Séparation automatique des C. elegans Façon variable colonisé par une bactérie pathogène

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer les contributions de la colonisation et des dommages qui y sont associés à l’initiation des réponses immunitaires innées dans l’élégance marine. Ceci est réalisé en exposant une population synchronisée de jeunes adultes à l’élégance marine de Pseudomonas arosa exprimant la protéine fluorescente verte ou GFP, qui produit une population de vers diversement colonisés par l’agent pathogène. Après avoir lavé les populations de vers colonisés, les populations colonisées sont séparées en populations pures en se concentrant sur les deux extrêmes des vers entièrement colonisés et non colonisés.

Ensuite, l’ARN est extrait de ces populations et l’expression des gènes immunitaires est évaluée par rapport aux vers cultivés sur des e-coli non pathogènes. Afin d’examiner la relation entre la réponse immunitaire et la colonisation, des résultats sont obtenus pour montrer que la réponse immunitaire innée de l’élégance marine à la p arosa peut être découplée de la colonisation par des agents pathogènes. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres approches pour étudier l’initiation de la réponse immunitaire dans l’élégance marine est qu’elle aborde la variabilité de l’infection dans les populations chaudes, ce qui nous permet de démêler différents aspects du processus d’infection.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’élégance marine, l’immunité innée telle que la base de l’initiation des réponses immunitaires innées et de manière à haut débit. Quel est l’impact des différentes manipulations génétiques ou environnementales sur la capacité à résister à la colonisation par des agents pathogènes ? Pour commencer, cultivez des vers sur plusieurs nématodes, milieu de croissance ou plaques NGM ensemencés avec la bactérie E coli jusqu’à ce que de nombreux vers aient atteint le stade de la tombe.

Traitez ensuite les animaux graves avec une solution de préparation d’œufs pour obtenir une culture synchronisée. Assiette suivante. Les œufs sur plusieurs plaques NGM de 60 millimètres ont été ensemencés de bactéries à une densité d’environ 150 à 200 œufs par boîte.

Un minimum de 15 à 20 plaques sera nécessaire pour obtenir plusieurs milliers de vers. Pour l’expérience de tri, les utilisateurs doivent passer à l’échelle supérieure en utilisant des plaques de plus grand diamètre avec plus d’œufs par plaque si un plus grand nombre de vers est nécessaire. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius pendant deux jours jusqu’à ce que les vers aient atteint le stade L quatre ou jeune adulte.

Le lendemain de la préparation des œufs, inoculez A GFP exprimant la culture POSA, PA 14 GFP, dans deux millilitres de rois B.Medium contenant l’antibiotique. Incuber la culture à 37 degrés Celsius avec agitation pendant la nuit. Le lendemain, placez la culture PA 14 GFP sur autant de plaques à tuyage lent que nécessaire pour le test sur chaque boîte de Pétri de 150 millimètres.

Pipeter 75 à 100 microlitres de culture saturée et répartir uniformément. À l’aide d’un épandeur de verre stérile, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures. Retirez les plaques avec PA 14 GFP de l’incubateur et laissez-les refroidir à température ambiante.

Pendant ce temps, pour recueillir les vers cultivés sur les plaques NGM, ajoutez une petite quantité de tampon M nine suffisante pour couvrir la plaque. Faites tourner doucement la plaque et transférez le liquide dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les vers se déposer au fond et éliminez l’excès de liquide avant de transférer les vers sur des plaques PA 14 GFP Dans un volume minimal de liquide, lors de l’utilisation de plaques de 150 millimètres, plusieurs centaines de vers peuvent être placés sur une seule plaque.

Incuber les plaques à 25 degrés Celsius pendant 18 à 21 heures pour les jeunes vers adultes exposés au parosa. Il s’agit de la fenêtre de temps affichant la répartition optimale des animaux colonisés par rapport aux animaux non colonisés avant d’effectuer le tri de l’échantillon pour s’assurer que la machine fonctionne correctement. Les étapes essentielles sont décrites ici et les détails peuvent être obtenus en ligne.

Réglez la pression de la vanne de gaine à environ cinq PSI pour vérifier que le débit de fluide de la gaine est approprié. Placez un tube conique de 15 millilitres sous le distributeur. Allumez la vanne de la gaine et fermez la vanne du trieur.

Tenez le tube sous le distributeur pendant 60 secondes. Le volume dans le tube doit être de neuf à 10 millilitres. S’il est en dehors de cette plage.

Ajustez la pression de la soupape de gaine en conséquence pour vous assurer que le débit de fluide de la gaine permettra un tri précis. Testez le taux de tri en fermant d’abord la vanne de la gaine. Ajoutez ensuite environ 25 millilitres de solution de particules de contrôle dans le réservoir.

Allumez la vanne de gaine et la vanne d’échantillonnage sur le logiciel de l’ordinateur. Accédez au mode de contrôle des particules et cliquez sur acquérir. Assurez-vous que le débit de particules est d’environ cinq à huit particules par seconde, le temps de vol étant d’environ la largeur de la particule de 40 micromètres.

Cela garantira qu’un seul objet de 40 microns passe à la fois. Si les valeurs sont en dehors de cette plage, ajustez les paramètres en conséquence. À l’aide de neuf vers tampons, lavez-les dans des tubes coniques de 15 millilitres, laissez les vers adultes couler au fond du tube par gravité et éliminez le surnageant.

Remplissez le tube avec un tampon M nine frais. Répétez ce processus trois à quatre fois. Cela élimine une grande partie des larves ainsi que des bactéries en excès et prend environ 10 minutes.

Ajoutez les vers dans le réservoir du trieur de vers contenant une petite barre d’agitation à mélange doux. Ajustez le gain initial du signal en réglant le tube photomultiplicateur vert sur 600 et le tube photomultiplicateur rouge et jaune sur 200. Commencez à acquérir des données pour ajuster les paramètres.

Visez un taux de tri de 25 à 30 événements ou vers par seconde. Si le taux de nombre est trop élevé, diluez les vers dans le réservoir avec M neuf. Tamponnez en conséquence.

Si le taux est trop faible, ajoutez plus de vers dans un petit volume de M neuf. Si l’expérience nécessite une séparation très stricte entre les vers colonisés et les vers non colonisés, réglez le test de coïncidence sur pur. Cela garantit que si deux objets se trouvent trop près l’un de l’autre ou dans la même goutte, la machine rejette la goutte.

Plutôt que de les collecter pour trier la population d’intérêt, tracez des portes autour de l’axe indiquant la taille et l’intensité de fluorescence. Les valeurs du déclenchement fluorescent doivent être déterminées empiriquement. Ensuite, placez une plaque multi-puits ou une boîte de Pétri sous le distributeur pour recueillir les vers.

Ouvrez ensuite la vanne de tri pour commencer à trier les vers. Prélever une petite population d’animaux pour vérifier au microscope que la population triée est la population d’intérêt. Si ce n’est pas le cas, ajustez les paramètres d’un gate en conséquence et poursuivez le prélèvement de l’échantillon.

Lorsqu’ils sont appariés selon l’âge, l’élégance marine génétiquement identique qui sont exposés à la GFP exprimant la posa entraîne une large distribution des niveaux de colonisation, une séparation efficace des vers non colonisés des vers colonisés a été réalisée à l’aide d’un trieur de vers. Contrairement aux vers non colonisés, les vers colonisés montrent des signes manifestes de léthargie et réduisent la défécation. Ce dernier peut être une raison pour laquelle les vers colonisés par P arosa ont du mal à éliminer l’infection.

Quatre gènes ont été induits de manière similaire à l’exposition à P arosa, quel que soit le statut de colonisation des vers, et le R-T-P-C-R quantitatif a été utilisé pour mesurer l’expression des gènes. Les quatre gènes sont connus pour faire partie de la réponse immunitaire de l’ingénieur CL. Lys deux code pour un lysozyme deux gènes non caractérisés en réponse spécifiquement à l’infection, dont l’un contribue également à la résistance aux infections, et PGP cinq répond à l’infection ainsi qu’au stress des métaux lourds.

Les résultats corroborent les résultats publiés précédemment indiquant que la colonisation et les dommages qui y sont associés ne sont pas nécessaires à une réponse immunitaire. Au lieu de cela, il s’agit de mettre en évidence les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes comme données de signal montrant que la PGP cinq est induite chez les animaux non colonisés, qui ne devraient pas être présents. Des dommages importants suggèrent un chevauchement dans les programmes de réglementation, de contrôle des réponses immunitaires et des réponses générales au stress dans l’élégance de la mer.

Cette méthode peut fournir de nouvelles informations sur l’initiation des réponses immunitaires dans l’élégance marine, mais elle pourrait également être appliquée à d’autres questions telles que les effets des conditions environnementales ou de la manipulation génétique sur la colonisation ou la compétition entre différents agents pathogènes en plus des processus d’infection. Cette méthode pourrait également être appliquée pour suivre d’autres interactions des vers avec leur environnement, telles que l’ingestion ou la séquestration de métabolites ou de produits chimiques. À la suite de cette procédure, les populations d’intérêt triées peuvent être utilisées à diverses fins au-delà de l’expression des gènes.

Il s’agit notamment de collecter des animaux vivants pour des tests ultérieurs d’infection ou de survie ou des expériences comportementales. Cette technique fournit un moyen utile d’étudier les effets de l’exposition et de la colonisation par des agents pathogènes sur l’immunité innée et l’élégance marine.