Mesures microscopie intravitale Vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris

L’objectif global de cette procédure est de mesurer le flux sanguin rétinien chez la souris. Ceci est accompli en infusant d’abord des microsphères fluorescentes à travers la veine fémorale canulée d’une souris anesthésiée. La deuxième étape consiste à enregistrer sur vidéo les microsphères qui circulent dans les vaisseaux rétiniens de la souris.

Ensuite, perférez du dextran fluorescent à travers la veine fémorale et capturez une vidéo pendant qu’il circule dans les vaisseaux rétiniens. La dernière étape consiste à mesurer les vitesses des microsphères et les diamètres des vaisseaux à partir des vidéos enregistrées pour un calcul du débit sanguin rétinien. L’un des principaux avantages de cette technique est la possibilité de mesurer avec précision le flux sanguin de la rétine à l’aide d’un microscope à fluorescence standard.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la rétine, telles que la mesure dans laquelle les changements dans le flux sanguin contribuent à la rétinopathie diabétique. Bien que nous démontrerons cette technique dans la rétine d’une souris. La méthode générale peut être utilisée dans d’autres tissus et également chez les rats.

Sonicate une solution mère à 1 % de microsphères de 1,9 micron de diamètre, prélevez 10 microlitres de la solution mère dans une seringue de 300 microlitres, puis diluez les microsphères en aspirant 240 microlitres de solution saline stérile dans la seringue. Ensuite, préparez une solution de 50 microlitres de dextran fluorescent, dissoute dans suffisamment de solution saline stérile pour que la dose injectée soit de cinq milligrammes par kilogramme. Recouvrez ensuite le dextran de papier d’aluminium jusqu’à ce qu’il soit temps de le fusionner.

Après avoir anesthésié l’animal et testé l’anesthésie adéquate à l’aide d’un pincement de remorquage, placez un coussin chauffant sous l’animal. Gardez les yeux humides avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, cassez la pointe pointue d’une aiguille de seringue en la pliant d’avant en arrière avec l’hémostat.

Placez ensuite un tube en polyéthylène de 20 centimètres de longueur sur la pointe émoussée de l’aiguille et remplissez le tube avec la solution saline héparinisée. Préparez maintenant une solution saline héparinée de 25 unités par millilitre. Remplissez la seringue avec la solution saline héparinée après avoir rasé un côté du bas-ventre, faites une incision d’un centimètre à la transition entre l’abdomen et la jambe pour exposer la veine fémorale.

Ensuite, attachez le vaisseau juste à côté de l’élargissement de la veine fémorale avec une suture à cinq T. Ensuite, faites une incision partielle de la moitié du diamètre du récipient et insérez le tube dans le récipient le long de son axe à un angle de 20 à 30 degrés au-dessus de l’horizontale. Fixez la tubulure avec la suture attachée autour de la section canulée.

Pour préparer l’animal à la microscopie, dilater la pupille de l’œil avec une goutte de solution ophtalmique tropic aide 1 %, suivie d’une goutte de solution ophtalmique hyper melos 2,5 %. Couvrez ensuite l’œil avec une lamelle en verre de cinq millimètres. Après avoir placé l’animal sur une planche en plexiglas, placez la planche sous l’objectif du microscope vertical.

Placez de la gaze chirurgicale sous la tête pour permettre un axe direct à travers l’objectif vers la rétine centrale et le disque optique. À l’aide de l’objectif Forex et d’un filtre à fluorescéine, faites la mise au point sur le disque optique, en le maintenant au centre du champ de vision. Ensuite, perférez la solution de microsphère fluorescente dans la veine fémorale à un taux de 250 microlitres par minute et par kilogramme.

À l’aide d’un temps d’exposition de huit millisecondes, enregistrez la rétine visible autour du disque optique. Arrêtez l’infusion de microsphères. Au bout de trois minutes, une partie de la solution de microsphère peut rester inutilisée.

Perférez la solution préparée de dextran fluorescent dans la veine fémorale sous forme de bolus pendant cinq secondes. Pour commencer à mesurer les diamètres des vaisseaux rétiniens, maintenez la mise au point sur le disque optique avec l’objectif Forex. Passez ensuite à un objectif 10x et à une exposition de 40 millisecondes.

Il est temps d’améliorer la résolution de la vidéo de quatre à sept artères et de quatre à sept sites dans la rétine superficielle. Faites la mise au point sur un quadrant de la rétine visible à la fois, en gardant le centre du disque optique dans un coin du champ de vision. Enregistrez chaque quadrant pendant seulement 10 à 15 secondes pour minimiser le risque de phototoxicité.

Maintenant, analysez la vidéo pour déterminer les débits et le flux sanguin rétinien total. À l’aide d’une échelle micrométrique, calibrez le système vidéo pour une conversion de microns en pixels Avec un logiciel de traitement d’image. Visionnez la vidéo enregistrée de la vidéo de la perfusion en bolus de dextran fluorescent.

Identifiez les artères et les viraux, les artères se perfusent avant les viraux. Mesurez le diamètre de chacune des artères et des vees remplies de dextran fluorescent. Moyenne de cinq mesures de diamètre par navire le long de la longueur visible.

Ensuite, pour chacune des mêmes artères et vées, mesurez la longueur des traînées des microsphères fluorescentes à l’aide de 10 traînées successives de microsphères dans chaque récipient pour éviter le biais de sélection. Divisez maintenant la longueur des traînées par le temps d’exposition pour calculer la vitesse de la microsphère et faire la moyenne des 10 vitesses par récipient. Ensuite, calculez le débit volumétrique de chaque récipient.

L’écoulement est égal à la vitesse moyenne multipliée par pi fois le diamètre au carré divisé par quatre. Enfin, additionnez les débits artériolaires et séparément les débits ulaires pour obtenir le débit sanguin rétinien total. Montré. Voici des images uniques de vidéo montrant des microsphères fluorescentes de 1,9 micron apparaissant comme des traînées lorsqu’elles se déplacent dans les vaisseaux rétiniens.

L’image du milieu montre l’orientation des vaisseaux rétiniens dans les autres panneaux de la figure. Notez que certains cadres ont plusieurs stries. Dans cette expérience, la plupart des traînées fluorescentes ont une longueur de 120 à 170 microns, ce qui correspond à des vitesses de 1,5 à 2,1 centimètres par seconde.

Les images suivantes proviennent de l’infusion en bolus de dextran fluorescent. Dans les premières images, on voit les artères se remplir de dextran. Les vees se remplissent après que le colorant a fait son transit à travers les lits capillaires.

Voici l’une des 10 images utilisées pour mesurer le diamètre des récipients. Les diamètres artériolaires variaient de 47 à 55 microns et les diamètres veineux de 50 à 65 microns. Cette figure montre les mesures de débit d’une expérience précédente dans laquelle des microsphères fluorescentes et des globules rouges fluorescents ont été injectés dans la même souris pour déterminer si des vitesses et des flux de vaisseaux similaires seraient trouvés.

Comme l’indique ce chiffre, les vitesses et les débits mesurés étaient très similaires Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure si elle est exécutée correctement. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de ne pas oublier de réduire l’excitation fluorescente des colorants en limitant le temps d’ouverture de l’obturateur du microscope. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont les colorants fluorescents peuvent être utilisés pour mesurer le flux sanguin rétinien chez la souris.