Name: Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Découvrez l'imagerie de la réparation membranaire cellulaire par marquage fluorescent et suivi des lysosomes impliqués dans l'exocytose. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de cicatrisation des blessures cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé Subventions AR055686 et AR060836 et bourse de recherche postdoctorale à l&#39;AD par l&#39;Association française contre les myopathies (AFM). Le centre d&#39;imagerie cellulaire utilisé dans cette étude est soutenue par les Instituts nationaux de la santé Subventions HD040677.

Une. Membrane d&#39;imagerie cellulaire de réparation Utilisation en vrac (perles de verre) Blessant Ce protocole permet le marquage séparément les cellules blessées et celles qui ne parviennent pas à guérir. La quantification de ces populations de cellules nécessite l&#39;utilisation de trois conditions: 1. Test (C1) - Les cellules sont autorisés à réparer en présence de Ca 2 +, 2. Contrôle 1 (pas de lésion C2) - Les cellules sont incubées en présence de Ca 2 +, mais pas blessés, et 3. Control 2 (pas de C3 de réparation) - cellules sont autorisés à réparer en l&#39;absence de Ca 2 +. <ol><li> À cultiver des cellules&gt; 50% de confluence sur des lamelles couvre trois stériles et laver C1 et C2 deux fois avec du CIM à 37 ° C et C3 avec du PBS à 37 ° C et de transfert sur des lamelles couvre-joints toriques silicone. </li><li> Ajouter 100 ul de solution de dextrane FITC préchauffé dans CIM sur C1 et C2 ou en C3 à PBS. </li><li> Blesser membrane plasmique sur C1 et C3 par de douces perles 40 mg de verre sur la lamelle à la température ambiante par des lamelles inclinables manuellement en arrière et6-8 fois de suite à un angle de 30 °. Remarque: Pour des blessures légères, assurent les perles de verre sont réparties de manière uniforme, minimisant ainsi les blessures répétées. Pour améliorer la reproductibilité de blessures entre les échantillons, effectuer simultanément la blessure de perles de verre de différents échantillons à comparer. </li><li> Éviter de nouvelles roulement de billes, de transférer tous les lamelles à un incubateur à 37 ° C à CO 2 ambiant et permet la réparation de procéder pendant 5 min. </li><li> Sans laisser les billes roulent, retirer les billes de verre et de dextrane FITC par lavage avec de CIM (C1 et C2) ou du PBS (C3) à 37 ° C. </li><li> Lieu lamelles couvre-retour sur le joint torique et ajouter 100 ul de solution fixable TRITC de dextran lysine préchauffé à CIM sur C1 et C2 ou en C3 sur PBS. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 5 min à température ambiante CO 2. </li><li> Laver deux fois avec des lamelles préchauffé CIM et fixer avec 4% de PFA pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver deux fois avec du PBS et incuber pendant 2 min à température ambiante dans le colorant Hoechst. </li><li> Laver samples deux fois avec du PBS, monter sur une lame en utilisant un milieu de montage et de cellules d&#39;image en utilisant un microscope à épifluorescence. </li><li> Utiliser des cellules de C2 pour déterminer le fond rouge et vert intensité de la coloration et utiliser cette valeur pour les seuils des canaux rouge et vert pour tous les échantillons (C1-C3). </li><li> Score nombre total de cellules qui sont a) vert (blessé et réparé) et b) rouge ou le rouge et le vert (blessé, mais n&#39;ont pas réussi à réparer) dans les échantillons C1 et C3. </li><li> Comte&gt; 100 cellules de verts pour chaque condition et exprimer la fraction de cellules qui n&#39;ont pas de réparer un pour cent de toutes les cellules blessés (vert et rouge). </li></ol> 2. Imagerie en direct de la cinétique de membrane cellulaire après réparation laser blessures <ol><li> Laver les cellules avec préchauffé CIM et puis mettre la lamelle en CIM avec des colorants FM. </li><li> Placez la lamelle dans un support dans l&#39;incubateur de haut en scène maintenu à 37 ° C. </li><li> Sélectionner une région 2 de 2.1 mm de la membrane cellulaire, et pour irradier &lt;; À 10 ms avec le laser pulsé. Atténuer la puissance du laser par l&#39;intermédiaire du logiciel de 40 à 50% de la puissance de crête. Puissance optimale permet blessure cohérente, mais non mortelle et ce doit être déterminée par essai et erreur pour chaque ligne de chaque instrument et de la cellule utilisé. </li><li> Pour surveiller la réparation, l&#39;image toutes les 10 secondes en épifluorescence et clair, à partir avant l&#39;accident et se poursuivre pendant 3-5 min après une blessure. Remarque: Pour aucun contrôle de la réparation, répétez les étapes 2.1-2.4 avec les cellules blessées dans du PBS contenant un colorant FM. </li><li> Pour quantifier la cinétique de réparation, de mesurer FM cellulaire colorant fluorescence et tracer la variation de l&#39;intensité (ΔF/F0) au cours de l&#39;imagerie. Ces données devraient être en moyenne de plus de 10 cellules dans chaque état et tracée en moyenne ou la valeur de cellule individuelle, selon les besoins. </li></ol> 3. Imagerie vrac (perles de verre) lésion induite lysosomales exocytose Les échantillons comprennent des cellules cultivées suivantes à&gt; 50%confluence: 1. Test (C1) - Les cellules ont permis de réparer en présence de Ca 2 +, 2. Contrôle 1 (C2; Aucune blessure) - Cellules ni blessés ni incubées avec l&#39;anticorps primaire, et 3. Control 2 (C3; Aucune réparation) - Les cellules ont permis de réparer en l&#39;absence de Ca 2 +. <ol><li> Lavage des lamelles couvre-C1 et C2 deux fois avec de l&#39;ICM à 37 ° C et C3 avec du PBS à 37 ° C et de les transférer sur le silicone des joints toriques. </li><li> Ajouter 100 pi de préchauffée lysine fixable dextran TRITC dans CIM sur C1 et C2 et C3 sur PBS. </li><li> Blesser membrane plasmique sur C1 et C3 comme dans l&#39;étape 1.3. </li><li> Éviter de nouvelles roulement de billes, de transférer tous les lamelles à un incubateur à 37 ° C à CO 2 ambiant et permet la réparation de procéder pendant 5 min. </li><li> Retirer les perles de verre et TRITC dextrane en lavant les lamelles dans du milieu de croissance à froid, en assurant de nouveau pas de roulement des billes de verre sur les cellules. </li><li> Rincer les lamelles couvre-objet deux fois avec du milieu de croissance à froid et à transférer les joints toriques. </li><li> À C1 et C3, Ajouter 100 ul de l&#39;anticorps anti LAMPE1 de souris de rat dans un milieu de croissance complet à froid et ajouter le milieu de culture froid, complète à C2. </li><li> Pour permettre la liaison d&#39;anticorps lamelles incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Lavez les lamelles à trois reprises avec CIM froid et fixer tous les lamelles de 4% PFA pendant 10 min à température ambiante, puis rincez 3x avec la CIM. </li><li> Incuber les lamelles couvre-objet dans 100 ul de solution de blocage pendant 15 min à température ambiante </li><li> Incuber les lamelles couvre-objet dans 100 ul de Alexa Fluor 488 anticorps de rat anti pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Laver deux fois avec du PBS et incuber pendant 2 minutes à température ambiante dans Hoechst. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS, monter sur une lame en utilisant un milieu de montage et de l&#39;image en utilisant un microscope à épifluorescence. </li><li> En utilisant des images de cellules C2, déterminer le fond non spécifique coloration dans le rouge (TRITC dextran) et vert (Alexa Fluor 488 anticorps) canaux et utiliser ces valeurs de coloration de fond à seuil, les canaux rouge et vert pour tous les échantillons (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Utilisez les&gt; 100 rouge marqué cellules de C1 et C3 pour mesurer l&#39;intensité de la coloration LAMP1 (vert) dans les cellules lésées. Pour une expérience réussie de la coloration LAMPE1 dans les cellules de C3 sera nettement inférieur à celui des cellules de C1. </li></ol> 4. Imagerie en direct de membrane cellulaire blessures déclenché traite subcellulaire <ol><li> Fluorescence étiqueter le compartiment d&#39;intérêt par transfection journaliste approprié (par exemple CD63-GFP pour lysosomes 8) ou en utilisant des colorants fluorescents 9. </li><li> Pour lysosomes d&#39;étiquetage avec un colorant fluorescent, incuber les cellules cultivées à 50% de confluence dans un milieu de croissance contenant FITC-dextran </li><li> Laisser dextrane à être endocytosée pendant 2 heures (ou plus longtemps que nécessaire pour le marquage de l&#39;endosome suffisante avec du dextrane par la lignée cellulaire d&#39;intérêt) dans l&#39;incubateur à CO 2. </li><li> Laver les cellules avec les médias de croissance préchauffées et incuber en elle pendant 2 heures dans un incubateur à CO2 pour permettre à tousendocytose dextrane à s&#39;accumuler dans le lysosome. </li><li> Avant imagerie, rincer la lamelle en préchauffé CIM et monter dans un porte-lamelle sur le dessus de la scène incubateur à 37 ° C. </li><li> Effectuer champ large (pour le mouvement tout au long de la cellule) ou FRBR (mouvement à la surface cellulaire et l&#39;exocytose) Imagerie - cellules qui n&#39;ont pas bondés FITC dextran lysosomes étiquetés sont idéales pour l&#39;imagerie du mouvement et l&#39;exocytose de lysosomes individuels. </li><li> Alignement des lasers de la FRBR pour l&#39;imagerie microscope: Utilisez 60X ou 100X avec objectif&gt; 1,45 NA. Mettre en place l&#39;angle de l&#39;incident FRBR faisceau laser en utilisant l&#39;approche du fabricant. </li><li> Blesser la membrane cellulaire par irradiation d&#39;une région de petite taille (1 à 2 mm 2) pour &lt;100 msec, avec le laser pulsé à 40 à 50% d&#39;atténuation. </li><li> Pour surveiller la réponse de lysosome de la cellule blessures, les cellules d&#39;image à 4-6 images / sec pendant au moins 2 minutes ou plus en fonction de la dynamique de l&#39;exocytose dans les cellules d&#39;intérêt. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
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<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
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<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

lésion de la membrane cellulaire in vivo se produit en raison d&#39;une variété de facteurs de stress physiologiques et plusieurs approches expérimentales ont été mises au point pour imiter ceux-ci. Il s&#39;agit notamment de blesser la membrane cellulaire des cellules adhérentes en les grattant le plat ou par passage à travers un étroit 9,10 alésage de la seringue. A la suite de telles blessures guérissent les cellules en suspension et pas adhéré à la matrice extracellulaire comme ils le font normal...

Membrane cellulaire maintient l&#39;intégrité des cellules en formant une barrière entre la cellule et le milieu extracellulaire. Un stimulus chimique, électrique, mécanique ou qui dépasse le seuil physiologique normal ainsi que la présence d&#39;agents pathogènes envahissants peut chaque résultat des blessures à la membrane de la cellule et de déclencher une réponse cellulaire à la suite de la réparation de ce préjudice. Pour survivre ces blessures à la membrane cellulaire, les cellules possèdent un mécanisme efficace pour la réparation. Ce mécanisme est dépendante du calcium et implique le trafic intracellulaire des protéines telles que des annexines et MG53, entre autres, ainsi que des compartiments subcellulaires tels que des endosomes, les lysosomes, l&#39;appareil de Golgi et des vésicules dérivées des mitochondries vers la membrane cellulaire lésé 1-7. Toutefois, les détails de la séquence d&#39;événements moléculaires et sous-cellulaires impliqués dans la réparation de la membrane cellulaire endommagée reste mal comprise. La réponse de réparation de la cellule peuvent être séparés dans l&#39;oreillement et les réponses tardives. Les premières réponses, qui se produisent en quelques secondes à l&#39;échelle minutes de temps, sont extrêmement important dans la détermination de la nature des réponses tardives menant à la réparation cellulaire succès ou la mort cellulaire. point final des analyses basées sur l&#39;analyse biochimique et cellulaire vrac ont permis d&#39;établir l&#39;implication des processus moléculaires et cellulaires de réparation. Mais, en raison de l&#39;hétérogénéité et de la rapidité de la réponse de la réparation cellulaire, point final des essais ne parviennent pas à fournir les détails cinétiques et spatiales de la séquence des événements menant à réparer. Les approches qui permettent blessure contrôlée de la membrane cellulaire et permettent le suivi de la réparation de la membrane cellulaire et subcellulaire des réponses associées à une résolution spatiale et temporelle sont idéales pour de telles études. Ici, ces approches ont été présentées. Deux des protocoles décrivent des approches pour contrôler les cinétiques réelles de temps de la réparation des membranes cellulaires et sous-cellulaires des réponses associées au processus de réparation dans les cellules vivantes suivants inj laserUry. En complément de ces analyses basées imagerie des cellules vivantes, le point de fin des essais ont également été décrits qui fournissent une mesure basée sur la population pour la réparation de suivi de cellules individuelles et les réponses des sous-cellulaires associées. Pour démontrer l&#39;utilité de ces approches ont été utilisées pour surveiller le trafic et l&#39;exocytose de lysosomes en réponse à une lésion de la membrane cellulaire.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Utilisé pour préparer la CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Utilisé pour préparer la CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>FITC dextran (fixable à la lysine)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml en billes de verre CIM ou PBS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml en CIM ou PBS</td></tr><tr><td>PFA 16 %</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4 % en PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 en PBS</td></tr><tr><td>FM colorant</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro ; g/&micro ; l dans CIM ou PBS</td></tr><tr><td>FITC dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml dans le milieu de croissance</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp ;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 dans le milieu de croissance</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 poulet anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 dans la solution de blocage</td></tr><tr><td>Média de montage</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-lames Fisher</td><td></td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Pétridish à fond de verre</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Joint</td> <td>torique en siliconeBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Porte-lamelle</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Utilisé pour le milieu de croissance : 10 % FBS, 1 % P/S dans le DMEM</td></tr><tr><td>Pénicilline/Sreptomycine</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Utilisé pour le milieu de croissance : 10 % FBS, 1 % P/S dans le DMEM</td></tr><tr><td>Sérum de poulet</td><td>Sigma</td><td>C5405</td> 5<td> % sérum de poulet en CIM est utilisé pour bloquer la solution lors de l’immunomarquage</td></tr><tr><td>PBS (sans Ca2+ et Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illuminateur&nbsp ;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur d’épifluorescence</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>Caméra</td><td>CCD Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsé</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de scène</td><td>Tokaihit, Japon</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

La capacité des cellules blessés à guérir est un processus cellulaire fondamental, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les cellules de guérison blessés sont mal compris. Voici les dosages sont décrits à surveiller la capacité et la cinétique de la guérison des cellules cultivées après une lésion localisée. Le premier protocole décrit une approche point final à base d&#39;évaluer simultanément la capacité cellulaire de réparation de la membrane des centaines de cellules. Le deuxième protocole décrit une méthode de formation d&#39;image en temps réel pour surveiller la cinétique de réparation de la membrane cellulaire dans des cellules individuelles après une lésion localisée avec un laser pulsé. Comme les cellules de guérison blessés implique trafic des protéines spécifiques et les compartiments sous-cellulaires au site de la blessure, le troisième protocole décrit l&#39;utilisation de l&#39;approche point final au-dessus de la base pour évaluer un tel événement de trafic (lysosomale exocytose) dans des centaines de cellules blessées simultanément et le dernier protocole décrit l&#39;utilisation de blessure laser pulsé avec micros de la FRBRcopie de suivre la dynamique des compartiments cellulaires dans des cellules individuelles blessés à haute résolution spatiale et temporelle. Bien que les protocoles ci-dessous décrivent l&#39;utilisation de ces approches pour étudier la relation entre la réparation des membranes cellulaires et lysosomale l&#39;exocytose dans les cellules musculaires en culture, elles peuvent être appliquées en tant que telles pour toute autre cellule en culture adhérente et un compartiment subcellulaire de choix.

Protocoles décrits ici pour l&#39;imagerie cellulaire unique sont à surveiller la capacité et la cinétique de la réparation de la membrane cellulaire (protocoles n ° 1 et 2) et le trafic subcellulaire et la fusion des lysosomes lors de la réparation (protocoles n ° 3 et 4). Protocole 1 montre un test essentiel qui permet le marquage de toutes les cellules blessés et identifier les cellules endommagées qui ont échoué à réparer. Les résultats de la figure 1 montrent que tandis...

Le processus de guérison des cellules blessées implique trafic des protéines spécifiques et des compartiments subcellulaires au site de la lésion de la membrane cellulaire. Ce protocole décrit les essais de surveiller ces processus.

Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'effet de traitements spécifiques sur la réparation de cellules lésées et d'étudier les processus subcellulaires contribuant à cette réparation. Ceci est réalisé en induisant des lésions cellulaires en présence de colorants fluorescents incapables de traverser les membranes cellulaires intactes, afin d'évaluer la cinétique et la capacité des cellules lésées à empêcher l'entrée de ces colorants. Dans un second temps, nous suivons l'apparition de protéines intracellulaires au niveau de la membrane des cellules lésées, ce qui permet de déterminer la capacité d'un compartiment cellulaire donné à participer à la réparation en fusionnant avec la membrane lésée.Ensuite, nous surveillons la fusion de compartiments cellulaires d'intérêt avec la membrane cellulaire lésée afin de suivre la cinétique de la lésion. La fusion déclenchée de ce compartiment permet d'obtenir des résultats indiquant que la réparation de la membrane cellulaire endommagée est associée à une exocytose lysosomale, fondée sur l'augmentation de l'apparition de la protéine membranaire associée aux lysosomes, une protéine à la surface cellulaire lésée, ainsi que sur l'imagerie en direct de la sécrétion du contenu lysosomal par les cellules lésées. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions importantes concernant la lésion et la réparation cellulaires.Par exemple, ces outils peuvent être utilisés pour déterminer quelles protéines et quels compartiments cellulaires réagissent à des lésions focales de la membrane cellulaire, puis évaluer la cinétique de cette réponse. La procédure sera démontrée par Aurelia D four et hamma stra two, postdoctorants de mon laboratoire. Afin de marquer séparément les cellules lésées qui cicatrisent et celles qui ne parviennent pas à cicatriser.Ensemencer les cellules sur des lamelles stériles pour les trois conditions expérimentales. Cultiver les cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence supérieure à 50 %, puis laver C un et C deux deux fois avec du milieu CIM à 37 degrés Celsius. Laver C3 avec du PBS à 37 degrés Celsius.Ensuite, transférez les lamelles sur des joints toriques en silicone. Ajoutez 100 microlitres de solution de dextran préchauffée dans le tampon approprié. Endommagez la membrane plasmique sur C une et C3 en ajoutant 40 milligrammes de billes de verre au-dessus de la lamelle à température ambiante et en inclinant manuellement la lamelle.Effectuez des mouvements de va-et-vient six à huit fois selon un angle de 30 degrés pour une lésion légère. Veillez à ce que les billes de verre soient réparties uniformément, réduisant ainsi les lésions répétées afin d'améliorer la reproductibilité de la lésion entre les échantillons. Réalisez simultanément la lésion par billes de verre sur les différents échantillons à comparer, en évitant tout roulement supplémentaire des billes.Transférez toutes les lamelles dans une incubateur à 37 degrés Celsius à une concentration ambiante de CO2 et laissez la réparation se poursuivre pendant cinq minutes sans laisser rouler les billes. Éliminez les billes de verre et le dextran fitzy par lavage avec un tampon ou du PBS. Replacez ensuite les lamelles sur l’anneau O et ajoutez 100 microlitres de lysine préchauffée.Solution fixable de dextran trissy. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes à une concentration ambiante de CO2. Rincer les lamelles deux fois avec du CIM préalablement réchauffé et fixer avec du PFA à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante, après deux rinçages au PBS. Incuber deux minutes dans le colorant de Hersch et, après deux rinçages au PBS, monter l'échantillon sur une lame en utilisant un milieu de montage.Ensuite, observez les cellules à l'aide d'un microscope à fluorescence épifluorescence à partir de l'échantillon C deux. Déterminez l'intensité du fond pour les colorations rouge et verte. Utilisez ensuite cette valeur pour seuiller les canaux rouge et vert de tous les échantillons.Comptez le nombre total de cellules vertes. Comptez également les cellules rouges ou à la fois rouges et vertes dans les échantillons C1 et C3. Comptez ensuite plus de 100 cellules lésées vertes pour chaque condition et exprimez la fraction des cellules ayant échoué à se réparer en pourcentage du nombre total de cellules lésées.Lavez les cellules ayant atteint une confluence supérieure à 50 % avec du CIM préchauffé et montez le coverslip dans du CIM contenant un colorant FM. Placez-le dans un support situé dans l’incubateur top-plate maintenu à 37 degrés Celsius. Sélectionnez une région de la membrane cellulaire en utilisant une puissance optimale permettant une lésion constante mais non létale.Irradiez l'échantillon pendant moins de 10 millisecondes à l'aide du laser pulsé pour atteindre cet objectif. Atténuez la puissance du laser via le logiciel à 40 à 50 % de la puissance maximale afin de surveiller, réparer et acquérir des images toutes les deux à dix secondes en épi, en fluorescence et en champ clair, en commençant avant la lésion et en continuant pendant trois à cinq minutes après la lésion. Pour quantifier la cinétique de la réparation, mesurez la fluorescence du colorant FM au niveau cellulaire.Calculer la variation d'intensité au cours de l'acquisition d'images. Faire la moyenne des données pour plus de 10 cellules dans chaque condition et représenter soit les valeurs moyennes, soit celles de cellules individuelles. Rincer les lamelles de C un et C deux.Préparer les cultures avec le CIM à 37 degrés Celsius et laver les C3 avec du PBS à 37 degrés Celsius. Transférer ensuite les échantillons sur des joints toriques en silicone. Ajouter 100 microlitres de dextran trissy fixable préchauffé à la lysine.Endommagez la membrane plasmique sur C1 et C3 comme indiqué précédemment. Ensuite, en évitant tout roulement supplémentaire des billes, transférez toutes les lamelles dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de CO2 ambiante et laissez la réparation se dérouler pendant cinq minutes.À présent, pour éliminer les billes de verre et le dextran Trixie, lavez les lamelles dans du milieu de croissance froid, en veillant à ce que les billes de verre ne roulent pas sur les cellules. Rincez les lamelles deux fois avec du milieu de croissance froid et transférez-les sur les joints toriques C un et C3. Ajoutez 100 microlitres d'anticorps rat anti-US lamp un dans du milieu de croissance complet froid, et ajoutez le milieu de croissance complet froid dans C deux afin de permettre la liaison de l'anticorps. Incubez les lamelles pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius après trois lavages avec du CIM froid.Fixer toutes les lamelles avec du PFA 4 % pendant 10 minutes à température ambiante. Puis rincer trois fois avec du CIM. Ensuite, incuber toutes les lamelles dans 100 microlitres d'une solution bloquante pendant 15 minutes, suivie de 100 microlitres d'anticorps anti-rat 488 pendant 15 minutes.Lavez deux fois avec du PBS et incubez dans la coloration de Her pendant deux minutes à température ambiante après deux lavages au PBS. Montez les échantillons sur une lame, puis observez-les au microscope à fluorescence épifluorescence en utilisant des images de deux cellules C. Déterminez la coloration de fond non spécifique dans les canaux rouge et vert.Utilisez ces valeurs de coloration de fond pour seuiller les canaux rouge et vert pour tous les échantillons. Utilisez les cellules marquées en rouge provenant de C1 et C3, dont le nombre dépasse 100, pour mesurer l'intensité de la coloration de lamp1 dans les cellules lésées. Dans une expérience réussie, l'intensité de la coloration de lamp1 dans les cellules provenant de C3 sera significativement plus faible que dans les cellules provenant de C1. Pour marquer les lysosomes avec un colorant fluorescent, incubez les cellules cultivées jusqu'à une confluence de 50 % dans un milieu de croissance contenant du dextran marqué avec Fitzy.Laisser la dextrane être endocytée pendant deux heures dans l'incubateur de culture cellulaire. Laver les cellules avec le milieu de croissance préchauffé et les incuber pendant deux heures dans un incubateur CO₂ afin de permettre l'accumulation de toute la dextrane endocytée dans les lysosomes avant l'acquisition des images. Rincer la lame porte-objet avec le milieu CIM préchauffé et la monter dans du CIM sur un support de lame porte-objet placé dans l'incubateur de platine à 37 degrés Celsius.Sélectionner des cellules dont les lysosomes marqués au dextran fitzy ne sont pas surchargés pour l’imagerie. Observer le déplacement et l’exocytose des lysosomes individuels. Acquérir des images en champ large pour suivre le mouvement des lysosomes dans toute la cellule.Acquérir alternativement des images de tapis pour observer le mouvement à la surface cellulaire et surveiller leur exocytose. Endommager la membrane cellulaire par irradiation, comme indiqué précédemment, afin de suivre la réponse des lysosomes à une lésion cellulaire ; acquérir des images à raison de quatre à six images par seconde pendant au moins deux minutes, voire plus longtemps, selon la dynamique de l'exocytose dans les cellules étudiées. Dans ce dosage en masse, toutes les cellules endommagées sont marquées, et celles qui n'ont pas réussi à se réparer sont identifiées, tandis que les cellules non lésées restent non marquées.Les cellules endommagées par les billes de verre en présence de dextran fitzy sont marquées en vert lorsque les cellules sont autorisées à se réparer en présence de calcium. La plupart des cellules lésées parviennent à se réparer et ne sont pas marquées par le dextran trissy lorsque les cellules sont autorisées à réparer. En l'absence de calcium, la plupart des cellules endommagées sont également marquées en rouge par le dextran trissy.Cette expérience évalue la cinétique de réparation de la membrane cellulaire en surveillant l'entrée du colorant FM dans la cellule. Lorsqu'elles sont incubées dans le colorant FM, les cellules intactes présentent peu ou pas de coloration intracellulaire. Après une lésion localisée de la membrane cellulaire induite par laser, le colorant FM commence à pénétrer dans la cellule et à se lier aux membranes endomembranaires, ce qui provoque une augmentation soudaine de la fluorescence du colorant FM, car la capacité de la membrane cellulaire à se réparer suite à une lésion laser dépend du calcium.Une cellule endommagée en présence de calcium est capable de se réparer, ce qui entraîne l'arrêt de l'entrée du colorant FM dans la minute suivant la lésion. En revanche, une cellule laissée en absence de calcium ne parvient pas à se réparer, ce qui entraîne une entrée continue du colorant et donc une augmentation continue de la fluorescence de FM d, même quatre minutes après la lésion. Ainsi, la réparation de la membrane cellulaire conduit à un plateau dans la coloration par le colorant FM.Alors qu'une absence de réparation de la membrane cellulaire entraîne une entrée continue du colorant qui ne parvient pas à atteindre un plateau. L'approche par blessure massive avec des billes de verre peut être utilisée pour surveiller la translocation à la surface cellulaire des vésicules et des protéines en réponse à une lésion. Ici, les cellules sont endommagées en présence de dextran marqué au trypan.Ainsi, alors que les cellules non lésées ne sont pas marquées en rouge, toutes les cellules lésées sont marquées en rouge. Notez que les cellules non lésées non traitées par l'anticorps primaire présentent un marquage de fond pour la protéine lamp-1 à la surface cellulaire. Toutefois, lorsque les cellules sont lésées et autorisées à cicatriser en présence de calcium, les lysosomes subissent une exocytose, entraînant ainsi une augmentation du marquage de la protéine lamp-1 à la surface des cellules lésées.Cet accroissement du marquage de la lamp-1 à la surface cellulaire est nettement plus faible dans les cellules autorisées à cicatriser en l'absence de calcium. Ainsi, tant la quantification du nombre de cellules présentant une forte coloration de la lamp-1 à la surface cellulaire que la mesure du niveau de coloration de la lamp-1 à la surface cellulaire sur des cellules lésées individuelles fournissent des indicateurs de la capacité de la cellule à effectuer une exocytose lysosomale induite par la lésion.Cet expérience surveille directement la cinétique, la nature et la localisation des fusions lysosomales individuelles. En réponse à une lésion de la membrane cellulaire, les cellules sont endommagées à l’aide d’un laser pulsé et les lysosomes de la surface cellulaire sont observés par imagerie TURF, ce qui permet de suivre l’exocytose induite par la lésion au niveau de cellules individuelles. Cette figure montre une cellule visualisée par contraste de phase dans le panneau gauche et par microscopie TURF dans le panneau central.Le panneau droit montre l'image turf de la même cellule 105 secondes après la lésion. Ici, la lésion a déclenché le recrutement d'un lysosome vers la membrane cellulaire, suivi d'une exocytose, qui est illustrée. Ce lysosome n'est pas visible sur l'image turf avant la lésion, mais après celle-ci, le lysosome arrive à la membrane cellulaire et devient détectable.Lorsque la vésicule s'approche de la membrane cellulaire, elle est mieux excitée par l'illumination en champ large, ce qui fait que la fluorescence du brin lysosomal fitzy DExT atteint sa valeur maximale. Lorsque l'ouverture de fusion se produit, cela entraîne une neutralisation du pH lysosomal et, par conséquent, une désinhibition de la fluorescence du brin fitzy DExT. Par la suite, le brin DExT est libéré de la vésicule vers l'extérieur de la cellule, provoquant une diffusion latérale de la fluorescence ZI et une diminution progressive de la fluorescence de la vésicule. Diverses réponses cellulaires déclenchées par des lésions peuvent ainsi être mesurées.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surveiller la capacité des cellules à se réparer après des lésions focales importantes et comment observer les compartiments subcellulaires et les protéines qui réagissent à ces lésions et participent au processus de réparation. D'autres expériences utilisant divers marqueurs vitaux, compartiments ou protéines peuvent être réalisées afin de suivre la réponse à la lésion et l'implication dans la réparation des cellules IND.

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