Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer l’effet des traitements souhaités sur la réparation des cellules blessées et d’étudier les processus subcellulaires qui aident à réparer les cellules blessées. Ceci est réalisé en blessant les cellules en présence de colorants fluorescents qui ne peuvent pas traverser les membranes cellulaires intactes afin d’évaluer la cinétique et la capacité des cellules blessées à empêcher l’entrée de ces colorants. Dans un deuxième temps, nous surveillons l’apparition de protéines intracellulaires au niveau de la membrane cellulaire lésée, ce qui identifie la capacité d’un compartiment cellulaire d’intérêt à participer à la réparation en fusionnant avec la membrane cellulaire lésée.

Ensuite, nous surveillons la fusion des compartiments cellulaires d’intérêt avec la membrane cellulaire lésée afin de surveiller la cinétique de la lésion. Des résultats d’obtention de fusion déclenchée de ce compartiment montrent que la réparation des lésions de la membrane cellulaire est associée à l’exocytose lysosomale basée sur l’apparition accrue de la protéine membranaire associée aux lysosomes, une à la surface de la cellule lésée et l’imagerie en direct de la sécrétion du contenu lysosomal par les cellules lésées. Ces méthodes peuvent aider à résoudre des questions importantes sur les lésions et la réparation cellulaires.

Par exemple, ceux-ci peuvent être utilisés pour déterminer quelles protéines et quels compartiments cellulaires répondent aux lésions focales au niveau de la membrane cellulaire, puis évaluer leur cinétique de la réponse. La démonstration de la procédure serait assurée par Aurelia D, quatre ans, et Hamma Stra, deux des boursiers postdoctoraux de mon laboratoire. Marquer séparément les cellules blessées qui guérissent et celles qui ne guérissent pas.

Ensemencez les cellules sur des lamelles stériles pour les trois conditions expérimentales. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent plus de 50 % de confluence, puis lavez C un et C deux deux fois avec CIM à 37 degrés Celsius. Lavez C3 avec du PBS à 37 degrés Celsius.

Transférez ensuite les lamelles de recouvrement sur des joints toriques en silicone. Ajouter 100 microlitres de solution de dextran préchauffé dans un tampon approprié. Blessez la membrane plasmique sur C one et C3 en ajoutant 40 milligrammes de billes de verre sur la lamelle à température ambiante et en inclinant manuellement le couvercle.

Glisse d’avant en arrière six à huit fois à un angle de 30 degrés pour les blessures légères. Assurez-vous que les billes de verre sont réparties uniformément, minimisant ainsi les blessures répétées pour améliorer la reproductibilité des blessures entre les échantillons. Effectuer simultanément l’endommagement des billes de verre des différents échantillons à comparer, en évitant de rouler davantage les billes.

Transférez toutes les lamelles dans un incubateur à 37 degrés Celsius à CO2 ambiant et laissez la réparation se poursuivre pendant cinq minutes sans laisser les billes rouler. Retirez les billes de verre et le dextran fitzy en les lavant avec un tampon ou du PBS. Remettez maintenant les glissières de couverture sur le joint torique et ajoutez 100 microlitres de lysine préchauffée.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes au CO2 ambiant. Lavez les lamelles de couverture deux fois avec un CIM préchauffé et fixez-les avec 4 % de PFA pendant 10 minutes à température ambiante après deux lavages PBS. Incuber pendant deux minutes dans un colorant hersch et, après deux lavages PBS, monter l’échantillon sur une lame à l’aide d’un support de montage.

Ensuite, imagez les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence à partir de l’échantillon C deux. Déterminez l’intensité de la coloration rouge et verte de fond. Utilisez ensuite cette valeur pour seuilr les canaux rouge et vert pour tous les échantillons.

Évaluez le nombre total de cellules vertes. Notez également les cellules rouges ou rouges et vertes dans les échantillons C un et C3. Comptez maintenant plus de 100 cellules vertes blessées pour chaque condition et exprimez la fraction des cellules qui n’ont pas réussi à se réparer en pourcentage de toutes les cellules blessées.

Lavez les cellules cultivées à plus de 50 % de confluence avec le CIM pré-averti et montez la lamelle de recouvrement dans le CIM avec un colorant FM. Dans un support dans l’incubateur supérieur de la scène maintenu à 37 degrés Celsius. Sélectionnez une région de la membrane cellulaire à l’aide d’une puissance optimale qui permet des lésions constantes mais non létales.

Pour y parvenir, irradiez l’échantillon pendant moins de 10 millisecondes avec le laser pulsé. Atténuez la puissance laser à l’aide du logiciel à 40 à 50 % de la puissance de crête afin de surveiller, de réparer et d’acquérir des images toutes les deux à 10 secondes en épi, en fluorescence et en fond clair en commençant avant la blessure et en continuant pendant trois à cinq minutes après la blessure. Pour quantifier la cinétique de réparation, mesurez la fluorescence du colorant FM cellulaire.

Calculez le changement d’intensité au cours de l’imagerie. Faites la moyenne des données de plus de 10 cellules dans chaque condition et tracez la moyenne des données ou la valeur des cellules individuelles. Lavez les lamelles de C un et C deux.

Cultures préparées avec CIM à 37 degrés Celsius et lavage C3 avec PBS à 37 degrés Celsius. Transférez ensuite les échantillons sur des joints toriques en silicone. Ajouter 100 microlitres de lysine préchauffée fixable trissy dextran.

Endommager la membrane plasmique sur C un et C3 comme indiqué précédemment. Ensuite, en évitant de rouler davantage les billes. Transférez toutes les lamelles dans un incubateur à 37 degrés Celsius à température ambiante de CO2 et laissez la réparation se poursuivre pendant cinq minutes.

Maintenant, pour enlever les billes de verre et le Trixie dextran, lavez les lamelles de couverture dans un milieu de croissance froid, en veillant à ce que les billes de verre ne roulent pas sur les cellules. Rincez deux fois les lamelles de couverture avec un milieu de croissance à froid et transférez-les sur les joints toriques en C one et C3. Ajouter 100 microlitres d’anticorps anti-US de rat dans un milieu de croissance complet froid et ajouter le milieu de croissance complet froid à C deux pour permettre la liaison de l’anticorps. Incuber les lamelles pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius après trois lavages avec du CIM froid.

Fixez tous les lamelles avec 4 % de PFA pendant 10 minutes à température ambiante. Rincez ensuite trois fois avec CIM. Ensuite, incubez toutes les lamelles dans 100 microlitres une solution bloquante pendant 15 minutes, suivie de 100 microlitres d’ofor, 4 88 anticorps anti-rat pendant 15 minutes.

Laver deux fois avec du PBS et incuber dans sa tache pendant deux minutes à température ambiante après deux lavages PBS. Montez les échantillons sur une lame, puis imagez-les à l’aide d’un microscope à épifluorescence à l’aide d’images de cellules C, deux. Déterminez les taches de fond non spécifiques dans les canaux rouge et vert.

Utilisez ces valeurs de coloration de fond pour seuilr les canaux rouge et vert pour tous les échantillons. Utilisez les plus de 100 cellules marquées en rouge de C un et C3 pour mesurer l’intensité de la coloration de la lampe un dans les cellules blessées. Dans une expérience réussie, la coloration des cellules de C3 sera significativement plus faible que dans les cellules de C 1 pour le marquage des lysosomes avec un colorant fluorescent incuber les cellules cultivées à 50 % de confluence dans un milieu de croissance contenant du dextran fitzy.

Laissez le dextran être endocytosé pendant deux heures dans l’incubateur de culture cellulaire. Lavez les cellules avec un milieu de croissance Prewarm et incubez-y pendant deux heures dans un incubateur à CO2 pour permettre à tout le dextran endocytose de s’accumuler dans le lysosome avant l’imagerie. Rincez la lamelle dans Prewarm CIM et montez-la dans CIM sur un support de housse sur l’incubateur supérieur de la scène à 37 degrés Celsius.

Sélectionnez pour les cellules qui n’ont pas de lysosomes encombrés marqués au dextran pour l’imagerie. Le mouvement et l’exocytose des lysosomes individuels. Acquérez des images à grand champ pour le mouvement des lysosomes dans toute la cellule.

Alternativement, acquérir des images de gazon pour le mouvement à la surface de la cellule et pour surveiller leur exocytose. Endommager la membrane cellulaire par irradiation, comme montré précédemment, pour surveiller la réponse du lysosome aux cellules d’imagerie des lésions cellulaires à quatre à six images par seconde pendant au moins deux minutes ou plus, selon la dynamique de l’exocytose dans les cellules d’intérêt. Dans ce test en vrac, toutes les cellules blessées sont marquées et celles qui n’ont pas réussi à se réparer sont identifiées, tandis que les cellules non blessées ne sont pas étiquetées.

Les cellules blessées par les billes de verre en présence de dextran fitzy sont étiquetées en vert lorsque les cellules sont autorisées à se réparer en présence de calcium. La plupart des cellules blessées parviennent à se réparer et ne sont pas marquées par le trissy dextran lorsque les cellules sont autorisées à se réparer. En l’absence de calcium, la plupart des cellules blessées sont également marquées en rouge par le trissy dextran.

Cette expérience évalue la cinétique de la réparation de la membrane cellulaire en surveillant l’entrée du colorant FM dans la cellule. Lorsqu’elles sont incubées dans des cellules intactes, les cellules intactes présentent peu ou pas de coloration intracellulaire. À la suite d’une lésion localisée de la membrane cellulaire par un laser, la FM D commence à pénétrer dans la cellule et à se lier aux endomembranes, ce qui provoque une augmentation soudaine de la fluorescence du colorant FM, car la capacité de la membrane cellulaire à se réparer après une lésion au laser dépend du calcium.

Une cellule blessée en présence de calcium est capable de se réparer, ce qui fait que l’entrée du colorant FM cesse dans la minute qui suit la blessure. Au contraire, une cellule autorisée à se réparer en l’absence de calcium ne se répare pas, ce qui entraîne une entrée continue du colorant et donc une augmentation continue de la fluorescence FM d, même quatre minutes après la blessure. Ainsi, la réparation de la membrane cellulaire conduit à un plafonnement de la coloration du colorant FM.

Alors que l’absence de réparation de la membrane cellulaire provoque une entrée continue de colorant qui ne plafonne pas. L’approche des lésions par billes de verre en vrac peut être utilisée pour surveiller la translocation à la surface cellulaire des vésicules et des protéines en réponse à une lésion. Ici, les cellules sont blessées en présence de trissy dextran.

Ainsi, alors que les cellules non blessées ne sont pas étiquetées en rouge, toutes les cellules blessées sont étiquetées en rouge. Notez que les cellules non blessées qui ne sont pas traitées avec l’anticorps primaire présentent un marquage de niveau de fond pour la première lampe de surface cellulaire. Cependant, lorsque les cellules sont blessées et laissées guérir en présence de calcium, les lysosomes subissent une exocytose et il y a donc un niveau accru de coloration à la surface des cellules blessées.

Cette augmentation de la surface cellulaire est beaucoup plus faible dans les cellules qui sont autorisées à guérir en l’absence de calcium. Ainsi, à la fois la quantification du nombre de cellules avec une coloration de lampe à surface cellulaire élevée, ainsi que la mesure du niveau de la lampe de surface cellulaire. Un. La coloration sur les cellules lésées individuelles fournit des mesures de la capacité de la cellule à subir une exocytose lysosomale déclenchée par une lésion.

Cette expérience surveille directement la cinétique, la nature et l’emplacement de la fusion individuelle des lysosomes. En réponse à une lésion de la membrane cellulaire, les cellules sont endommagées par le laser pulsé et les lysosomes de surface cellulaire sont imagés par imagerie sur gazon, ce qui permet de surveiller l’exocytose des lysosomes déclenchée par lésion dans les cellules individuelles. Cette figure montre une cellule visualisée par imagerie à contraste de phase dans le panneau de gauche et par microscopie de gazon dans le panneau central.

Le panneau de droite montre l’image du gazon de la même cellule 105 secondes après la blessure. Ici, une lésion a déclenché le recrutement d’un lysosome dans la membrane cellulaire, suivie d’une exocytose, est montrée. Ce lysosome n’est pas visible sur l’image du gazon avant la blessure, mais après la blessure, le lysosome arrive à la membrane cellulaire et devient détectable.

Au fur et à mesure que la vésicule se rapproche de la membrane cellulaire, elle est mieux excitée par l’éclairage du gazon, ce qui fait que la fluorescence du brin dex ajusté lysosomal atteint sa valeur maximale. Lorsque la coulée de fusion s’ouvre, cela provoque la neutralisation du pH lysosomal et donc l’extinction de la fluorescence du brin DExT. Par la suite, le brin DExT est déchargé de la vésicule vers l’extérieur de la cellule, ce qui permet à la fluorescence ZI de se propager latéralement et à la fluorescence de la vésicule de diminuer progressivement diverses réponses déclenchées par les lésions des lysosomes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller la capacité des cellules à se réparer à partir de lésions focales importantes et de surveiller les compartiments subcellulaires et les protéines qui répondent et aident au processus de réparation. D’autres expériences utilisant différents marquages vitaux, compartiments ou protéines peuvent être réalisées afin de surveiller la réponse à la lésion et l’implication dans la réparation des cellules IND.