Exemple de correction de la dérive Après 4D confocale imagerie time-lapse

La microscopie TimeLapse permet de visualiser les processus de développement, de croissance ou de dérive de l’échantillon qui se produit sur cette image. L’acquisition peut entraîner une incapacité à suivre ou à suivre les mouvements des cellules, le protocole suivant. Nous utilisons un logiciel de traitement d’imagerie open source pour corriger la dérive tridimensionnelle au fil du temps.

La capture d’une série de sections optiques à différents plans focaux permet de générer un modèle tridimensionnel de l’échantillon. Cela peut être étendu en quatre dimensions en créant une série de jeux de données 3D en accéléré. Dans les expériences à long terme, il est courant d’observer le mouvement de l’échantillon.

Cela peut être causé par des précisions de glissement dans l’étage de contrôle du matériel et les positions focales, tandis que dans d’autres cas, la dérive résultant de mouvements induits par la croissance de l’échantillon ou la flexibilité dans le support de montage existe des méthodes pour compenser et limiter ces mouvements avec de nombreuses améliorations des systèmes de mise au point du matériel et la rigidité accrue du support de montage. Cependant, ces approches ne peuvent pas être appliquées dans de nombreux cas en raison de la configuration d’imagerie requise pour fournir des conditions appropriées pour la correction de la maintenance et de la croissance des échantillons. Pour la dérive des échantillons, nous avons développé un plugin pour utiliser la plate-forme de traitement d’imagerie open source des Fidji.

Notre plugin de dérive 3D correcte est capable de former un enregistrement de corrélation de phase pour corriger le mouvement qui se produit en tant que rôle ou dérive d’échantillon dans des expériences time-lapse tridimensionnelles dans des expériences multicanaux. Le plugin de dérive 3D correct utilise un canal pour déterminer la correction requise. Cette correction est ensuite appliquée à tous les canaux supplémentaires entraînant l’enregistrement de l’ensemble de données des quatre D.

Le package Web gratuit open source. Fiji est un fork de distribution, le programme Image J, qui contient des plugins préinstallés pour effectuer de nombreux processus sur des données collectées à partir d’expériences de microscopie. Fiji fournit une architecture de plugin plus facile et l’inclut dans l’installation par défaut.

Une copie des trois plugins EG corrects, que nous utiliserons pour cette analyse une fois l’installation terminée Open Fiji. Les Fidji prennent en charge l’importation d’un vaste éventail de formats d’images de microscopie propriétaires. Cela peut être réalisé par glisser-déposer ou par l’intermédiaire des utilisateurs, l’environnement de microscopie ouvert.

Plugin d’importation de formats bio. Si l’ensemble de données dépasse la taille de la mémoire installée sur votre système, ouvrez le fichier image en tant que pile virtuelle et d’une option de gestion de la mémoire. L’ensemble de données que nous utiliserons dans cette analyse a été généré à partir d’une expérience de série chronologique tridimensionnelle de l’ACTA, le poisson zèbre transgénique GFP dans lequel la GFP est exprimée dans le muscle squelettique.

Pour visualiser les noyaux, cette ligne transgénique a été injectée avec le nucléo localisant M cherry pour mieux représenter ces étages fluorés, nous pouvons modifier les tables de recherche pour chacun de ces canaux sous l’outil de canal de couleur. Au cours de la série chronologique recueillie, il semble que l’échantillon de poisson à fermeture éclair ait dérivé dans le champ de vision. Elle a corrigé cette dérive et a ouvert le bon plugin de dérive 3D dans le sous-menu d’enregistrement des plugins installés aux Fidji.

Les marqueurs de vendeur qui sont soit largement exprimés au sein d’un échantillon, soit qui ne sont pas impliqués dans les événements de commercialisation lors de l’acquisition de l’image, constituent la meilleure source de correction de dérive. Dans cet exemple, celui de l’ACTA, la fluorescence GFP dans le premier canal. Si la mémoire est limitée sur votre système, sélectionnez l’option de pile virtuelle et autorisez l’exécution du plug-in Correct 3D drift.

La taille du canevas du jeu de données corrigé est supérieure à celle de l’original. S’adapter au mouvement de l’échantillon. La génération d’images de projection maximale des sections optiques permet de comparer la dérive qui a été retirée de l’échantillon corrigé à effectuer.

La projection d’intensité maximale supprime la dimension de l’ensemble de données, mais il s’agit d’une approche utile pour examiner rapidement les résultats de la correction de la dérive. Ici, nous voyons les images de projection maximales pour chaque point de rattachement dans leurs ensembles de données corrigés et non corrigés. Lorsque cette expérience time-lapse est projetée sous la forme d’une seule image, la quantité de dérive qui peut se produire même dans une courte expérience time-lapse est apparente.

Les corrections apportées en enregistrant la dérive d’un canal de votre échantillon sont également appliquées à tous les autres canaux contenus dans cette pile d’images. La procédure de correction de la dérive si la mémoire est limitée sur votre système est légèrement modifiée. Sélectionnez l’option La pile virtuelle utilisée à la fois dans le format d’achat, le menu d’importation et dans le menu contextuel du plugin de dérive 3D approprié.

Lorsque vous sélectionnez cette option, vous êtes invité à sélectionner un emplacement où un plug-in peut exporter des fichiers d’image individuels pour chaque tranche de canal et point temporel de votre expérience time-lapse. La pile virtuelle générée contient la même correction de dérive que notre exemple précédent. Si nous ouvrons l’emplacement de sauvegarde sélectionné, nous verrons les fichiers de séquence d’images individuels résultants générés.

Pour ouvrir cette collection de fichiers, utilisez l’outil d’importation de séquences d’images. Le fichier résultant ne séparera pas les canaux, les sections optiques ou les points temporels. Pour visualiser ces caractéristiques, convertissez la pile en hyper pile à l’aide des données du fichier journal, entrez le nombre de canaux, les tranches optiques et les points de rattachement collectés dans le, Nous pouvons à nouveau modifier les tables de correspondance pour ajuster la couleur affichée de notre expérience time-lapse.

Ce protocole corrige la dérive qui se produit entre les points temporels La dérive qui se produit lors de la capture d’un seul point temporel ne peut pas être corrigée par ce protocole. Nous recommandons que les paramètres utilisés pour l’acquisition d’images réduisent le temps nécessaire à chaque point temporel à capturer. La capacité de corriger la dérive dans un logiciel de post-traitement permet d’analyser et de mesurer les mouvements cellulaires qui seraient autrement des compétences par la dérive de l’échantillon.