Collecte et analyse des

L'objectif général de cette procédure est de recueillir l'exsudat de flom provenant d'Arabidopsis ou d'autres plantes afin d'analyser ses composants ou de confirmer la présence de composés dans le flux de flom. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, on coupe le pétale et on l'incube dans du KCl-EDTA afin d'empêcher la fermeture du ou des éléments conducteurs. La deuxième étape consiste à rincer soigneusement le pétale pour éliminer tout résidu d'EDTA susceptible d'interférer avec les analyses ultérieures et de nuire aux cellules lors d'une exposition prolongée.

Ensuite, les exsudats de flux EM sont recueillis dans de l'eau. La dernière étape consiste à préparer les échantillons pour des analyses ultérieures par L-C-M-S-G-C-M-S gel, électrophorèse et chromatographie sur couche mince. En définitive, l'exsudation de phem facilitée par l'EDTA peut être utilisée pour analyser et confirmer la teneur en phem de métabolites et de lipides, de protéines ou d'ARN.

Les plantes ne peuvent pas échapper aux conditions défavorables. En conséquence, elles nécessitent des systèmes très efficaces et rapides pour transmettre les signaux environnementaux à travers toute la plante et réagir en modifiant leur développement. L'un de ces voies de signalisation est le flux végétal, dont la composition est assez complexe à comprendre.

Nous utilisons la sédation par flux facilitée par l'EDTA pour la collecte et l'analyse des contenus de flux. Elle a été initialement développée dans le Perilla par King, mais peut facilement être modifiée pour d'autres espèces. La procédure sera démontrée par Elena et US, deux étudiants de licence de mon laboratoire, avant le début de cette procédure.

Faire pousser des plants d'Arabidopsis pendant quatre à six semaines dans des chambres de croissance avec une période photopériodique de 12 heures le jour du prélèvement. Diluer la solution de potassium EDTA à 100 millimolaire préparée précédemment avec de l'eau pour obtenir une concentration finale de 20 millimolaire. Ensuite, remplir à moitié deux boîtes en verre de 7 à 15 centimètres de diamètre avec la solution de potassium EDTA à 20 millimolaire.

Lorsque terminé, remplir des tubes de réaction de 1,7 millilitre avec 1,4 millilitre de la solution de EDTA potassique 20 millimolaire. Ensuite, remplir un nombre égal de tubes de réaction avec 1,4 millilitre d'eau millipore. Après avoir retiré des plantes âgées de quatre à six semaines des chambres de croissance, récolter les feuilles en rosette en les coupant avec une lame de rasoir à la base du pétale, près du centre de la rosette.

Placer immédiatement les feuilles dans les boîtes contenant du EDTA de potassium à 20 millimolaire, en maintenant l'extrémité coupée des pétioles immergée dans la solution. Une fois que 15 feuilles ont été collectées à partir de trois à quatre plantes, les empiler délicatement les unes sur les autres de manière à aligner les extrémités coupées des pétioles. Recouper la base des pétioles et rouler doucement les feuilles.

Insérez ensuite délicatement les feuilles roulées dans l'un des tubes à réaction contenant de l'EDTA de potassium à 20 millimolaire pour la collecte de l'exsudat. Dans l'obscurité, tapissez le fond d'un grand plat peu profond avec des serviettes en papier humides. Placez le porte-échantillons contenant les tubes à réaction remplis de feuilles dans le plat, puis mettez l'ensemble dans un sac en plastique noir percé de fentes pour l'aération.

Placez ensuite l'ensemble dans un caisson pour la collecte de l'exsudat. Dans un récipient en plexiglas transparent, humidifiez la surface inférieure avec des serviettes en papier humides. Placez le porte-tubes contenant les feuilles et les tubes à réaction dans le récipient et fermez-le.

Une heure après avoir retiré le support du récipient, sortez les feuilles des tubes de réaction. Lavez soigneusement les feuilles avec de l'eau distillée afin d'éliminer tout l'EDTA. Transférez immédiatement les feuilles dans les tubes de réaction contenant de l'eau Millipore et replacez-les dans les récipients humidifiés pour la collecte des exsudats, après avoir retiré le support du récipient humidifié.

Cinq à huit heures plus tard, sortez les feuilles des tubes, puis congélez les exsudats de sève dans de l'azote liquide et stockez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour une analyse ultérieure le jour suivant, décongelez les échantillons en vue d'une analyse lipidique. Ensuite, prélevez deux à trois échantillons et ajoutez une quantité équivalente de chloroforme et de méthanol à la solution combinée.

Vortexez le mélange pendant quelques secondes. Ensuite, centrifugez l'échantillon pendant quatre minutes à 400 ×g. Une fois terminé, récupérez la phase organique inférieure dans un tube en verre après avoir répété la partition avec la phase supérieure trois fois supplémentaires, sèchez les phases organiques combinées sous un courant d'azote et soumettez-les à une analyse par chromatographie sur couche mince et par CLSV.

Cette méthode permet la récolte de quantités suffisantes d'exsudats phloémiens pour identifier les protéines localisées dans le phloème ainsi que les variations de leur concentration en réponse au développement ou au stress. Dans certains cas, les chercheurs peuvent souhaiter utiliser des inhibiteurs de protéinase afin d'éviter la dégradation des protéines. Comme illustré ici, les protéines sont présentes en très faible abondance, mais leur niveau est néanmoins suffisant pour permettre des expériences ultérieures de protéomique.

L'utilisation de la LC-MS ou des résultats d'analyses par immunotransfert chez les cucurbitacées suggère que la section du TIGE entraîne une perturbation de l'équilibre du potentiel hydrique et une entrée subséquente d'eau ainsi que de contaminants éventuels provenant de l'alast. Toutefois, des durées de collecte variant de une à huit heures n'affectent pas le profil et la composition en protéine M dans InOpSys. La quantité de protéines recueillies ainsi que le profil des protéines identifiées varient selon les espèces et les traitements.

En conséquence, les signaux protéiques peuvent être visualisés, identifiés et suivis. Les ARNm et les microARN peuvent également être identifiés dans les exsudats phloémiens par cette méthode. Toutefois, un traitement avec un inhibiteur d'ARN est nécessaire pour prévenir la dégradation de l'ARN pendant la durée prolongée d'exsudation.

Étant donné que les éléments C ne contiennent pas de chloroplastes fonctionnels, les ARNm des sous-unités petite ou grande de la rubis peuvent être utilisés comme contrôles négatifs, tandis qu'un ARNm localisé dans la sève phloémienne connu, comme celui de l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine, peut servir de contrôle positif. De même, les sucres ou les petits métabolites peuvent être analysés par GC-MS ou LC-MS. Il convient de noter que les exsudats phloémiens contiennent un grand nombre d'enzymes fonctionnelles, incluant presque l'ensemble de la voie glycolytique.

Par conséquent, l'utilisation de plusieurs points temporels peut révéler les processus métaboliques durant la collecte des exsudats. Dans tous les exsudats, le sucrose est le métabolite le plus abondant. Cela est particulièrement évident après une collecte d'une heure.

Cependant, après cinq heures, le rapport entre le saccharose et le fructose est légèrement réduit. Si le même exsudat est collecté pendant une heure, puis laissé au banc pendant quatre heures supplémentaires, le rapport entre le saccharose et le fructose est réduit dans une bien plus grande mesure. Cela suggère que des enzymes actives présentes dans les exsudats phloémiens entraînent la dégradation du saccharose à température ambiante.

En outre, le fait qu'une collecte continue pendant cinq heures montre seulement une légère réduction du rapport saccharose à fructose est compatible avec les observations selon lesquelles le chargement du phloème et le transport de molécules depuis les cellules compagnes vers les éléments conducteurs peuvent se poursuivre pendant l'exsudation, jusqu'à ce que le système perde sa vitalité. Les lipides présents dans les exsudats phloémiens, et par extension la signalisation lipidique à longue distance, constituent un domaine d'intérêt assez récent en biologie végétale. En raison de leur nature hydrophobe, les lipides ne sont présents qu'à de faibles concentrations et peuvent être liés à d'autres molécules pour en assurer la solubilisation.

Pourtant, l'exsudation facilitée par l'EDTA permet de recueillir suffisamment de matériel pour visualiser et identifier les flux et les lipides provenant de plusieurs espèces végétales. Comme illustré ici, il est possible de séparer plusieurs espèces lipidiques par chromatographie sur couche mince. La LC-MS permet d'identifier différentes espèces lipidiques et de suivre les modifications des profils lipidiques entre différents génotypes ou traitements.

Cela permet l'étude du rôle des lipides au cours du développement végétal et de la réponse au stress. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que trois heures si elle est effectuée correctement. Toutefois, pour la plupart des échantillons, nous recommandons un temps de collecte de cinq à huit heures.

Dans ce cas, il est recommandé de commencer la récolte des feuilles tôt le matin. Ce protocole peut être modifié pour d'autres plantes et peut conduire à la découverte ou à la confirmation de nouveaux composés mobiles. Lors de la réalisation de ce protocole, il est important de surveiller attentivement les exsudats foliaires après la première heure afin de retirer l'EDTA, et de ne pas presser les feuilles afin d'éviter toute contamination par le contenu d'autres cellules.

En outre, le port de gants protège également vos échantillons contre les contaminants que vous pourriez introduire depuis votre peau. Pour prévenir la contamination, utilisez les contrôles appropriés pour les échantillons de protéines, d'ARN ou de métabolites. Les contrôles suggérés sont indiqués dans le protocole textuel. Cette méthode nous a permis d'obtenir de nouvelles perspectives sur la composition du flux végétal.

Nous avons pu identifier plusieurs lipides dans l'exsudat de la forme, qui n'étaient pas attendus dans l'environnement aqueux du sol. Cela nous a amenés, ainsi que d'autres chercheurs, à introduire le concept de signalisation lipidique à longue distance, qui s'est désormais développé en un domaine de recherche novateur et passionnant sur l'implantation.