Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les modifications post-traductionnelles des protéines impliquées dans des complexes protéiques végétaux, exprimés d'abord de manière transitoire ou stable dans des plantes, portant une étiquette sur la protéine d'intérêt. Ensuite, extraire les protéines totales à partir du tissu végétal, puis immunoprécipiter la protéine d'intérêt. Puis, séparer les protéines immunoprécipitées sur un gel d'acrylamide, extraire et digérer les protéines à partir de la bande de gel d'intérêt.

Envoyez maintenant les échantillons de protéines pour spectrométrie de masse. En fin de compte, les résultats de la spectrométrie de masse peuvent détecter des changements dynamiques dans les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation. Contrairement à d'autres méthodes comme l'incubation in vitro d'une kinase avec son substrat, cette méthode exprime les protéines dans un planter.

Ainsi, vous n'avez pas besoin de savoir quelle kinase est responsable de la phosphorylation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que la manière dont les signaux sont transduits en réponse au stress, aux changements environnementaux ou à la reconnaissance de pathogènes. En plus de l'identification des sites de phosphorylation des complexes protéiques de résistance activés, cette méthode peut être largement appliquée à toute modification post-traductionnelle de tout complexe protéique végétal.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car elles ne sont pas habituées à manipuler de grandes quantités d'extrait et à effectuer davantage d'étapes du protocole en une seule journée. Pour l'expression transitoire, faire croître les souches d'agrobactéries jusqu'à la phase stationnaire. Récolter les agrobactéries par centrifugation à 3000 Gs pendant cinq minutes.

Resuspendre les culots dans le tampon d'infiltration. Infiltrer maintenant. Des plantes NCOA hamana âgées de quatre semaines avec des bactéries agrobactériennes manuellement à l'aide d'une seringue de un millilitre sans aiguille ou par vide avec 0,02 % de tensioactif, deux à cinq jours après l'infiltration.

Récolter les feuilles infiltrées, les congeler dans de l'azote liquide et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, broyer 20 grammes de tissu végétal avec de l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon, puis ajouter 80 millilitres de tampon C froid aux 20 grammes. Bien mélanger et décongeler sur de la glace.

Homogénéisez maintenant à l’aide de trois impulsions de 10 secondes chacune à pleine vitesse. Filtrez l’homogénat et centrifugez à 30 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant ce temps, ajoutez 100 microlitres d’une matrice d’affinité appropriée à 500 microlitres de tampon de blocage froid D pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis rincez trois fois avec un millilitre de tampon D froid. Ensuite, retirez le surnageant de l’extrait foliaire et faites-le passer à travers une seringue de 0,45 micromètre.

Filtrer dans un nouveau tube placé sur de la glace. Aliquoter l'extrait brut. Pour un immunoblot.

Ajoutez cinq vortex de tampon de chargement XSDS et faites bouillir les échantillons pour les dénaturer. Ajoutez 50 microlitres de la matrice d'affinité, suspendue dans le tampon D, à chaque tube. Incubez avec une rotation douce pendant deux heures à quatre degrés Celsius, puis centrifugez pour former un culot de la matrice d'affinité.

Ensuite, prélevez une aliquote de l'extrait non lié pour un immunoblot. Jetez le reste de l'échantillon, en laissant environ 500 microlitres au fond du tube. Resuspendez la suspension à l'aide d'une pipette à embout large.

Regroupez la solution de suspension mixte provenant des deux tubes dans un seul tube de 1,5 millilitre. Effectuez trois impulsions de cinq secondes chacune à l’aide d’une centrifugeuse de banc afin de précipiter la matrice d’affinité, puis éliminez le surnageant après trois à cinq lavages avec un millilitre de tampon D froid. Retirez l’excès de tampon D à l’aide d’une aiguille de seringue, puis élué avec 200 microlitres du tampon d’élution approprié sous agitation constante. Rassemblez les trois EIT dans un seul tube.

Ensuite, concentrez les protéines en utilisant 30 microlitres de résine d'absorption agitée au vortex. Laissez reposer pendant cinq minutes, précipitez la résine, puis éliminez le surnageant. Ajoutez 50 microlitres de tampon de charge SDS 1X à la matrice d'affinité précipitée ou à la résine d'absorption agitée au vortex, puis faites bouillir pendant 10 minutes à 80-100 degrés Celsius dans un bloc chauffant centrifuge.

La matrice d'affinité bouillie est une résine pendant deux minutes à 10 000. GS aliquoter cinq microlitres du surnageant pour le blocage immuno et courir avec les autres fractions sur un gel SDS-PAGE de 10 centimètres de long. Gel destiné à la séparation et à l'identification des protéines phosphorylées par spectrométrie de masse.

Chargez les 45 microlitres restants sur un gel SDS-PAGE et faites une coloration au bleu de brillance kamasi colloïdal. Ensuite, dénichez le gel par de nombreux lavages à l'eau, de préférence pendant la nuit.

À présent, avec un scalpel propre, excisez la bande d’intérêt à partir du gel, découpez le fragment de gel en cubes de deux à quatre millimètres et transférez l’échantillon dans un tube. Lavez les morceaux de gel avec du acétonitrile 50 % et du bicarbonate d’ammonium 50 millimolaire jusqu’à décoloration. Ensuite, aspirez la solution à l’aide d’une pipette.

En prenant soin de ne pas retirer les morceaux de gel. Déshydrater l'échantillon avec 100 % acétonitrile pendant cinq minutes, puis éliminer le liquide libre. Ensuite, réduire les ponts disulfure des protéines par du DTT à 10 millimolaire et incuber de 30 à 45 minutes à 56 degrés Celsius avec agitation. Éliminer maintenant le liquide libre pour alkylater les résidus de cystéine.

Ajouter 55 millimolaire de chloroacétamide pendant 20 à 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Éliminer le liquide libre, puis laver les morceaux de gel deux fois avec 50 % d’acétonitrile pendant 10 minutes. Éliminer le liquide libre.

Maintenant, déshydratez les morceaux de gel avec du acétonitrile à 100 % pendant cinq minutes, puis éliminez le liquide libre pour la digestion Triptych. Ajoutez 40 microlitres de solution working de trypsine et laissez les morceaux de gel se réhydrater pendant 10 minutes dans un volume suffisant de tampon de digestion pour recouvrir les morceaux de gel. Incubez à 37 degrés Celsius toute la nuit pour arrêter la digestion, puis extrayez les peptides des morceaux de gel à l'acide formique à 5 % par sonication pendant cinq à dix minutes.

Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube, séchez les peptides par lyophilisation ou à l’aide d’un concentrateur sous vide, et conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. Cette expérience permet de purifier le complexe kinase P-R-F-P-T-O à partir de nacoa hamana. Un NACOA hamana transgénique exprimant le 35 SPTO a été transformé de manière transitoire avec le 35 SPRF flag, et le complexe a été immunoprécipité à l’aide d’Anti-Flag M deux aros. Les immunotransferts illustrent une immunoprécipitation efficace de la protéine cible PRF, et à la fois PTO et la protéine effetrice interagissante ont été co-purifiées avec PRF, comme indiqué par la détection par anticorps et l’analyse en spectrométrie de masse.

Ici, la stratégie consistait à cibler la protéine PTO avec un anticorps anti-Flag. La stratégie a été modifiée afin d'identifier les sites de phosphorylation de PTO.

La quantité totale de la protéine PTO, comprenant à la fois le complexe PRF et la forme libre, a été immunoprécipitée à l’aide d’anticorps anti-Flag M deux aros et soumise à une fractionnation par électrophorèse SDS-PAGE, suivie d’une digestion en gel par tripysine et d’une analyse en spectrométrie de masse, ce qui a permis d’obtenir des peptides PTO couvrant environ 80 % de sa séquence. De manière intéressante, un ensemble de sites de phosphorylation unique sur les peptides PTO a été identifié. À noter que des sites de double phosphorylation n’ont été détectés que en présence de l’une ou l’autre protéine effectrice.

Il est important d'obtenir des quantités suffisantes de protéines végétales afin d'identifier les composants d'un complexe protéique et de détecter également les modifications post-traductionnelles d'une protéine d'intérêt. N'oubliez pas que la cartographie de modifications telles que la phosphorylation nécessite une quantité raisonnable de protéine pour la spectrométrie de masse, de sorte qu'une bande, même faible, devrait être visible sur votre gel après avoir suivi cette procédure. D'autres méthodes, comme l'identification des composants du complexe, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont l'activation du complexe immunitaire conduit à une immunité fonctionnelle.

N'oubliez pas que le travail avec des tampons organiques, des bactéries et des lames de rasoir BBL peut être extrêmement dangereux ; prenez donc des précautions telles que le port de gants et de blouses de laboratoire.