Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité cytotoxique des lymphocytes T CD huit spécifiques d'un antigène à l'aide d'un dosage par cytométrie en flux basé sur des cellules. Cette opération s'effectue tout d'abord en amplifiant les lymphocytes T CD huit effecteurs pendant six jours en présence du peptide d'intérêt. Dans une deuxième étape, les lymphocytes T CD quatre cibles sont incubés avec le peptide d'intérêt, puis mélangés avec des lymphocytes T CD quatre non marqués. Ensuite, les lymphocytes T CD huit effecteurs et les lymphocytes T CD quatre cibles sont mis en co-culture pendant six heures selon différents rapports effecteurs sur cibles.

Dans la dernière étape, la destruction des cellules T CD4 chargées en peptides et le nombre de cellules T CD8 effectrices sont quantifiés par cytométrie en flux. En fin de compte, la capacité intrinsèque de lyse des cellules T CD8 spécifiques de l'antigène, exprimée en unités lytiques, peut être calculée. Les principaux avantages de cette technique, semblable au test de libération d'acide aro, sont qu'elle utilise des cellules cibles primaires autologues au lieu de lignées cellulaires immortalisées et la cellule cible réelle.

Ces cellules et le nombre de cellules effectrices sont quantifiables au niveau de la cellule unique. Dès à présent, une assistante de recherche de mon laboratoire va démontrer la procédure permettant d'isoler les cellules effectrices positives pour le CD8. Commencez par décongeler les PBMC autologues cryoconservés dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius, puis lavez les cellules avec jusqu'à 50 millilitres de milieu complet.

Après le dénombrement, diluez les PBMC à une concentration de 5 millions de cellules par millilitre dans du milieu complet, puis ajoutez l'IL-2 et le peptide d'intérêt à la culture. Ensuite, ensemencez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Après trois jours de culture, remplacez la moitié du surnageant par du milieu complet frais. Après six jours de culture, utilisez une pipette multipuits pour transférer les cellules dans un réservoir stérile, puis dénombrez et lavez les cellules.

Resuspendre le culot à 50 millions de cellules par millilitre dans un tampon de séparation et incuber les PBMC dans un tube rond de 14 millilitres avec un cocktail d'enrichissement des lymphocytes T CD8 positifs humains à 50 microlitres par millilitre de cellules, à température ambiante. Après 10 minutes, incuber les cellules avec des particules magnétiques conjuguées à l'anticorps anti-CD8 IgG à 150 microlitres par millilitre pendant 5 minutes supplémentaires, puis ajuster le volume de la suspension cellulaire à 7 millilitres avec du tampon de séparation supplémentaire. Placer le tube dans l'aimant de séparation ; après 5 minutes, avec le tube toujours dans l'aimant, verser les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, marquer un petit aliquot des cellules avec des anticorps dirigés contre CD3 et CD8 dans du PBS enrichi avec 2 % de FBS pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Confirmez que la pureté des cellules est de 95 % CD8 positif ou supérieure par cytométrie en flux. Ajoutez maintenant 225 microlitres de milieu complet dans cinq tubes à vis, puis diluez les cellules de façon sériée de 1:2 à 1:32. Pour isoler les cellules cibles CD4 positifs, commencez par décongeler les PBMC autologues cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C.

Transférez les cellules décongelées dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu. Enrichissez les cellules T exprimant CD4 par séparation à l’aide de particules magnétiques, comme vient d’être démontré, en confirmant une pureté de 95 % ou plus des cellules T positives pour CD4 par cytométrie en flux. Après avoir dénombré les cellules, répartissez-les en deux tubes coniques de 15 millilitres, puis lavez-les dans du PBS tiède. Resuspendez les culots à raison de 20 millions de cellules par millilitre dans du PBS.

Après avoir assuré que les cellules sont protégées de la lumière, colorer une moitié des lymphocytes T CD4 positifs avec une solution de travail fraîchement préparée de CFSE à forte concentration, pour obtenir une concentration finale de 0,2 millimolaire, et l'autre moitié avec une solution de travail fraîchement préparée de CFSE à faible concentration, pour obtenir une concentration finale de 0,04 millimolaire, pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de CO2. À la fin de la période de marquage, centrifuger les cellules et resuspendre les culots dans un millilitre de milieu complet tiède afin de bloquer la réaction de marquage. Incuber les lymphocytes T CD4 positifs marqués avec la solution de CFSE faible en présence du peptide d'intérêt à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre dans le milieu complet, pendant 45 minutes dans l'incubateur de culture cellulaire.

Après l'incubation, lavez les deux populations de lymphocytes T, élevée et faible, du CFSC. Deux fois avec le milieu incomplet, puis resuspendez les deux suspensions cellulaires à 200 000 cellules par millilitre dans ce milieu incomplet. Ensuite, mélangez les deux populations cibles selon un rapport un pour un de CFSE élevé à CFSE faible.

Ajouter maintenant 100 microlitres du mélange de cellules T CD4 positif cibles dans chaque puits d'une plaque 96 puits à fond rond, puis ensemencer 1 microlitre de chaque suspension de cellules T CD8 positif en double pour un volume final de 200 microlitres par puits. Mesurer l'apoptose basale en ensemencant trois puits avec les cellules cibles seules, puis incuber la co-culture pendant six heures dans l'incubateur de culture cellulaire. Une fois l'incubation terminée, transférer les cellules dans une plaque VBO 96 puits et colorer chaque puits avec des tétramères peptidiques MHC conjugués à la PE pendant 15 minutes.

Dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules avec du PBS supplémenté en 2 % de FBS, puis étiquetez les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière après le lavage. Resuspendez à nouveau les culots dans 100 microlitres de 2 % de formaldéhyde dans du PBS et analysez les cellules par cytométrie en flux. Après la co-culture, les cellules sont analysées et sélectionnées selon les portes indiquées sur ces diagrammes en points.

Le rapport entre les cellules cibles viables CFSE élevées et CFSE faibles, non présentées ou chargées en peptide, est analysé à partir d’un petit histogramme croisé diffusion avant par rapport à la diffusion latérale. Les cellules vivantes sont sélectionnées en excluant les cellules mortes et en retenant les cellules T CD4 positives, puis sont représentées selon le marquage CFSE afin d’analyser le rapport entre cellules CFSE faibles et CFSE élevées. Ensuite, un fenêtre plus large est définie sur la diffusion avant et la diffusion latérale afin de dénombrer le nombre total de cellules effectrices et cibles, vivantes ou mortes. Après une incubation de six heures, les cellules T CD8 positives et tétramères positives, ainsi que les cellules T CD4 positives CFSE faibles, sont représentées pour analyser le rapport entre cellules effectrices et cellules cibles.

Le nombre total de cellules T effectrices CD8 positif est ensuite déterminé en faisant un tri sur les cellules positives au tétramère CD8 positif. Le nombre total de cellules cibles est déterminé en faisant un tri sur les cellules T CD4 positif, CFSE faible et les cellules positives et négatives au marqueur d'activité cellulaire. Le ratio cible entre les cellules CFSE faible et les cellules CFSE élevé est de un pour un.

Lorsque les cellules cibles positives pour CD quatre sont cultivées en l'absence de cellules effectrices, ce ratio diminue considérablement. Lorsque les cellules en pouls positives pour CFSE faible sont incubées avec la population totale de lymphocytes T positives pour CD huit contenant les lymphocytes T effecteurs spécifiques de l'antigène positifs pour CD huit.

Lorsque le ratio diminue, les cellules cibles marquées CFSE faible, CD4 positif, commencent à devenir positives au test de viabilité mort-vivant. La dilution des cellules effectrices entraîne alors une restauration du ratio CFSE et, en fin de compte, une restauration du nombre de cellules T cibles viables marquées par le peptide, CFSE faible, CD4 positif. Le pourcentage de lyse spécifique peut ensuite être représenté en fonction du ratio effecteurs sur cibles, sur une échelle logarithmique. Comme illustré sur le graphique, une régression linéaire est calculée à partir du tracé, et l'équation de la droite de tendance est utilisée pour déterminer les unités lytiques.

Il s'agit du nombre de lymphocytes T effecteurs CD8 positifs nécessaires pour tuer 30 % d'un million de cellules cibles T CD4 positifs, afin de déterminer la capacité cytolytique intrinsèque des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène, et de comparer les résultats entre donneurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la cytométrie pour mesurer l'activité cytotoxique des lymphocytes T CD spécifiques de l'antigène. Cette technique peut également être facilement adaptée à votre propre type de cellule F.