Name: Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez une méthode quantitative pour étudier la migration cellulaire confinée dans des canaux microfabriqués en PDMS. Cette technique permet d'analyser les vitesses de déplacement de différents types cellulaires par microscopie.

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Les auteurs remercient grandement la plate-forme IBiSA PICT à l&#39;Institut Curie (CNRS UMR 144). Ce travail a été financé par des subventions de: le Conseil européen de la recherche à AM.LD (Strapacemi 243103), l&#39;Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-Piri-0027-CPV), la fondation InNaBioSanté (Micemico) à MP et AM. LD et l&#39;ERC Strapacemi jeune subvention de chercheur à AM.LD.

Note importante: Ce protocole suppose que le moule contenant la forme pour les microcanaux désirés ont déjà été accomplis. Pour plus d&#39;informations sur la préparation du moule a été déjà publié 10. Ce protocole suppose aussi que la culture des pays en développement de la moelle osseuse est connu. Une. Fabrication de puces <ol><li> Mélanger l&#39;huile PDMS et l&#39;agent de durcissement dans un rapport pondéral 10:01 dans un gobelet en plastique. Mélanger soigneusement les deux composés. </li><li> Jetez le mélange sur les microcanaux d&#39;appui du moule. La hauteur totale doit être comprise entre 0,5-1 cm. </li><li> Retirer les bulles d&#39;air dans une cloche de pot sous vide pendant 1 heure. </li><li> PDMS durcir dans le moule, en plaçant celle-ci dans un four pendant 2 heures à 65 ° C. </li><li> Une fois que le PDMS est à température ambiante, couper un gros morceau autour de la structure avec une lame chirurgicale et le retirer du moule (figure 1A). </li><li> Percez des trous où les cellules seront injectées (généralement de 2 mm) et redimensionner le PDMSavec une lame chirurgicale pour s&#39;adapter à la taille des récipients en verre à fond dans lequel la migration sera évaluée (figure 1B). Avant de commencer, enlever la poussière résiduelle de l&#39;antenne à l&#39;aide du papier optique. Cela favorise la liaison de PDMS de verre décrit à l&#39;étape 1.10. </li><li> Nettoyez la puce PDMS redimensionnée contenant les canaux par collage et le pelage du ruban adhésif sur les côtés de la structure. </li><li> Soniquer les morceaux PDMS 30 sec à 70% d&#39;éthanol pour éliminer les poussières et les petites particules de PDMS. Séchez-les rapidement par la suite par soufflage d&#39;air propre. </li><li> Activer le PDMS (structures vers le haut) et des boîtes de culture à l&#39;air (ou d&#39;oxygène) traitement au plasma pendant 30 secondes à 300 mTorr. </li><li> Placez les deux surfaces activées au contact de coller définitivement les PDMS sur le substrat. Si nécessaire, l&#39;utilisation de pinces métalliques à presser légèrement sur ​​le dessus du PDMS pour forcer le contact entre le polymère et le verre de la cuvette (figure 1C). </li><li> Incuber la puce à l&#39;étuve à 65 ° C for 1 h à renforcer la liaison. </li></ol> 2. Revêtement de microcanaux <ol><li> Activer l&#39;ensemble de la structure par plasma dans l&#39;air à 300 mTorr pendant 1 min. Cela favorisera l&#39;entrée de liquide dans les canaux à l&#39;étape suivante. </li><li> Remplir rapidement les trous de la puce avec la fibronectine d&#39;entrée à 10 pg / ml dans l&#39;eau. D&#39;autres substrats tels que le PEG peuvent être utilisés pour modifier l&#39;adhérence des cellules aux parois du canal. Veillez à ce que le liquide se répand dans l&#39;ensemble de la structure. Ceci peut être facilement vérifié par l&#39;œil sous la lumière régulière ou en utilisant un microscope ordinaire de champ lumineux. NOTE: Dans les très petites structures, dont la diffusion est plus difficile, entrée de liquide dans les canaux peut être forcée en plaçant la structure dans une cloche de pot à vide pendant au moins 15 min. Pour vérifier l&#39;efficacité de l&#39;enrobage des substrats fluorescents peuvent être utilisés (figure 2). </li><li> Incuber 1 heure à température ambiante pour permettre l&#39;adsorption de la fibronectine ou tout autre revêtement de substévaluer les parois des canaux. </li><li> Lavez les structures 3x avec PBS pour éliminer le substrat nonbound. </li><li> Après le lavage, procéder au protocole 3 ou stocker la puce à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (24 heures maximum). </li></ol> 3. Cellule Chargement en cours <ol><li> Retirer le PBS de la plaque et de remplir le microsystème avec du milieu cellulaire. Laissez incuber pendant 1 heure à saturer les canaux avec le milieu. NOTE: Pour les expériences portant sur des médicaments comme les inhibiteurs de molécules, il est conseillé de pré-incuber les canaux avec un milieu contenant le médicament à la bonne concentration. De plus, certains médicaments ont tendance à se solubiliser dans la structure PDMS qui réduit la concentration efficace. Certaines solutions ont été proposées pour contrer ce problème 11-12. </li><li> Retirer les PED flottants et récupérer les cellules semi-adhérentes par balayage avec un milieu de culture. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. REMARQUE: Pour l&#39;imagerie noyau, un Hoechst 33342 coloration peut être obtenue au préalable par decubating 2 x 10 6 cellules pendant 30 min avec le colorant à 200 ng / ml dans du milieu complet. Laver deux fois par centrifugation pour éliminer l&#39;excès de colorant avant de poursuivre le protocole. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min (temps et la vitesse peuvent être différents selon le type de cellule) et jeter le milieu. On dilue le culot pour atteindre une concentration de 20 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Éliminer l&#39;excès de milieu de la plaque et vider les trous d&#39;entrée dans la structure PDMS à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Remplir les entrées avec 5 pl de solution de cellules pour atteindre une quantité de 1 x 10 5 cellules dans chaque trou d&#39;entrée. REMARQUE: La forte densité de cellule est nécessaire pour favoriser le contact des cellules avec les canaux. La faible densité de cellules peut donner lieu à un faible nombre de cellules à l&#39;intérieur des canaux et l&#39;échec de l&#39;expérience. </li><li> Incuber la puce pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur. Ajouter 2 ml de milieu complet à la boîte de test. NOTE: L&#39;ensemble de la structure de PDMS doit be couvert afin d&#39;éviter le séchage des cellules au cours de l&#39;expérience. Si 2 ml n&#39;est pas suffisant, ajouter plus de moyen pour couvrir complètement la structure PDMS. </li></ol> 4. Imagerie <ol><li> Nettoyer la surface externe du fond des plats avec le tissu de nettoyage de lentille avant de placer les plaques sous le microscope. </li><li> Pour analyser la migration en grand nombre de cellules, utiliser un grossissement de 10X et éclairage grand champ en CO 2 et la température équipée vidéo-microscope (Figure 3). Pour faciliter le suivi de la cellule, coloration de Hoechst et aux rayons UV peut être utilisé (voir l&#39;étape 3.2). La migration peut être également analysée en utilisant la microscopie confocale afin d&#39;obtenir une meilleure résolution des structures cellulaires au cours de la migration. </li><li> Pour la microscopie time-lapse à 10X, pour choisir une fréquence de temps selon la vitesse de cellule attendu (typiquement de 2 min pour les cellules dendritiques migrent à une vitesse de 5 um / min). Remarque: Le protocole décrit ici ne not comprennent l&#39;analyse des paramètres de migration cellulaire. Quelques points sont répertoriés dans la discussion d&#39;informer les lecteurs sur la façon de procéder pour extraire des informations à partir de films de time-lapse. </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ici, nous décrivons un dispositif composé de microcanaux comme une méthode pour étudier les propriétés migratoires des grand nombre de cellules dans des expériences simples. Ce système expérimental imite les contraintes environnementales confinés trouvés dans les tissus par des cellules migratoires endogènes. Cependant, en forçant la migration dans une seule dimension, il facilite le suivi automatique de la cellule et l&#39;extraction de paramètres mesurables (Figure 5). Nous montrons également que notr...

La migration est une fonction cellulaire complexe qui est important pour de nombreux processus physiologiques chez les organismes multicellulaires, y compris le développement, les réponses immunitaires, et la régénération des tissus. En outre, certaines situations pathologiques telles que l&#39;invasion tumorale et les métastases reposent sur ​​la motilité cellulaire 1. Pour ces raisons, la migration cellulaire est devenu un domaine d&#39;étude dans le cadre de la recherche à la fois fondamentale et translationnelle. In vivo, la plupart des tissus sont caractérisés par une matrice extracellulaire riche et haute densité cellulaire. La migration cellulaire par conséquent, dans des conditions physiologiques, se produit dans un environnement confiné complexe. Classiquement, probablement pour des raisons historiques et des limites techniques, la migration cellulaire a été étudiée dans les systèmes 2D plats qui ne se reproduisent pas beaucoup des propriétés de l&#39;environnement présentes dans les tissus, tels que l&#39;isolement. De plus, des facteurs comme l&#39;adhésion cellulaire, qui sont essentiels pour la motilité en 2D, ont été récemment montré à ne pas être necessacipalement requis pour la migration in vivo ou à l&#39;intérieur des gels, ce qui suggère que les mécanismes qui régissent la locomotion cellulaire en 2D et dans d&#39;autres environnements sont distincts 2. Plusieurs systèmes ont été développés pour imiter les propriétés complexes des tissus, le plus célèbre des gels de collagène les être, qui visent à récapituler les propriétés de la composition de la matrice extracellulaire 3. Ici, nous proposons des micro-canaux en tant que méthode complémentaire simple qui permet la migration des cellules d&#39;étude dans une dimension dans un environnement confiné. Dans ce système, les cellules migrent le long des microcanaux dans lesquels ils entrent spontanément. Cellules migratrices acquièrent alors la forme des canaux, l&#39;adoption d&#39;une géométrie tubulaire qui renforce probablement leur polarité. Le mouvement linéaire des cellules dans les canaux de la cellule permet un suivi automatique et l&#39;extraction des paramètres quantitatifs à partir d&#39;expériences. Du point de vue technique, ce système est facile et souple. Le Revêtementsg des parois de canal peut être manipulée, la taille et la forme des canaux peuvent être adaptées, et un grand nombre de cellules peut être analysée dans des expériences simples. Ce système peut également être mis à l&#39;échelle en place pour effectuer l&#39;analyse moyen de l&#39;écran de gamme de molécules impliquées dans la motilité cellulaire. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant des cellules dendritiques (DC) comme un modèle cellulaire. Ces cellules sont la clé du système immunitaire car ils participent à l&#39;initiation et le maintien de réponses immunitaires spécifiques 4. In vitro, les PED ont été montré pour migrer spontanément dans des environnements confinés et sont donc un bon modèle pour étudier la motilité cellulaire dans des microcanaux 5,6 . Surtout, ce système peut être étendu pour analyser la migration de tout autre type de cellules mobiles comme les lymphocytes T, les neutrophiles, les cellules tumorales ou 9.7.

<table><tbody><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>GE Silicones</td><td>RTV615</td><td>Emballage composé de 90 % de base de silicone et de 10 % d’agent de durcissement</td></tr><tr><td>Coupe-échantillon de carotte</td><td>Ted Pella Int.</td><td>Harris Uni-Core</td><td>Diamètre 2,5 mm</td></tr><tr><td>Plat à fond en verre</td><td>WPI</td><td>Fluorodish FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons</td><td>Branson Ultrasons</td><td>Branson 200</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32 G</td><td>Pour petits échantillons (35 boîtes). Une version plus grande est également disponible</td></tr><tr><td>Fibronectine à partir de plasma bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>PolyLysine greffé PEG (Pll-g-PEG)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

La méthode décrite ici permet l&#39;étude de la migration des cellules sous confinement dans une dimension. Il est basé sur l&#39;utilisation de canaux micro-usinés, qui imposent un phénotype de cellules polarisées par des contraintes physiques. Une fois à l&#39;intérieur des canaux, les cellules n&#39;ont que deux possibilités: aller de l&#39;avant ou vers l&#39;arrière. Cette migration simplifié dans lequel la directivité est limitée facilite le suivi automatique des cellules et l&#39;extraction des paramètres quantitatifs pour décrire le mouvement des cellules. Ces paramètres comprennent la vitesse de la cellule, les changements de direction, et les pauses pendant le mouvement. Microcanaux sont également compatibles avec l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents et sont donc appropriés pour étudier la localisation des organites intracellulaires et des structures au cours de la migration cellulaire à haute résolution. Enfin, la surface des canaux peut être fonctionnalisé avec des substrats différents, ce qui permet le contrôle des propriétés adhésives des canaux ou l&#39;étude des haptotaxis. En résumé, le système havant que décrit est destiné à analyser la migration des grands nombres de cellules dans des conditions dans lesquelles à la fois la géométrie et la nature biochimique de l&#39;environnement sont contrôlées, ce qui facilite la normalisation et la reproductibilité des expériences indépendantes.

Dans chaque expérience, la surface du PDMS est revêtue d&#39;une molécule adaptée à l&#39;intérêt de l&#39;étude. Figure 2 montre les canaux revêtus d&#39;une molécule fluorescente, PLL-g-PEG, avant et après le lavage (étape 2.4). Une telle expérience permet de contrôler l&#39;homogénéité du revêtement dans les canaux. Après chargement de la cellule, la microscopie vidéo peut être effectuée pour suivre la migration cellulaire. Figure 3A montre un exemple de ...

Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d&#39;un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de préparer des canaux microfabriqués afin d'étudier la migration cellulaire spontanée en confinement. Cela est réalisé en premier lieu en préparant la puce en polydiméthylsiloxane (PDMS) contenant les canaux. Dans un deuxième temps, les canaux sont recouverts de fibronectine ou d'un autre substrat d'adhésion, ce qui permet la fonctionnalisation du dispositif.Après plusieurs lavages, les cellules dendritiques sont chargées dans le microsystème afin d'étudier la migration cellulaire. Des résultats sont obtenus, montrant des différences de vitesse selon les types cellulaires ou les traitements, grâce à la microscopie et à l'analyse d'images. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la migration classique en deux compartiments, est que nous prenons en compte la géométrie et le confinement des cellules.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la précision requise pour exécuter chaque étape. Commencez par mélanger de l'huile de PDMS et de l'agent de réticulation dans un gobelet en plastique selon un rapport pondéral de 10 à 1, puis mélangez soigneusement les deux composés et versez le mélange sur le moule portant les microcanaux. La hauteur totale doit se situer entre 0,5 et 1 centimètre.Éliminer toutes les bulles d'air dans un enceinte à vide pendant une heure, puis durcir le PDMS dans le moule en le plaçant au four pendant deux heures à 65 degrés Celsius. Une fois que le PDMS a refroidi à température ambiante, découper un grand morceau autour de la structure à l’aide d’un scalpel et le décoller du moule. Ensuite, percer des trous là où les cellules seront injectées, puis retailler le PDMS au scalpel pour qu’il s’adapte aux boîtes avec fond en verre dans lesquelles la migration sera évaluée proprement.Le morceau de PDMS redimensionné contenant les canaux est traité en collant et décollant du ruban adhésif sur les côtés de la structure, puis les morceaux de PDMS sont soumis à une sonication. Traiter 30 secondes dans de l'éthanol à 70 % pour éliminer la poussière et les petites particules de PDMS avant de poursuivre. Retirer la poussière résiduelle du plat à l’aide d’un papier de nettoyage pour lentilles.Activer le PDMS et les boîtes de culture par traitement au plasma d'air pendant 30 secondes à 300 millitorrs, puis mettre en contact les deux surfaces activées afin de coller définitivement le PDMS au substrat si nécessaire. Utiliser des pinces métalliques pour appuyer légèrement sur le dessus du PDMS afin d'assurer le contact entre le polymère et le verre de la boîte. Incuber la puce dans l'étuve à 65 degrés Celsius pendant une heure.Pour renforcer la liaison, activer l'ensemble de la structure par un plasma d'air à 300 millitorr pendant une minute. Cette étape favorisera l'entrée du liquide dans les canaux à l'étape suivante. Ensuite, remplir rapidement les orifices d'entrée de la puce avec de la fibronectine à 10 microgrammes par millilitre dans l'eau.D'autres substrats, tels que le polyéthylène glycol, peuvent être utilisés pour modifier l'adhérence cellulaire aux parois du canal. Veillez à ce que le liquide se répande dans toute la structure. Cela peut être facilement vérifié à l'œil nu sous lumière ordinaire ou à l'aide d'un microscope classique en champ clair.Incubez ensuite la structure pendant une heure à température ambiante pour permettre l'adsorption de la fibronectine ou de tout autre substrat de revêtement sur les parois des canaux. Enfin, lavez les structures pour éliminer le substrat non lié en retirant tout le liquide des canaux et de la boîte, puis immergez-les dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS pendant cinq minutes. Retirez le PBS de la plaque et remplissez le microsystème avec du milieu de culture cellulaire.Laisser la plaque incuber pendant une heure afin de saturer les canaux avec le milieu pour collecter les cellules destinées à l'imagerie. Éliminer les cellules dendritiques en suspension et récupérer les cellules semi-adhérentes en rinçant la plaque avec du milieu de culture. Avant de compter les cellules.À l'aide d'un cytomètre hématique, centrifuger les cellules à 300 ×g pendant cinq minutes et éliminer le milieu. Diluer le culot afin d'obtenir une concentration de 20 millions de cellules par millilitre. Retirer l'excès de milieu de la plaque et vider les orifices d'entrée de la structure en PDMS.À l’aide d’une micropipette, remplir ensuite les puits avec cinq microlitres de solution cellulaire afin d’obtenir une quantité de un fois dix puissance cinq cellules dans chaque puits. Après avoir incubé la micropuce pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur, ajouter deux millilitres de milieu complet dans la boîte expérimentale pour l’imagerie.Tout d'abord, nettoyez la surface externe inférieure des boîtes avec un tissu de nettoyage pour lentilles avant de placer les plaques sous le microscope. Pour analyser la migration d'un grand nombre de cellules, utilisez un grossissement de 10 x et un éclairage en champ large sur un microscope vidéo équipé de CO2 et de contrôle de température afin de faciliter le suivi cellulaire. La coloration de Hirsch et la lumière UV peuvent être utilisées comme indiqué dans le protocole du texte pour la microscopie en enregistrement temporel à un grossissement de 10 x.Choisissez une fréquence temporelle en fonction de la vitesse cellulaire attendue. Cette fréquence est typiquement de deux minutes pour les cellules dendritiques migrantes à une vitesse de cinq micromètres par minute. Dans chaque expérience, la surface du PDMS est recouverte d'une molécule adaptée à l'objet de l'étude.Dans cette figure, les canaux sont recouverts d'une molécule fluorescente. Du polyéthylène glycol greffé à la polylysine avant et après lavage. Une telle expérience permet de contrôler l'homogénéité du revêtement dans les canaux ; après le chargement des cellules, une microscopie vidéo peut être réalisée afin de suivre la migration cellulaire.Voici un exemple de cellules dendritiques migrantes dans des microcanaux à une densité appropriée pour le suivi des cellules. La microscopie à contraste de phase et la coloration de Hersch peuvent être utilisées à cette fin. La technique est également compatible avec la microscopie confocale fluorescente à plus haute résolution et peut servir à suivre des organites ou des structures cellulaires, comme illustré par la dynamique de l'actine polymérisée dans des cellules dendritiques migrantes exprimant Life Act GFP.Un exemple de quantification de la motilité cellulaire analysée chez des cellules dendritiques en migration est présenté ici. La force générée par des cellules dendritiques de type sauvage ou traitées par le chlorure de dihydro-Y 27 632 montre que ce médicament est un inhibiteur bien caractérisé de la contractilité et de la migration cellulaire, et a été utilisé pour vérifier la capacité du système à détecter les changements de vitesse. Le kog peut être analysé plus en détail afin d'extraire la position et la taille des cellules en fonction du temps, permettant ainsi l'étude de différents paramètres pour décrire la migration cellulaire.La vitesse de migration a été suivie en imagerie de la position du noyau à l’aide d’un logiciel conçu en interne. Les cellules dendritiques présentent une vitesse moyenne proche de six micromètres par minute. Un traitement par le médicament diminue significativement leur vitesse.Cet exemple illustre la puissance de la technique, qui permet la quantification d'un grand nombre de cellules dans des expériences individuelles, ainsi que l'utilité du système pour détecter les différences induites par des traitements médicamenteux. Une fois maîtrisée, la technique décrite ici peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la migration pour étudier la locomotion cellulaire dans des environnements confinés contrôlés.

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Planar Gradient système de diffusion d&#39;enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

De nombreux dispositifs microfluidiques ont été développés pour être utilisés dans l’étude de l’électrotaxie. Pourtant, aucune de ces puces ne permet d’étudier efficacement les effets simultanés des champs chimiques et électriques (FE) sur les cellules. Nous avons mis au point un dispositif à base de polyméthacrylate de méthyle qui offre une stimulation coexistante et chimique mieux contrôlée pour la recherche sur l’électrotaxie.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

Ce protocole décrit en détail une méthode personnalisable pour mesurer la migration cellulaire en réponse à des chimioattracteurs qui peuvent également être utilisés pour déterminer le débit d'un médicament par diffusion hors d'une matrice de polymère.

Une chambre de mesure de la migration des cellules personnalisable

Le contrôle des gradients chimiques et d’oxygène est essentiel pour les cultures cellulaires. Cet article fait état d’un dispositif microfluidique polydiméthylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) capable de générer de manière fiable des combinaisons de gradients chimiques et d’oxygène pour les études de migration cellulaire, qui peut être utilisé dans la pratique dans les laboratoires de biologie sans instrumentation sophistiquée.

Polydiméthylsiloxane-polycarbonate dispositifs microfluidiques pour cellulaire Migration Studies Sous Perpendiculaire chimique et Dégradés d&#39;oxygène

La migration collective des cellules dans le développement, la cicatrisation des plaies et la métastes du cancer est souvent guidée par les gradients des facteurs de croissance ou des molécules de signalisation. Décrit ici est un système expérimental combinant la microscopie de traction avec un système microfluidique et une démonstration de la façon de quantifier la mécanique de la migration collective sous gradient biochimique.

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Un protocole pour l’évaluation quantitative de la migration cellulaire 3D à l’intérieur et dans l’interface des hydrogels granulaires est présenté ici.

Quantification de la migration cellulaire tridimensionnelle à l’intérieur et dans les biomatériaux d’hydrogel granulaire

Découvrez une méthode quantitative pour étudier la migration cellulaire confinée dans des canaux microfabriqués en PDMS. Cette technique permet d'analyser les vitesses de déplacement de différents types cellulaires par microscopie.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

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