Name: Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Apprenez à mesurer l'activité cytotoxique des cellules T CD8+ spécifiques d'antigènes par cytométrie en flux. Cette méthode utilise des cellules cibles CD4+ primaires pour une évaluation physiologiquement pertinente de la cytolyse.

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1. Préparation des lymphocytes T CD8+ effecteurs
<ol>
	<li>Décongeler des PBMC autologues cryoconservés (2-3 flacons de 50 x 106 cellules) en transférant le cryoflacon de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Lavez les cellules en remplissant le tube à 50 ml avec du RPMI complet (4 mM de L-glutamine et 100 U/ml de pénicilline et de streptomycine, complétés par 10 % de FBS). Compter les PBMC et remettre les cellules en suspension à une concentration de 5 x 106/ml dans un RPMI complet.</li>
	<li>Ajouter un peptide spécifique (5 μg/ml) et de l’IL-2 (10 ng/ml) aux PBMC.</li>
	<li>Mise en place de la culture dans une plaque à 96 puits profonds ; semer 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits.</li>
	<li>Après 3 jours de culture, remplacez la moitié du milieu de culture cellulaire par du RPMI complet frais.</li>
	<li>Après 6 jours de culture, prélever tous les PBMC à l’aide d’une pipette multicanaux et transférer les cellules dans un réservoir stérile.</li>
	<li>Compter, laver et remettre en suspension les PBMC à raison de 5 x 107/ml dans le tampon de séparation recommandé dans des tubes à fond rond de 14 ml. Ajouter un cocktail d’enrichissement en lymphocytes T CD8+ humains à 50 μl/ml de cellules. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter des particules magnétiques à 150 μl/ml et incuber pendant 5 min.</li>
	<li>Porter la suspension cellulaire à 7 ml en ajoutant le tampon de séparation. Procédez à l’isolement immunomagnétique des lymphocytes T CD8+ non touchés en plaçant le tube dans l’aimant. Au bout de 5 min, avec le tube toujours dans l’aimant, versez les cellules d’intérêt dans un nouveau tube conique de 15 ml. Prenez une petite aliquote et colorez les cellules avec des anticorps contre CD3 et CD8 dans 1X PBS-2 % FBS pendant 30 min à 4 °C. La pureté des lymphocytes T CD8+ peut ensuite être mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de 95 % ou plus.</li>
	<li>Mettez en suspension les lymphocytes T CD8+ dans 450 μl avec RPMI complet.</li>
	<li>Ajoutez 225 μl de RPMI complet dans 5 tubes à bouchon à vis.</li>
	<li>Préparez des dilutions en série (de 1:2 à 1:32) en transférant 225 μl de CD8+ dans le tube suivant (voir figure 1, panneau supérieur).</li>
</ol>
2. Préparation des lymphocytes T CD4+ cibles
<ol>
	<li>Décongelez des PBMC autologues cryoconservés (1 flacon de 50 x 106 cellules) en transférant le cryoflacon de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de RPMI.</li>
	<li>Laver les cellules et remettre en suspension les PBMC à 5 x 107/ml avec tampon de séparation dans des tubes à fond rond de 14 ml. Ajouter un cocktail d’enrichissement en lymphocytes T CD4+ humains à 50 μl/ml de cellules. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter des particules magnétiques à 100 μl/ml et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Porter la suspension cellulaire à 7 ml en ajoutant un tampon de séparation. Procédez à l’isolement des lymphocytes T CD4+ en plaçant le tube dans l’aimant. Après 5 min, avec le tube toujours à l’intérieur de l’aimant, versez les cellules souhaitées dans un nouveau tube conique de 15 ml. Prenez une petite aliquote et colorez les cellules avec des anticorps contre CD3 et CD4 dans 1x PBS-2 % FBS pendant 30 min à 4 °C. La pureté des lymphocytes T CD4+ peut ensuite être mesurée par cytométrie en flux avec une pureté attendue de 95 % ou plus.</li>
	<li>Comptez les lymphocytes T CD4+, divisez-les en deux tubes coniques de 15 ml et lavez-les dans du PBS chaud 1x.</li>
	<li>Préparez une solution de travail de 0,4 μM CFSE dans du PBS chaud.</li>
	<li>Préparez une solution de travail à faible CFSE de 0,04 μM en diluant une partie de la solution de travail à 10x CFSE dans du PBS chaud.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension à raison de 20 x 106/ml de PBS (si le nombre de cellules T CD4+ est inférieur à 10 x 106/ml, remettre les cellules en suspension dans 0,5 ml de PBS) et colorer la moitié des cellules T CD4+ en ajoutant un volume égal de solution de travail à haute teneur en CFSE de 0,4 μM (concentration finale de 0,2 μM). Par exemple, pour 1 ml de cellules, ajoutez 1 ml de la solution de travail CFSE. Colorer la moitié restante du CD4+ en ajoutant un volume égal de solution de travail à faible teneur en CFSE de 0,04 μM (concentration finale de 0,02 μM). Cellules de coloration pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, les cellules de granulés à 1 500 tr/min pendant 5 min et les remettre en suspension dans 1 ml de RPMI complet chaud pour éteindre la réaction de marquage.</li>
	<li>Pulsez des lymphocytes T CD4+ à faible teneur en CFSE en ajoutant le peptide d’intérêt à une concentration finale de 5 μg/ml dans l’IPRP complet et incubez pendant 45 min dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
	<li>Lavez les lymphocytes T CD4+ à indice CFSE élevé et CFSE faible dans un RPMI complet. Répétez l’opération pour un total de deux lavages. Remettre en suspension à une concentration de 2 x 105 cellules/ml chacune dans un RPMI complet.</li>
	<li>Mélangez les deux populations cibles selon un rapport de 1:1 (CFSE-High :CFSE-Low) (voir la figure 1, panneau inférieur).</li>
</ol>
3. Coculture
<ol>
	<li>À partir de chaque dilution de lymphocytes T CD8+, ensemencer 100 μl en double dans une plaque à fond rond à 96 puits.</li>
	<li>Ajouter les lymphocytes T CD4+ cibles mixtes (100 μl) à chaque dilution de cellules effectrices pour un volume final de 200 μl.</li>
	<li>Pour mesurer l’apoptose basale, ensemencez 3 puits avec les cellules cibles seules.</li>
	<li>Incuber en coculture pendant 6 h dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
</ol>
4. Coloration et acquisition par cytométrie en flux
<ol>
	<li>Transférer les cellules sur une plaque à fond en V de 96 puits et les colorer avec des tétramères pMHC conjugués au PE pendant 15 min dans une atmosphère à 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
	<li>Laver dans 1x PBS-2 % FBS et colorer les cellules avec les cellules mortes fixables Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Lavez les cellules une fois avec 1x PBS-2 % FBS et remettez-les en suspension dans 100 μl avec 2 % de formaldéhyde dans 1x PBS.</li>
	<li>Acquisition de cellules sur cytomètre en flux.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le dosage décrit ici permet de quantifier la fonction principale des lymphocytes T CD8+ : l’activité cytolytique. La mesure précise de cette fonction est d’une importance capitale pour caractériser les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+, car des études antérieures ont rapporté une discordance entre cette fonction et la sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène10,11. En raison de la courte durée d’incubation en coculture (6 heures) et de l’utilisation de cellules cibles a...

L’activité cytolytique est la fonction principale des lymphocytes T CD8+, mais elle est encore rarement mesurée, car les dosages utilisés à cette fin sont lourds et difficiles à normaliser. Une mesure précise de cette fonction est d’une importance primordiale pour caractériser les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+, car aucun prédicteur fiable de cytotoxicité efficace à médiation cellulaire n’a encore été décrit1,2. Ici, nous proposons un nouveau test fonctionnel pour mesurer l’activité cytotoxique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène sur les lymphocytes T CD4+ cibles. Plusieurs approches ont été développées pour fournir des alternatives à l’essai de référence de libération de chrome. Nous présentons ici un test basé sur les cellules qui révèle l’ensemble du processus de destruction en mesurant la mort de cellules cibles vivantes. Cette méthode a été dérivée de protocoles d’essais cytotoxiques basés sur la cytométrie en flux in vivo chez la souris4,5 et in vitro chez l’homme6. Dans ce protocole, les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène contenus dans la population totale de lymphocytes T CD8+ sont utilisés comme cellules effectrices et les lymphocytes T CD4+ autologues sont utilisés comme cellules cibles. Les lymphocytes T effecteurs CD8+ d’intérêt sont dénombrés à l’aide de tétramères MHCI/peptides7. La mort des cellules cibles est calculée par le rapport entre les lymphocytes T CD4+ chargés et les lymphocytes T CD4+ non chargés. Nous avons précédemment montré que cette méthode était reproductible, sensible, spécifique et ne dépendait pas du nombre de cellules effectrices dans la population totale de lymphocytes T CD8+8. En énumérant à la fois le nombre de cellules effectrices et de cellules cibles dans l’essai de coculture, la capacité intrinsèque des lymphocytes T CD8+ à tuer les cellules cibles peut être calculée et exprimée en unités lytiques9.

<table><tbody><tr><td>Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD4+ humains EasySep</td><td>Cellules souches</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’enrichissement des lymphocytes T CD8+ humains EasySep</td><td>Cellules souches</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>Kit de prolifération cellulaire CellTrace CFSE - Pour cytométrie en flux</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD cellules mortes fixables</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Souris anti-humaine CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anti-Human CD8 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100x Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin - Or, PAA inactivé par la chaleur</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits ; Traités; Fond en U ; avec couvercle</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml polystyrène stérile, réservoirs emballés individuellement</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 puits à fond en U, stérile 2 ml Plaques à puits profonds</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), qualité recherche</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, tampon de séparation</td><td>Cellule</td> <td>souche20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tube conique en polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Tube à fond rond, polypropylène</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep</td><td>Aimant Cellule souche</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 puits ; Plaque à fond en V avec couvercle</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde, réactif ACS, 37 % en poids dans H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microtube à bouchon à vis, cône</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

L’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ est rarement évaluée. Nous décrivons ici un nouveau test cellulaire pour mesurer la capacité des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène à tuer les lymphocytes T CD4+ chargés de leur peptide apparenté. Les lymphocytes T CD4+ cibles sont divisés en deux populations, marquées avec deux concentrations différentes de CFSE. Une population est pulsée avec le peptide d’intérêt (CFSE-faible) tandis que l’autre reste non pulsée (CFSE-élevé). Les lymphocytes T CD4+ pulsés et non pulsés sont mélangés dans un rapport égal et incubés avec un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ purifiés. La destruction spécifique des lymphocytes T CD4+ cibles autologues est analysée par cytométrie en flux après coculture avec des lymphocytes T CD8+ contenant des lymphocytes T CD8+ effecteurs spécifiques de l’antigène détectés par coloration peptide/tétramère MHCI. La lyse spécifique des lymphocytes T CD4+ cibles, mesurée à différents rapports effecteurs/cibles, permet de calculer des unités lytiques, LU30/106 cellules. Ce test simple et direct permet de mesurer avec précision la capacité intrinsèque des lymphocytes T CD8+ à tuer les lymphocytes T CD4+ cibles.

Le schéma de la figure 1 résume le test. Des lymphocytes T CD8+ purifiés (cellules effectrices) ont été resuspendus dans 450 µl de RPMI complet et des dilutions sérielles ont été réalisées en ajoutant 225 µl de lymphocytes T CD8+ dans le tube suivant contenant 225 µl de milieu (panneau supérieur). Les lymphocytes T CD4+ purifiés (cellules cibles) ont été comptés, répartis en deux tubes et marqués avec deux concentrations différentes de CFSE (élevée et faible), comme décrit dans le protocole. Les lymphocy...

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité cytotoxique des lymphocytes T CD huit spécifiques d'un antigène à l'aide d'un dosage par cytométrie en flux basé sur des cellules. Cette opération s'effectue tout d'abord en amplifiant les lymphocytes T CD huit effecteurs pendant six jours en présence du peptide d'intérêt. Dans une deuxième étape, les lymphocytes T CD quatre cibles sont incubés avec le peptide d'intérêt, puis mélangés avec des lymphocytes T CD quatre non marqués. Ensuite, les lymphocytes T CD huit effecteurs et les lymphocytes T CD quatre cibles sont mis en co-culture pendant six heures selon différents rapports effecteurs sur cibles.Dans la dernière étape, la destruction des cellules T CD4 chargées en peptides et le nombre de cellules T CD8 effectrices sont quantifiés par cytométrie en flux. En fin de compte, la capacité intrinsèque de lyse des cellules T CD8 spécifiques de l'antigène, exprimée en unités lytiques, peut être calculée. Les principaux avantages de cette technique, semblable au test de libération d'acide aro, sont qu'elle utilise des cellules cibles primaires autologues au lieu de lignées cellulaires immortalisées et la cellule cible réel

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