Name: Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Apprenez à mesurer l'activité cytotoxique des cellules T CD8+ spécifiques d'antigènes par cytométrie en flux. Cette méthode utilise des cellules cibles CD4+ primaires pour une évaluation physiologiquement pertinente de la cytolyse.

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1. Préparation des lymphocytes T CD8+ effecteurs
<ol>
	<li>Décongeler des PBMC autologues cryoconservés (2-3 flacons de 50 x 106 cellules) en transférant le cryoflacon de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Lavez les cellules en remplissant le tube à 50 ml avec du RPMI complet (4 mM de L-glutamine et 100 U/ml de pénicilline et de streptomycine, complétés par 10 % de FBS). Compter les PBMC et remettre les cellules en suspension à une concentration de 5 x 106/ml dans un RPMI complet.</li>
	<li>Ajouter un peptide spécifique (5 μg/ml) et de l’IL-2 (10 ng/ml) aux PBMC.</li>
	<li>Mise en place de la culture dans une plaque à 96 puits profonds ; semer 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits.</li>
	<li>Après 3 jours de culture, remplacez la moitié du milieu de culture cellulaire par du RPMI complet frais.</li>
	<li>Après 6 jours de culture, prélever tous les PBMC à l’aide d’une pipette multicanaux et transférer les cellules dans un réservoir stérile.</li>
	<li>Compter, laver et remettre en suspension les PBMC à raison de 5 x 107/ml dans le tampon de séparation recommandé dans des tubes à fond rond de 14 ml. Ajouter un cocktail d’enrichissement en lymphocytes T CD8+ humains à 50 μl/ml de cellules. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter des particules magnétiques à 150 μl/ml et incuber pendant 5 min.</li>
	<li>Porter la suspension cellulaire à 7 ml en ajoutant le tampon de séparation. Procédez à l’isolement immunomagnétique des lymphocytes T CD8+ non touchés en plaçant le tube dans l’aimant. Au bout de 5 min, avec le tube toujours dans l’aimant, versez les cellules d’intérêt dans un nouveau tube conique de 15 ml. Prenez une petite aliquote et colorez les cellules avec des anticorps contre CD3 et CD8 dans 1X PBS-2 % FBS pendant 30 min à 4 °C. La pureté des lymphocytes T CD8+ peut ensuite être mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de 95 % ou plus.</li>
	<li>Mettez en suspension les lymphocytes T CD8+ dans 450 μl avec RPMI complet.</li>
	<li>Ajoutez 225 μl de RPMI complet dans 5 tubes à bouchon à vis.</li>
	<li>Préparez des dilutions en série (de 1:2 à 1:32) en transférant 225 μl de CD8+ dans le tube suivant (voir figure 1, panneau supérieur).</li>
</ol>
2. Préparation des lymphocytes T CD4+ cibles
<ol>
	<li>Décongelez des PBMC autologues cryoconservés (1 flacon de 50 x 106 cellules) en transférant le cryoflacon de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de RPMI.</li>
	<li>Laver les cellules et remettre en suspension les PBMC à 5 x 107/ml avec tampon de séparation dans des tubes à fond rond de 14 ml. Ajouter un cocktail d’enrichissement en lymphocytes T CD4+ humains à 50 μl/ml de cellules. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter des particules magnétiques à 100 μl/ml et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Porter la suspension cellulaire à 7 ml en ajoutant un tampon de séparation. Procédez à l’isolement des lymphocytes T CD4+ en plaçant le tube dans l’aimant. Après 5 min, avec le tube toujours à l’intérieur de l’aimant, versez les cellules souhaitées dans un nouveau tube conique de 15 ml. Prenez une petite aliquote et colorez les cellules avec des anticorps contre CD3 et CD4 dans 1x PBS-2 % FBS pendant 30 min à 4 °C. La pureté des lymphocytes T CD4+ peut ensuite être mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de 95 % ou plus.</li>
	<li>Comptez les lymphocytes T CD4+, divisez-les en deux tubes coniques de 15 ml et lavez-les dans du PBS chaud 1x.</li>
	<li>Préparez une solution de travail de 0,4 μM CFSE dans du PBS chaud.</li>
	<li>Préparez une solution de travail à faible CFSE de 0,04 μM en diluant une partie de la solution de travail à 10x CFSE dans du PBS chaud.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension à raison de 20 x 106/ml de PBS (si le nombre de cellules T CD4+ est inférieur à 10 x 106/ml, remettre les cellules en suspension dans 0,5 ml de PBS) et colorer la moitié des cellules T CD4+ en ajoutant un volume égal de solution de travail à haute teneur en CFSE de 0,4 μM (concentration finale de 0,2 μM). Par exemple, pour 1 ml de cellules, ajoutez 1 ml de la solution de travail CFSE. Colorer la moitié restante du CD4+ en ajoutant un volume égal de solution de travail à faible teneur en CFSE de 0,04 μM (concentration finale de 0,02 μM). Cellules de coloration pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, les cellules de granulés à 1 500 tr/min pendant 5 min et les remettre en suspension dans 1 ml de RPMI complet chaud pour éteindre la réaction de marquage.</li>
	<li>Pulsez des lymphocytes T CD4+ à faible teneur en CFSE en ajoutant le peptide d’intérêt à une concentration finale de 5 μg/ml dans l’IPRP complet et incubez pendant 45 min dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
	<li>Lavez les lymphocytes T CD4+ à indice CFSE élevé et CFSE faible dans un RPMI complet. Répétez l’opération pour un total de deux lavages. Remettre en suspension à une concentration de 2 x 105 cellules/ml chacune dans un RPMI complet.</li>
	<li>Mélangez les deux populations cibles selon un rapport de 1:1 (CFSE-High :CFSE-Low) (voir la figure 1, panneau inférieur).</li>
</ol>
3. Coculture
<ol>
	<li>À partir de chaque dilution de lymphocytes T CD8+, ensemencer 100 μl en double dans une plaque à fond rond à 96 puits.</li>
	<li>Ajouter les lymphocytes T CD4+ cibles mixtes (100 μl) à chaque dilution de cellules effectrices pour un volume final de 200 μl.</li>
	<li>Pour mesurer l’apoptose basale, ensemencez 3 puits avec les cellules cibles seules.</li>
	<li>Incuber en coculture pendant 6 h dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
</ol>
4. Coloration et acquisition par cytométrie en flux
<ol>
	<li>Transférer les cellules sur une plaque à fond en V de 96 puits et les colorer avec des tétramères pMHC conjugués au PE pendant 15 min dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
	<li>Laver dans 1x PBS-2 % FBS et colorer les cellules avec les cellules mortes fixables Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Lavez les cellules une fois avec 1x PBS-2 % FBS et remettez-les en suspension dans 100 μl avec 2 % de formaldéhyde dans 1x PBS.</li>
	<li>Acquisition de cellules sur cytomètre en flux.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le dosage décrit ici permet de quantifier la fonction principale des lymphocytes T CD8+ : l’activité cytolytique. La mesure précise de cette fonction est d’une importance capitale pour caractériser les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+, car des études antérieures ont rapporté une discordance entre cette fonction et la sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène10,11. En raison de la courte durée d’incubation en coculture (6 heures) et de l’utilisation de cellules cibles a...

L’activité cytolytique est la fonction principale des lymphocytes T CD8+, mais elle est encore rarement mesurée, car les dosages utilisés à cette fin sont lourds et difficiles à normaliser. Une mesure précise de cette fonction est d’une importance primordiale pour caractériser les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+, car aucun prédicteur fiable de cytotoxicité efficace à médiation cellulaire n’a encore été décrit1,2. Ici, nous proposons un nouveau test fonctionnel pour mesurer l’activité cytotoxique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène sur les lymphocytes T CD4+ cibles. Plusieurs approches ont été développées pour fournir des alternatives à l’essai de référence de libération de chrome. Nous présentons ici un test basé sur les cellules qui révèle l’ensemble du processus de destruction en mesurant la mort de cellules cibles vivantes. Cette méthode a été dérivée de protocoles d’essais cytotoxiques basés sur la cytométrie en flux in vivo chez la souris4,5 et in vitro chez l’homme6. Dans ce protocole, les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène contenus dans la population totale de lymphocytes T CD8+ sont utilisés comme cellules effectrices et les lymphocytes T CD4+ autologues sont utilisés comme cellules cibles. Les lymphocytes T effecteurs CD8+ d’intérêt sont dénombrés à l’aide de tétramères MHCI/peptides7. La mort des cellules cibles est calculée par le rapport entre les lymphocytes T CD4+ chargés et les lymphocytes T CD4+ non chargés. Nous avons précédemment montré que cette méthode était reproductible, sensible, spécifique et ne dépendait pas du nombre de cellules effectrices dans la population totale de lymphocytes T CD8+8. En énumérant à la fois le nombre de cellules effectrices et de cellules cibles dans l’essai de coculture, la capacité intrinsèque des lymphocytes T CD8+ à tuer les cellules cibles peut être calculée et exprimée en unités lytiques9.

<table><tbody><tr><td>Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ humains EasySep</td><td>Cellules souches</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD8+ humains EasySep</td><td>Cellules souches</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>Kit de prolifération cellulaire CellTrace CFSE - Pour cytométrie en flux</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD cellules mortes fixables</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Souris anti-humaine CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anti-Human CD8 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100x Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin - Or, PAA inactivé par la chaleur</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits ; Traités; Fond en U ; avec couvercle</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml polystyrène stérile, réservoirs emballés individuellement</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 puits à fond en U, stérile 2 ml Plaques à puits profonds</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), qualité recherche</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, tampon de séparation</td><td>Cellule</td> <td>souche20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tube conique en polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Tube à fond rond, polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep</td><td>Aimant Cellule souche</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 puits ; Plaque à fond en V avec couvercle</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde, réactif ACS, 37 % en poids dans H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microtube à bouchon à vis, cône</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

L’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ est rarement évaluée. Nous décrivons ici un nouveau test cellulaire pour mesurer la capacité des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène à tuer les lymphocytes T CD4+ chargés de leur peptide apparenté. Les lymphocytes T CD4+ cibles sont divisés en deux populations, marquées avec deux concentrations différentes de CFSE. Une population est pulsée avec le peptide d’intérêt (CFSE-faible) tandis que l’autre reste non pulsée (CFSE-élevé). Les lymphocytes T CD4+ pulsés et non pulsés sont mélangés dans un rapport égal et incubés avec un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ purifiés. La destruction spécifique des lymphocytes T CD4+ cibles autologues est analysée par cytométrie en flux après coculture avec des lymphocytes T CD8+ contenant des lymphocytes T CD8+ effecteurs spécifiques de l’antigène détectés par coloration peptide/tétramère MHCI. La lyse spécifique des lymphocytes T CD4+ cibles, mesurée à différents rapports effecteurs/cibles, permet de calculer des unités lytiques, LU30/106 cellules. Ce test simple et direct permet de mesurer avec précision la capacité intrinsèque des lymphocytes T CD8+ à tuer les lymphocytes T CD4+ cibles.

Le schéma de la figure 1 résume le test. Des lymphocytes T CD8+ purifiés (cellules effectrices) ont été resuspendus dans 450 µl de RPMI complet et des dilutions sérielles ont été réalisées en ajoutant 225 µl de lymphocytes T CD8+ dans le tube suivant contenant 225 µl de milieu (panneau supérieur). Les lymphocytes T CD4+ purifiés (cellules cibles) ont été comptés, répartis en deux tubes et marqués avec deux concentrations différentes de CFSE (élevée et faible), comme décrit dans le protocole. Les lymphocy...

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité cytotoxique des lymphocytes T CD huit spécifiques d'un antigène à l'aide d'un dosage par cytométrie en flux basé sur des cellules. Cette opération s'effectue tout d'abord en amplifiant les lymphocytes T CD huit effecteurs pendant six jours en présence du peptide d'intérêt. Dans une deuxième étape, les lymphocytes T CD quatre cibles sont incubés avec le peptide d'intérêt, puis mélangés avec des lymphocytes T CD quatre non marqués. Ensuite, les lymphocytes T CD huit effecteurs et les lymphocytes T CD quatre cibles sont mis en co-culture pendant six heures selon différents rapports effecteurs sur cibles.Dans la dernière étape, la destruction des cellules T CD4 chargées en peptides et le nombre de cellules T CD8 effectrices sont quantifiés par cytométrie en flux. En fin de compte, la capacité intrinsèque de lyse des cellules T CD8 spécifiques de l'antigène, exprimée en unités lytiques, peut être calculée. Les principaux avantages de cette technique, semblable au test de libération d'acide aro, sont qu'elle utilise des cellules cibles primaires autologues au lieu de lignées cellulaires immortalisées et la cellule cible réelle.Ces cellules et le nombre de cellules effectrices sont quantifiables au niveau de la cellule unique. Dès à présent, une assistante de recherche de mon laboratoire va démontrer la procédure permettant d'isoler les cellules effectrices positives pour le CD8. Commencez par décongeler les PBMC autologues cryoconservés dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius, puis lavez les cellules avec jusqu'à 50 millilitres de milieu complet.Après le dénombrement, diluez les PBMC à une concentration de 5 millions de cellules par millilitre dans du milieu complet, puis ajoutez l'IL-2 et le peptide d'intérêt à la culture. Ensuite, ensemencez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Après trois jours de culture, remplacez la moitié du surnageant par du milieu complet frais. Après six jours de culture, utilisez une pipette multipuits pour transférer les cellules dans un réservoir stérile, puis dénombrez et lavez les cellules.Resuspendre le culot à 50 millions de cellules par millilitre dans un tampon de séparation et incuber les PBMC dans un tube rond de 14 millilitres avec un cocktail d'enrichissement des lymphocytes T CD8 positifs humains à 50 microlitres par millilitre de cellules, à température ambiante. Après 10 minutes, incuber les cellules avec des particules magnétiques conjuguées à l'anticorps anti-CD8 IgG à 150 microlitres par millilitre pendant 5 minutes supplémentaires, puis ajuster le volume de la suspension cellulaire à 7 millilitres avec du tampon de séparation supplémentaire. Placer le tube dans l'aimant de séparation ; après 5 minutes, avec le tube toujours dans l'aimant, verser les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, marquer un petit aliquot des cellules avec des anticorps dirigés contre CD3 et CD8 dans du PBS enrichi avec 2 % de FBS pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Confirmez que la pureté des cellules est de 95 % CD8 positif ou supérieure par cytométrie en flux. Ajoutez maintenant 225 microlitres de milieu complet dans cinq tubes à vis, puis diluez les cellules de façon sériée de 1:2 à 1:32. Pour isoler les cellules cibles CD4 positifs, commencez par décongeler les PBMC autologues cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C.Transférez les cellules décongelées dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu. Enrichissez les cellules T exprimant CD4 par séparation à l’aide de particules magnétiques, comme vient d’être démontré, en confirmant une pureté de 95 % ou plus des cellules T positives pour CD4 par cytométrie en flux. Après avoir dénombré les cellules, répartissez-les en deux tubes coniques de 15 millilitres, puis lavez-les dans du PBS tiède. Resuspendez les culots à raison de 20 millions de cellules par millilitre dans du PBS.Après avoir assuré que les cellules sont protégées de la lumière, colorer une moitié des lymphocytes T CD4 positifs avec une solution de travail fraîchement préparée de CFSE à forte concentration, pour obtenir une concentration finale de 0,2 millimolaire, et l'autre moitié avec une solution de travail fraîchement préparée de CFSE à faible concentration, pour obtenir une concentration finale de 0,04 millimolaire, pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de CO2. À la fin de la période de marquage, centrifuger les cellules et resuspendre les culots dans un millilitre de milieu complet tiède afin de bloquer la réaction de marquage. Incuber les lymphocytes T CD4 positifs marqués avec la solution de CFSE faible en présence du peptide d'intérêt à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre dans le milieu complet, pendant 45 minutes dans l'incubateur de culture cellulaire.Après l'incubation, lavez les deux populations de lymphocytes T, élevée et faible, du CFSC. Deux fois avec le milieu incomplet, puis resuspendez les deux suspensions cellulaires à 200 000 cellules par millilitre dans ce milieu incomplet. Ensuite, mélangez les deux populations cibles selon un rapport un pour un de CFSE élevé à CFSE faible.Ajouter maintenant 100 microlitres du mélange de cellules T CD4 positif cibles dans chaque puits d'une plaque 96 puits à fond rond, puis ensemencer 1 microlitre de chaque suspension de cellules T CD8 positif en double pour un volume final de 200 microlitres par puits. Mesurer l'apoptose basale en ensemencant trois puits avec les cellules cibles seules, puis incuber la co-culture pendant six heures dans l'incubateur de culture cellulaire. Une fois l'incubation terminée, transférer les cellules dans une plaque VBO 96 puits et colorer chaque puits avec des tétramères peptidiques MHC conjugués à la PE pendant 15 minutes.Dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules avec du PBS supplémenté en 2 % de FBS, puis étiquetez les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière après le lavage. Resuspendez à nouveau les culots dans 100 microlitres de 2 % de formaldéhyde dans du PBS et analysez les cellules par cytométrie en flux. Après la co-culture, les cellules sont analysées et sélectionnées selon les portes indiquées sur ces diagrammes en points.Le rapport entre les cellules cibles viables CFSE élevées et CFSE faibles, non présentées ou chargées en peptide, est analysé à partir d’un petit histogramme croisé diffusion avant par rapport à la diffusion latérale. Les cellules vivantes sont sélectionnées en excluant les cellules mortes et en retenant les cellules T CD4 positives, puis sont représentées selon le marquage CFSE afin d’analyser le rapport entre cellules CFSE faibles et CFSE élevées. Ensuite, un fenêtre plus large est définie sur la diffusion avant et la diffusion latérale afin de dénombrer le nombre total de cellules effectrices et cibles, vivantes ou mortes. Après une incubation de six heures, les cellules T CD8 positives et tétramères positives, ainsi que les cellules T CD4 positives CFSE faibles, sont représentées pour analyser le rapport entre cellules effectrices et cellules cibles.Le nombre total de cellules T effectrices CD8 positif est ensuite déterminé en faisant un tri sur les cellules positives au tétramère CD8 positif. Le nombre total de cellules cibles est déterminé en faisant un tri sur les cellules T CD4 positif, CFSE faible et les cellules positives et négatives au marqueur d'activité cellulaire. Le ratio cible entre les cellules CFSE faible et les cellules CFSE élevé est de un pour un.Lorsque les cellules cibles positives pour CD quatre sont cultivées en l'absence de cellules effectrices, ce ratio diminue considérablement. Lorsque les cellules en pouls positives pour CFSE faible sont incubées avec la population totale de lymphocytes T positives pour CD huit contenant les lymphocytes T effecteurs spécifiques de l'antigène positifs pour CD huit.Lorsque le ratio diminue, les cellules cibles marquées CFSE faible, CD4 positif, commencent à devenir positives au test de viabilité mort-vivant. La dilution des cellules effectrices entraîne alors une restauration du ratio CFSE et, en fin de compte, une restauration du nombre de cellules T cibles viables marquées par le peptide, CFSE faible, CD4 positif. Le pourcentage de lyse spécifique peut ensuite être représenté en fonction du ratio effecteurs sur cibles, sur une échelle logarithmique. Comme illustré sur le graphique, une régression linéaire est calculée à partir du tracé, et l'équation de la droite de tendance est utilisée pour déterminer les unités lytiques.Il s'agit du nombre de lymphocytes T effecteurs CD8 positifs nécessaires pour tuer 30 % d'un million de cellules cibles T CD4 positifs, afin de déterminer la capacité cytolytique intrinsèque des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l'antigène, et de comparer les résultats entre donneurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la cytométrie pour mesurer l'activité cytotoxique des lymphocytes T CD spécifiques de l'antigène. Cette technique peut également être facilement adaptée à votre propre type de cellule F.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Assay de cytométrie en flux basé sur les cellules pour mesurer l'activité cytotoxique

Cette vidéo présente une technique in vitro pour mesurer la capacité cytotoxique des cellules tueuses induites par les cytokines (CIK) contre les cellules cancéreuses. Lors de la co-culture de cellules cancéreuses cibles avec des cellules CIK, les cellules cancéreuses mortes sont identifiées à l’aide d’un colorant de viabilité fluorescent et sont quantifiées à l’aide de la cytométrie en flux, estimant l’effet cytotoxique des cellules CIK.

Un test in vitro pour étudier la capacité cytotoxique des cellules tueuses induites par les cytokines

Cette vidéo démontre l’activité lytique des cellules tueuses naturelles contre les cellules cibles colorées par fluorescence. La méthode permet de mesurer la cytotoxicité induite par les cellules NK en colorant les cellules mortes et en utilisant un cytomètre en flux pour quantifier les cellules cibles vivantes et mortes.

Préparation d’un échantillon pour un test de cytotoxicité à médiation cellulaire tueuse naturelle pour l’analyse cytométrique en flux

Cette vidéo présente un test d’apoptose dans des cellules cancéreuses induit par des cellules T effectrices pré-activées. En co-cultivant ces cellules avec des cellules cancéreuses marquées par des noyaux fluorescents, un substrat fluorogénique clivable par caspase est ajouté. Les cellules cancéreuses apoptotiques afficheront une couleur différente dans leur noyau, conduisant à une double fluorescence. Cette double fluorescence est révélatrice de cellules cancéreuses en apoptose.

Un test in vitro pour l’étude de la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+ préactivés contre les cellules cancéreuses

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

L'ensemble du test de cytotoxicité de sang (WCA) est un test de cytotoxicité au point en incorporant la technologie de positionnement cellulaire à haut débit à la microscopie par fluorescence et un traitement d'image automatique. Ici, nous décrivons comment les cellules de lymphomes traitées avec un anticorps anti-CD20 peuvent être analysés en temps réel dans le sang total humain pour fournir une analyse quantitative de la cytotoxicité cellulaire.

En temps réel cytotoxicité dans le sang total humain

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Ce travail décrit un flux de travail avancé pour la détermination précise et rapide du nombre de cellules NK (Natural Killer) et de la cytotoxicité des cellules NK dans des échantillons de sang humain.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Ce protocole fournit un flux de travail standardisé in vitro. pour une mesure cohérente de la cytotoxicité naturelle, médiée par les récepteurs antigéniques chimériques et dépendante des anticorps des cellules humaines naturelles tueuses grâce à l’imagerie des cellules vivantes et à la cytométrie en flux.

Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Apprenez à mesurer l'activité cytotoxique des cellules T CD8+ spécifiques d'antigènes par cytométrie en flux. Cette méthode utilise des cellules cibles CD4+ primaires pour une évaluation physiologiquement pertinente de la cytolyse.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

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