Collecte et analyse des Arabidopsis Phloème exsudats Utilisation de la méthode EDTA-animé

L’objectif global de cette procédure est de collecter l’exsudat de flom d’Arabidopsis ou d’autres plantes afin d’analyser son contenu ou de confirmer la présence de composés dans le flux de flom. Ceci est accompli en coupant et en incubant d’abord le pétale dans de l’EDTA de potassium pour éviter le scellement de l’élément marin. La deuxième étape consiste à laver soigneusement le pétale pour éliminer tout EDTA restant qui peut interférer avec l’analyse ultérieure et endommager les cellules lors d’une exposition à long terme.

Ensuite, les exsudats EM du flux sont collectés dans l’eau. La dernière étape consiste à préparer des échantillons pour une analyse ultérieure par gel L-C-M-S-G-C-M-S, électrophorèse et chromatographie sur couche mince. En fin de compte, l’exsudation de phéms facilitée par l’EDTA peut être utilisée pour analyser et confirmer les teneurs en phéms comme les métabolites et les lipides, les protéines ou les ARN.

Les plantes ne peuvent pas échapper aux conditions défavorables. En conséquence, ils nécessitent des systèmes très efficaces et rapides pour transmettre des signaux environnementaux dans toutes les usines et répondre en modifiant le développement. L’une de ces voies de signalisation est le flux végétal, dont la composition est assez complexe à comprendre.

Nous utilisons la sédation de flux facilitée par l’EDTA pour la collecte et l’analyse du contenu de l’écoulement. Il a été développé à l’origine à Perilla par le roi et peut facilement être modifié pour d’autres espèces. La démonstration de la procédure sera faite par Elena et US, toutes deux étudiantes de premier cycle de mon laboratoire, avant de commencer cette procédure.

Grow Arabidopsis prévoit de passer quatre à six semaines dans des chambres de croissance avec une période photo de 12 heures le jour de la collecte. Dilué préalablement préparé une solution d’EDTA de 100 millimolaires de potassium avec de l’eau pour donner une concentration finale de 20 millimolaires. Ensuite, remplissez à moitié deux plats en verre de sept à 15 centimètres de diamètre avec la solution EDTA de potassium de 20 millimolaires.

Lorsque vous avez terminé, remplissez des tubes de réaction de 1,7 millilitre avec 1,4 millilitre de la solution EDTA de potassium de 20 millimolaires. Remplissez ensuite un nombre égal de tubes de réaction avec 1,4 millilitre d’eau millipore. Après avoir retiré les plantes de quatre à six semaines des chambres de croissance, récoltez les feuilles de la rosette en les coupant avec une lame de rasoir à la base du pétale près du centre de la rosette.

Placez immédiatement les feuilles dans les plats contenant 20 millimolaires d’EDTA de potassium avec l’extrémité coupée de la personne immergée dans la solution. Une fois que 15 feuilles ont été récoltées sur trois à quatre plantes, empilez-les doucement les unes sur les autres de sorte que les pétales coupés soient alignés les uns avec les autres. Coupez à nouveau la base des pétales et roulez doucement les feuilles.

Ensuite, insérez doucement les feuilles roulées dans l’un des tubes réactionnels contenant 20 millimolaires d’EDTA de potassium pour la collecte de l’exsudat. Dans l’obscurité, alignez le fond d’un grand plat peu profond avec du papier absorbant humide. Placez la grille avec les tubes de réaction remplis de feuilles dans le plat et placez-la dans un sac en plastique noir avec des fentes pour l’aération.

Placez ensuite l’ensemble de l’installation dans une armoire pour la collecte de l’exsudat. Dans la lumière, alignez le fond d’un récipient en plexiglas transparent avec des serviettes en papier humides. Placez le support avec les tubes de réaction remplis de feuilles dans le récipient et fermez-le.

Après avoir retiré le support du récipient, une heure plus tard, sortez les feuilles des tubes de réaction. Lavez soigneusement les feuilles avec de l’eau distillée pour éliminer tout l’EDTA. Transférez immédiatement les feuilles dans les tubes réactionnels contenant de l’eau milliporeuse et remettez-les dans les récipients humidifiés pour la collecte des exsudats après le retrait du support du récipient humidifié.

Cinq à huit heures plus tard, sortez les feuilles des tubes, puis congelez les exsudats d’écoulement dans de l’azote liquide et stockez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour une analyse plus approfondie le lendemain, décongelez les échantillons en vue de l’analyse des lipides. Ensuite, prélevez deux à trois échantillons et ajoutez une quantité égale de chloroforme et de méthanol à la solution combinée.

Agitez le mélange pendant quelques secondes. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant quatre minutes à 400 g. Une fois terminé, collectez la phase organique inférieure dans un tube de verre après avoir répété la partition avec la phase supérieure, trois fois de plus, séchez les phases organiques combinées sous un flux d’azote et soumettez-les à la chromatographie sur couche mince et à l’analyse LCMS.

Cette méthode permet de récolter suffisamment d’exsudats de phém pour identifier les protéines localisées de phém et les changements de leur niveau en réponse au développement ou au stress. Dans certains cas, les chercheurs peuvent vouloir utiliser des inhibiteurs de protéinase pour prévenir la dégradation des protéines. Comme le montre ici, les protéines sont en très faible abondance, mais leur niveau est suffisamment élevé pour des expériences de protéomique ultérieures.

L’utilisation du LCMS ou de l’analyse par transfert Western chez les cucurbitacées suggère que la coupe de la tige entraîne une perturbation de l’équilibre du potentiel hydrique et un afflux subséquent d’eau et de contaminants possibles provenant de l’aile. Cependant, la collecte pendant des périodes allant d’une à huit heures n’affecte pas le profil et la composition de la protéine M d’InOpSys. La quantité de protéines collectées et le modèle de protéines trouvées varient selon les espèces et les traitements.

En conséquence, les signaux protéiques peuvent être visualisés, identifiés et suivis. L’ARNm et les microARN peuvent également être identifiés dans les exsudats de flom par cette méthode. Cependant, un traitement par inhibiteur d’ARN est nécessaire pour prévenir la dégradation de l’ARM. NA pendant la période d’exsudation prolongée.

Étant donné que les éléments C ne contiennent pas de chloroplastes fonctionnels, le rubis, les ARNm de petites ou de grandes sous-unités peuvent être utilisés comme contrôles négatifs, tandis que les ARNm localisés au pH connu comme l’enzyme conjuguée à l’ubiquitine peuvent être utilisés comme contrôle positif. De même, les sucres ou les petits métabolites peuvent être analysés à l’aide du GCMS ou du LCMS. Il convient de mentionner que les exsudats de phém contiennent un grand nombre d’enzymes fonctionnelles, y compris la quasi-totalité de la voie glycolytique.

Par conséquent, l’utilisation de plusieurs points temporels peut révéler des processus métaboliques lors de la collecte de l’exsudat. Dans tous les exsudats, le saccharose est le métabolite le plus abondant. C’est le plus évident après une collecte d’une heure.

Cependant, après cinq heures, le rapport saccharose/fructose est légèrement réduit. Si le même exsudat est recueilli pendant une heure, puis laissé sur le banc pendant quatre heures supplémentaires, le rapport saccharose/fructose est réduit dans une mesure beaucoup plus importante. Suggérant que les enzymes actives dans les exsudats de phém conduisent à la dégradation du saccharose à température ambiante.

De plus, le fait que la collecte continue pendant cinq heures ne montre qu’une légère réduction du rapport saccharose/fructose est cohérent avec les résultats selon lesquels la charge de phéms et le transport de molécules des cellules compagnes vers les éléments marins peuvent se poursuivre pendant l’exsudation jusqu’à ce que le système perde sa vitalité. Les lipides dans les exsudats de phèmes et, par extension, la signalisation lipidique à longue distance sont un domaine d’intérêt assez récent en sciences végétales. En raison de leur nature hydrophobe, les lipides ne sont présents qu’à de faibles concentrations et peuvent être liés à d’autres molécules pour la solubilisation.

Pourtant, l’exsudation facilitée par l’EDTA permet de collecter suffisamment de matériel pour visualiser et identifier le flux et les lipides de plusieurs espèces végétales. Comme le montre ici, il est possible de séparer plusieurs espèces lipidiques à l’aide de la chromatographie sur couche mince. Le LCMS permet d’identifier différentes espèces lipidiques et de suivre les changements dans les profils lipidiques de différents génotypes ou traitements.

Cela permet d’étudier le rôle des lipides au cours du développement des plantes et de la réponse au stress. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée et aussi peu que trois heures si elle est exécutée correctement. Cependant, pour la plupart des échantillons, nous suggérons un temps de collecte de cinq à huit heures.

Dans ce cas, il est recommandé de commencer tôt le matin la récolte des feuilles. Cette procédure peut être modifiée pour d’autres plantes et peut conduire à la découverte ou à la confirmation de nouveaux composés d’écoulement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller attentivement les PDL après la première heure pour éliminer l’EDTA et de ne pas presser les feuilles pour éviter la contamination avec le contenu d’autres cellules.

De plus, le port de gants protège également vos échantillons des contaminants que vous pourriez introduire à partir de votre peau. Pour éviter la contamination, utilisez les contrôles appropriés pour les échantillons de protéines, d’ARN ou de métabolites. Les contrôles suggérés sont répertoriés dans le protocole texte. Cette méthode nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur la composition du flux végétal.

Nous avons pu identifier plusieurs lipides au sein de la forme exsudat, ce qui n’était pas prévu dans l’environnement aqueux du sol. Cela nous a amenés, ainsi que d’autres, à introduire le concept de signalisation lipidique à longue distance, qui s’est maintenant transformé en une nouvelle recherche passionnante sur les implants.