temps. La pile virtuelle générée contient la même correction de dérive que dans notre exemple précédent. Si nous ouvrons l'emplacement de sauvegarde sélectionné, nous verrons les fichiers séquentiels d'images individuelles résultants qui ont été générés.

Pour ouvrir ce regroupement de fichiers, utilisez l'outil d'importation de séquence d'images. Le fichier résultant ne séparera pas les canaux, les sections optiques ni les points temporels. Pour visualiser ces caractéristiques, convertissez la pile en une hyperpile à l'aide des données du fichier journal, puis saisissez le nombre de canaux, de tranches optiques et de points temporels enregistrés. Nous pouvons de nouveau modifier les tables de correspondance pour ajuster la couleur affichée de notre expérience en lapse de temps.

Ce protocole corrige la dérive survenant entre les points temporels ; toutefois, la dérive survenant pendant l'acquisition d'un point temporel unique ne peut pas être corrigée par ce protocole. Nous recommandons d'utiliser des paramètres d'acquisition d'image permettant de réduire le temps nécessaire à la capture de chaque point temporel. La possibilité de corriger la dérive à l'aide d'un logiciel de post-traitement permet d'analyser et de mesurer des mouvements cellulaires qui, autrement, seraient masqués par la dérive de l'échantillon.