Name: Mesures microscopie intravitale Vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie vidéo intravitale pour mesurer le débit sanguin rétinien chez la souris. Cette technique utilise des microsphères fluorescentes et du dextran pour quantifier précisément les diamètres vasculaires et les vitesses sanguines.

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Financé par NIH EY017599 (NRH).

Les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du LSUHSC-S et exécutées conformément aux critères définis par les National Institutes of Health.
1. Préparation des solutions de perfusion
<ol>
	<li>Sonicer une solution mère à 1 % (en poids) de microsphères de 1,9 μm de diamètre.</li>
	<li>Prélever ~25-30 x 106 microsphères fluorescentes vertes (c’est-à-dire ~10 μl de la solution mère) dans une seringue de 300 μl. Diluez les microsphères en prélevant 240 μl supplémentaires de solution saline dans la seringue.</li>
	<li>Préparez une solution de 50 μl de dextran fluorescent de 2 x 10de poids moléculaire 6 dissous dans une solution saline stérile, avec une dose injectée comprise entre 3 et 10 mg/kg. Gardez le dextran recouvert de papier d’aluminium jusqu’au moment de son infusion.</li>
</ol>
2. Anesthésie animale et canulation vasculaire
<ol>
	<li>Anesthésier l’animal pour l’insertion chirurgicale de canules vasculaires et pour le positionnement stationnaire sous un objectif microscope. De nombreux choix de protocoles d’anesthésie sont disponibles, avec divers avantages et inconvénients, et des effets potentiels sur les paramètres systémiques. Parmi les nombreux choix différents, citons une combinaison de kétamine (100-150 mg/kg), de xylazine (10 mg/kg) et d’acépromazine (2 mg/kg), ou une combinaison de kétamine (50 mg/kg) et de pentobarbital (50 mg/kg). Les procédures décrites sont aiguës et se terminent par une euthanasie induite par une surdose de pentobarbital (150 mg/kg) suivie d’une thoracotomie ; L’inclusion d’un analgésique n’est pas nécessaire pour la procédure terminale.</li>
	<li>Maintenez un coussin chauffant sous l’animal pour le reste de l’expérience.</li>
	<li>Gardez les yeux humides avec une solution saline tamponnée au phosphate lors des insertions chirurgicales ultérieures des canules vasculaires.</li>
	<li>Préparez une canule vasculaire pour les perfusions ultérieures de traceurs fluorescents. Un tube en polyéthylène d’une longueur de 20 cm (par exemple, 0,28 mm de diamètre intérieur, 0,61 mm de diamètre extérieur) est placé sur l’extrémité d’une aiguille de seringue, l’extrémité pointue de l’aiguille étant préalablement cassée en se pliant d’avant en arrière avec un hémostat.</li>
	<li>Remplissez une seringue et un tube avec une solution saline héparinée (25 U/ml).</li>
	<li>Rasez un côté du bas-ventre et faites une incision pour exposer la veine fémorale.</li>
	<li>Pour canuler la veine fémorale, attachez le vaisseau avec une suture 5.0, faites une incision partielle du vaisseau (environ la moitié du diamètre du vaisseau) et insérez le tube dans le vaisseau, en fixant le tube avec la suture attachée autour de la section canulée.</li>
</ol>
3. Préparation à la microscopie intravitale
<ol>
	<li>Dilater la pupille de l’œil avec une goutte de solution ophtalmique de tropiciamide à 1 %, suivie d’une goutte de solution ophtalmique d’hypromellose à 2,5 %.</li>
	<li>Couvrez l’œil avec une lamelle en verre de 5 mm.</li>
	<li>Placez l’animal sur une planche de plexiglas, qui sera placée sous l’objectif du microscope d’un microscope vertical. Placez stratégiquement de la gaze chirurgicale sous la tête pour permettre un axe direct à travers l’objectif vers la rétine centrale et le disque optique.</li>
	<li>Faites la mise au point à travers le microscope sur le disque optique, en trouvant le disque avec un objectif 4X de faible puissance et en utilisant un filtre à fluorescéine.</li>
</ol>
4. Infusion de microsphères fluorescentes pour mesurer les vitesses
<ol>
	<li>À l’aide d’un objectif 4X, faites la mise au point sur la rétine avec le disque optique au centre du champ de vision.</li>
	<li>Perfuser la solution de microsphères fluorescentes à une vitesse de 250 μl/min/kg.</li>
	<li>Enregistrez en vidéo la rétine visible autour du disque optique, en utilisant un temps d’exposition de l’appareil photo de ~8 ms.</li>
	<li>Arrêtez l’infusion de microsphères lorsqu’une durée suffisante de vidéo a été enregistrée (1 à 2 min) ; une partie de la solution de microsphère restera probablement inutilisée.</li>
</ol>
5. Infusion d’un marqueur plasma fluorescent pour mesurer les diamètres
<ol>
	<li>À l’aide d’un objectif 4X, faites la mise au point sur la rétine avec le disque optique au centre du champ de vision.</li>
	<li>Perfaction la solution préparée de dextran fluorescent dans la veine fémorale sous forme de bolus pendant ~5 secondes, pendant l’enregistrement vidéo. Cette vidéo aidera à déterminer l’identité des artérioles par rapport aux veinules, les artérioles étant perfusées en premier. Effectuez cette étape avec le temps d’exposition de l’appareil photo réglé sur ~8 ms, bien que le temps d’exposition précis ne soit pas critique.</li>
	<li>Passez à un objectif 10X et à un temps d’exposition de 20 à 40 ms pour une meilleure résolution afin de filmer chacune des 4 à 7 artérioles et 4 à 7 veinules de la rétine superficielle. Concentrez-vous (et enregistrez vidéo) sur environ un quadrant de la rétine visible à la fois, avec le centre du disque optique dans un coin du champ de vision. Il faut s’efforcer de réduire au minimum le temps pendant lequel la lumière du microscope éclaire le tissu afin de réduire le risque de phototoxicité induite par la lumière ou les colorants17.</li>
</ol>
6. Analyse vidéo
<ol>
	<li>À l’aide d’une échelle micrométrique, calibrez le système vidéo pour une conversion de μm/pixel.</li>
	<li>Avec un logiciel de traitement d’image, lisez la vidéo enregistrée.</li>
	<li>À partir de la vidéo de la perfusion en bolus de dextran fluorescent, identifiez les artérioles par rapport aux veinules.</li>
	<li>Pour chacune des 4 à 7 artérioles et 4 à 7 veinules enregistrées avec l’objectif 10X, mesurez les diamètres remplis de dextran fluorescent, en faisant une moyenne de 5 mesures de diamètre par vaisseau le long de la longueur visible.</li>
	<li>Pour chacune des mêmes artérioles et veinules, mesurez la longueur des traînées des microsphères fluorescentes, en utilisant 10 traînées successives de microsphères dans chaque vaisseau pour éviter le biais de sélection. Divisez la longueur des traînées par le temps d’exposition pour calculer la vitesse de la microsphère, par exemple, 160 μm/8 msec = 20 μm/msec = 2 cm/sec. Faites la moyenne des 10 vitesses par navire.</li>
	<li>Calculez le débit volumétrique de chaque cuve à l’aide de l’équation suivante : débit = vitesse moyenne × π × diamètre2/4.</li>
	<li>Additionnez les débits artériolaires, et séparément les débits veineux, pour obtenir le débit sanguin rétinien total.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette technique de vidéomicroscopie intravitale peut être appliquée non seulement aux souris, mais aussi aux rats. Ce protocole ne repose que sur quelques hypothèses, mais est limité à une utilisation sous anesthésie et avec la dilatation de la pupille telle que nous l’avons décrite. Les autres hypothèses et limites sont les suivantes :
1. Hypothèse d’une erreur de grossissement optique minimale résultant de la nature réfractive de l’œil. Comme décrit par d’autres18-20</su...

La rétine est l’un des tissus les plus métaboliquement actifs du corps et nécessite par conséquent un apport sanguin généreux. Deux circulations distinctes répondent à cette demande : la circulation choroïdienne pour la partie externe de la rétine et la circulation rétinienne pour la partie interne de la rétine. L’étude de la perfusion rétinienne est impérative pour comprendre les mécanismes pathologiques et les conséquences de la rétinopathie diabétique, de la rétinopathie induite par l’oxygène, de l’occlusion de l’artère ou de la veine de la rétine et de l’accident vasculaire cérébral. Plusieurs méthodes ont été employées pour quantifier le flux sanguin rétinien, chaque technique ayant ses avantages, ses inconvénients, ses limites et ses hypothèses. Parmi ces techniques, citons la perfusion de microsphères de 7 à 8 m de diamètre qui se logent dans les artérioles précapillaires1,2, l’autoradiographie quantitative3,4, la microangiopathie optique-tomographie par cohérence optique5,6, l’imagerie par résonance magnétique7,8 et la vidéomicroscopie intravitale9 à 16. Les avantages de ce dernier comprennent la visualisation directe en direct des vaisseaux et du flux rétiniens, une dépendance à l’égard de quelques hypothèses mineures et un prix abordable pour les laboratoires disposant d’un microscope à fluorescence avec une caméra vidéo attachée. Dans des études antérieures de microscopie vidéo intravitale9-16, le dextran fluorescent a été utilisé comme marqueur plasmatique, et les globules rouges marqués par fluorescence (provenant d’un animal donneur) ont été utilisés comme marqueurs de vitesse. Dans le protocole actuel, des microsphères de 1,9 m de diamètre, au lieu de globules rouges, sont utilisées pour mesurer la vitesse, cette altération éliminant le besoin d’un donneur de cellules sanguines.

<table><tbody><tr><td>Microsphères fluorescentes</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (vert)</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td> <td>de dextran fluorescent de haut poids moléculaire</td><td>D-7137 (vert) ; D-7139 (rouge)</td><td></td></tr><tr><td>Système de microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + embouts Objectif</td><td></td></tr><tr><td>4X</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>ouverture numérique 0,13 ; distance de travail 17,2 mm</td></tr><tr><td>Objectif 10X Objectif</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>ouverture numérique 0,25 ; distance de travail 10,5 mm</td></tr><tr><td>Tropicamide solution ophtalmique</td><td>Bausch Lomb</td><td>1 % Tropicamide</td><td></td></tr><tr><td>Hypromellose solution ophtalmique</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2,5 % Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement</td><td>d’images Université de Californie San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Caméra vidéo numérique pour la microscopie</td><td>Photométrie</td><td>CoolSnap ES</td><td>1392 x 1040 pixels résolution ; taille des pixels 6,45 x 6,45 &mu ; L</td></tr></tbody></table>

mesures microscopie intravitale vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Les altérations du flux sanguin rétinien peuvent contribuer à la maladie oculaire et au dysfonctionnement visuel ou en être la conséquence. Par conséquent, la quantification de la perfusion altérée peut aider la recherche sur les mécanismes des pathologies rétiniennes. La vidéomicroscopie intravitale des traceurs fluorescents peut être utilisée pour mesurer les diamètres vasculaires et les vitesses sanguines du système vasculaire rétinien, en particulier des artérioles qui se ramifient à partir de l’artère centrale de la rétine et des veinules menant à la veine centrale de la rétine. Les débits sanguins peuvent être calculés à partir des diamètres et des vitesses, avec la somme du flux artériolaire et du flux veinulaire séparément, ce qui fournit des valeurs du débit sanguin rétinien total. Cet article et la vidéo associée décrivent les méthodes d’application de cette technique à la souris, qui comprend 1) la préparation de l’œil pour la microscopie intravitale de l’animal anesthésié, 2) la perfusion intraveineuse de microsphères fluorescentes pour mesurer la vitesse de la circulation sanguine, 3) la perfusion intraveineuse d’un dextran fluorescent de haut poids moléculaire, pour aider à la visualisation microscopique de la microvascularisation rétinienne, 4) l’utilisation d’une caméra de microscope numérique pour obtenir des vidéos de la rétine perfusée, et 5) l’utilisation d’un logiciel de traitement d’image pour analyser la vidéo. Les mêmes techniques peuvent être utilisées pour mesurer les débits sanguins rétiniens chez les rats.

Figure 1 montre des images individuelles d'une vidéo provenant d'une expérience, les panneaux A à D et F à I présentant des traînées de microbilles fluorescentes capturées avec un objectif 4X&#160;et un temps d'exposition de 8 ms (et un binning de 2 x&#160;2 pixels afin de réduire la taille du fichier vidéo). Figure 1E montre l'orientation des vaisseaux rétiniens dans les autres panneaux de la figure. Toutes les images de la vidéo ne présenteront pas nécessairement une traînée fluorescen...

La microscopie intravitale peut être utilisée chez les animaux pour visualiser et mesurer les diamètres vasculaires rétiniens, les vitesses de la circulation sanguine et le flux sanguin rétinien total.

Mesures microscopie intravitale Vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer le flux sanguin rétinien chez la souris. Ceci est accompli en infusant d’abord des microsphères fluorescentes à travers la veine fémorale canulée d’une souris anesthésiée. La deuxième étape consiste à enregistrer sur vidéo les microsphères qui circulent dans les vaisseaux rétiniens de la souris.Ensuite, perférez du dextran fluorescent à travers la veine fémorale et capturez une vidéo pendant qu’il circule dans les vaisseaux rétiniens. La dernière étape consiste à mesurer les vitesses des microsphères et les diamètres des vaisseaux à partir des vidéos enregistrées pour un calcul du débit sanguin rétinien. L’un des principaux avantages de cette technique est la possibilité de mesurer avec précision le flux sanguin de la rétine à l’aide d’un microscope à fluorescence standard.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la rétine, telles que la mesure dans laquelle les changements dans le flux sanguin contribuent à la rétinopathie diabétique. Bien que nous démontrerons cette technique dans la rétine d’une souris. La méthode générale peut être utilisée dans d’autres tissus et également chez les rats.Soni

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Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Une évaluation de l&#39;hémodynamique hépatiques

L'imagerie à cellules vivantes des cellules sanguines marquées dans la circulation oculaire peut fournir des informations sur l'inflammation et l'ischémie dans la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Un protocole pour étiqueter les cellules sanguines et l'image des cellules marquées dans la circulation de la rétine est décrit.

Étiquetage des colorants fluorescents des érythrocytes et des leucocytes pour étudier la dynamique du flux dans la circulation de la rétine de la souris

Plusieurs maladies oculaires vision sont associés à des microvaisseaux rétiniennes dysfonctionnels. La mesure des réponses de l’artériole rétinienne est donc importante d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Cet article décrit un protocole détaillé pour souris arteriole rétinienne isolement et préparation pour évaluer les effets des substances vasoactives sur diamètre vasculaire.

Étapes de préparation pour la mesure de la réactivité chez les souris des artérioles rétiniennes Ex Vivo

Une approche vaisseau-fenêtre ouverte utilisant des traceurs fluorescents fournit une résolution suffisante pour la mesure du débit sanguin cochléaire (CoBF). La méthode facilite l’étude des changements structurels et fonctionnels du CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques.

Mesure du débit sanguin strial dans la cochlée de souris à l’aide d’une fenêtre vasculaire ouverte et d’une microscopie à fluorescence intravitale

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la préparation et la coloration par immunofluorescence de supports plats rétiniens de souris et l’analyse. L’utilisation de l’angiographie à la fluorescéine du fond d’œil (FFA) pour les petits de souris et le traitement d’images sont également décrits en détail.

Surveillance de la croissance dynamique des vaisseaux rétiniens dans un modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène

Cet article décrit un test de coloration à la lectine bien établi et reproductible pour l’ensemble des préparations rétiniennes de monture et les protocoles requis pour la mesure quantitative des paramètres vasculaires fréquemment modifiés dans les rétinopathies prolifératives et non prolifératives.

Quantification des paramètres vasculaires dans les rétines montagnards entières de souris atteintes de rétinopathies non prolifératives et prolifératives

Ici, nous présentons trois protocoles d’analyse de données pour les images d’angiographie à la fluorescéine (AF) et de tomographie par cohérence optique (OCT) dans l’étude de l’occlusion veineuse rétinienne (OVR).

In vivo Lecture des lésions vasculaires dans la rétine de souris pour favoriser la reproductibilité

Le système vasculaire rétinien de souris est particulièrement intéressant pour comprendre les mécanismes de formation des motifs vasculaires. Ce protocole mesure automatiquement le diamètre des vaisseaux rétiniens de souris à partir d’images de fond d’œil d’angiographie fluorescente à une distance fixe du disque optique.

Mesure du diamètre des vaisseaux rétiniens à partir d’images d’angiographie par fluorescence de souris

Découvrez une méthode de microscopie vidéo intravitale pour mesurer le débit sanguin rétinien chez la souris. Cette technique utilise des microsphères fluorescentes et du dextran pour quantifier précisément les diamètres vasculaires et les vitesses sanguines.

Mesures microscopie intravitale Vidéo de la rétine débit sanguin chez les souris

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