Name: Dissection de Xenopus laevis Crête neurale pour In vitro Culture explantation ou In vivo Transplantation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez la dissection de la crête neurale de Xenopus laevis pour étudier la migration cellulaire in vitro et in vivo. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes du développement embryonnaire vertébré.

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Les auteurs remercient Adeline Dolly pour les photos de expiant sur la fibronectine, Eric Theveneau pour des discussions utiles et dans les animaleries de l&#39;Institut Curie. CM est un stage postdoctoral de la Région Ile de France (Domaine d&#39;Intérêt Majeur souches Pole), Université Paris Sud (Attaché Temporaire d&#39;Enseignement et de Recherche), et l&#39;Agence Nationale de la Recherche. Ce travail a été financé par l&#39;Université Paris Sud (Attractivité 2011), le Centre National de la Recherche Scientifique (Programme d&#39;Action Thématique et Incitative), Association pour la Recherche contre le cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le cancer, et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

Les expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l&#39;échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement. Une. Préparation de plats fibronectine 14 <ol><li> Introduire à la pipette 500 ml de 10 mg / ml de fibronectine culture primaire dilué dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) dans une boîte de Petri en plastique standard (Ø 40 x 11 mm). Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: si vous utilisez des plats en verre ou des lamelles de verre pour l&#39;imagerie ultérieure, utiliser un / ml solution fibronectine de 100 mg. </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x. </li><li> Remplacer PBS avec 500 ml de 1 x PBS contenant 0,1% albumine de sérum bovin (BSA). Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Rincer trois fois avec PBS 1x. </li><li> Remplissez avec PBS 1x et conserve à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation (généralement pendant 24-48 h). </li></ol> 2. Dissection des explants NC &lt;ol&gt; <li> Préparer 3/4 normale amphibie moyen (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM d&#39;EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamycine 10,15). Ne gardez pas plus de 1 semaine pour la dissection, conserver à 4 ° C. NAM plus ancien peut être utilisé pour la préparation de plats de dissection agarose revêtu (ci-dessous). </li><li> Préparer 60 mm boîtes de Pétri pour la dissection, revêtues avec 10 ml d&#39;agarose à 2% dans 3/4 NAM. </li><li> Récupérer des outils de dissection: pipettes Pasteur en plastique, une broche plus beaux insectes monté sur support de broche (voir le tableau des matériaux pour la référence), un &quot;couteau de sourcil&quot; (en poils de sourcils inclus dans la paraffine à l&#39;extrémité d&#39;une pipette Pasteur en verre 16), deux beaux pinces à dissection, P1000 pipette et des conseils, un stéréoscope binoculaire avec un grossissement 8-40X à 50, une source de lumière brillante avec des guides de fibres optiques. Tous les outils de dissection doivent être maintenus propres, après chaque expérience, les rincer deux fois avec de l&#39;eau distillée, une fois with 100% d&#39;éthanol et laisser sécher. Conserver à l&#39;abri de la poussière. </li><li> Remplissez le plat de dissection avec NAM frais presque au sommet. </li><li> Obtenir X. laevis embryons selon les procédures standard 10 et les vieillir jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent neurula étape 16 (selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement 17). </li><li> Placez étape 16 embryons dans le plat de dissection à l&#39;aide de la pipette Pasteur en plastique. </li><li> Effectuer toutes les étapes ultérieures dans le cadre du champ binoculaire. Retirer la membrane vitelline avec deux paires de pinces. Veillez à ne pas endommager la partie dorsale de l&#39;embryon. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que les embryons ont atteint le stade 17 pour commencer la dissection. Etape 17 est approprié depuis la crête neurale est clairement mis à part le tube neural, contrairement aux étapes précédentes. Après l&#39;étape 17, NC commence la migration et se mêlant à la mésenchyme environnant. </li><li> Creusez un petit trou dans l&#39;agarose avec des pinces pour faire un créneau pour les embryons afin de maintenireux au cours de la dissection. Placez un embryon dorsale vers le haut. Remarque: la pâte à modeler peut être utilisé pour maintenir les embryons de creuser un trou à la place dans l&#39;agarose. </li><li> Faire une incision dans la partie latérale du pli neural antérieur avec le couteau à sourcils et l&#39;axe d&#39;insecte. Veillez à ne pas aller trop loin dans l&#39;embryon: viser à couper à travers 2-3 couches de cellules (jamais atteindre le plus profond que le archenteron!). Pendant tout le processus de dissection, ne laissez jamais les tissus disséqués pour entrer en contact avec l&#39;interface air-liquide depuis X. tissus embryonnaires laevis sont lysées par la tension superficielle. </li><li> Faire un deuxième incision parallèle dans la partie la plus dorsale du pli de neurones en utilisant les mêmes instruments. </li><li> Si nécessaire, tourner le plat autour de 90 °. Faire une troisième incision avec le couteau perpendiculaire à sourcils et l&#39;axe d&#39;insecte, à la face postérieure des deux premières incisions. Le NC est une masse épaisse de cellules sous la couche externe pigmentée de l&#39;ectoderme, latéraldans le tube neural. </li><li> Utilisez la pointe du couteau de sourcil de détacher la couche pigmentée de l&#39;ectoderme NC sous-jacent, à partir du troisième bord de l&#39;incision. </li><li> Utiliser le côté du couteau de sourcil pour détacher le tissu NC partir de la troisième incision. Le tissu NC est plutôt grisâtre, tandis que le mésoderme céphalique sous-jacente est blanc. Séparez délicatement le NC du mésoderme. </li><li> Détachez le tissu NC antérieure de la vésicule optique, et couper à ce niveau pour libérer l&#39;expiant. Comme un contrôle de premières expériences, contrôle l&#39;expression de snail2 (un marqueur NC canonique) dans certains explants par hybridation in situ est recommandée. </li></ol> 3. Les explants de placage sur la fibronectine <ol><li> Remplissez le plat de fibronectine avec modification Danilchick moyen (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K gluconate de 4,5 mM, Na gluconate de 32 mM, MgSO 4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, ajuster le pH à 8,3 avec 1 M Bicine <sup&gt; 18). </li><li> Transférer les explants dans le plat de la fibronectine revêtu à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. Ne laissez jamais les explants de toucher l&#39;interface air-liquide. Tout d&#39;abord, la pipette du liquide dans la pointe, puis les explants, puis certains nouveau liquide. Ne pas permettre à l&#39;air dans la pointe tout en transférant les explants dans le plat de fibronectine. Une fois la pointe est à l&#39;intérieur du liquide de la boîte de fibronectine, laisser les explants vont lentement par gravité, ou pousser très doucement. Évitez d&#39;éjecter les explants trop vite. </li><li> Placez 10-30 explants dans le plat à l&#39;aide du couteau de sourcil. Éviter les parois de la capsule, qui ne sont pas adéquats pour l&#39;imagerie ultérieure. </li><li> Essayez de ne pas déplacer l&#39;antenne jusqu&#39;à ce que les explants ont attaché sur la fibronectine (cela prend environ 15-30 min). Si nécessaire, déplacez le plat très attentivement. </li><li> Placer le plat dans un incubateur réfrigéré (entre 15-20 ° C, pour le graphique de température voir 17). Lorsqu&#39;il est placé à 15 ° C, les cellules are la migration en général de manière efficace et de diffusion après 6 heures d&#39;incubation (ce calendrier peut varier entre les expériences). </li></ol> 4. Greffage explants dans des embryons d&#39;accueil <ol><li> Coupez une lamelle de verre bien en très petits morceaux à l&#39;aide de pinces grossières. La taille des pièces doit être d&#39;environ 1,5 mm 2. Plongez les morceaux dans une boîte de Pétri contenant 3/4 NAM ou PBS en utilisant une pince. </li><li> Préparation de l&#39;embryon hôte: disséquer l&#39;hôte NC à 3/4 NAM comme décrit dans 3) avec un soin particulier à ne pas endommager l&#39;embryon hôte tout en enlevant la membrane vitelline et la dissection du NC. La tension du tissu tend à augmenter la taille de l&#39;ablation: laisser l&#39;embryon hôte soigne partiellement tout en disséquant le donneur d&#39;embryon. </li><li> Dans un autre plat d&#39;agarose revêtues ou dans une autre partie du même plat, disséquer l&#39;expiant NC de l&#39;embryon donneur tel que décrit dans le protocole 3. Transférer la greffe NC dans le plat contenant l&#39;hôte avec soin, comme décrit dansProtocole 3. </li><li> Placer immédiatement l&#39;expiant NC sur la zone d&#39;ablation hôte en utilisant une pince. L&#39;explantation devrait fixer partiellement. Placer un morceau de lamelle de verre sur l&#39;embryon greffé à maintenir la greffe en place. Choisir un morceau de verre plus grand que l&#39;embryon pour éviter de l&#39;endommager. L&#39;embryon sera un peu aplatie. </li><li> Attendez au moins 15-20 minutes, puis retirez délicatement la lamelle. Que l&#39;embryon récupérer pendant 10 min et la pipette avec précaution dans un plat propre rempli de 3/4 NAM, en utilisant la pipette Pasteur en plastique. </li></ol>

<ol><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+of+the+signaling+pathways+directing+neural+crest+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+at+the+neural+plate+border+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates.</a> Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).</li>
<li>Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+neural+crest+specification+and+migration%3A+lessons+from+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).</li>
<li>Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bases+of+Human+Neurocristopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Crest+Induct.+Different%22%5BJournal%5D)">Molecular Bases of Human Neurocristopathies.</a> Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians.+Part+II.+Differentiation+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians+Part+I.+Induction+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).</li>
<li>Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li>
<li>Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo%2C+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li>
<li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li>
<li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis.</a> , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B15%CE%B21+supports+the+migration+of+Xenopus+cranial+neural+crest+on+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin.</a> Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li>
<li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+the+RhoU%2FWrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Neural+Crest+Induction%2C+Melanocyte+Specification%2C+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs.%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li>
<li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li>
<li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li>
<li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li>
<li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li>
<li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li>
<li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une technique facile à explantation prémigratoire crânienne NC dans X. laevis embryons. Les embryons utilisés pour de telles expériences doivent être robustes et bien guérir. Jetez un lot d&#39;embryons malsaines. En outre, les embryons se développer à des températures différentes (de 12 à 18 à 20 ° C), afin d&#39;exciser la crête neurale, à l&#39;étape 17 et pas plus tard. Après l&#39;étape 17, la crête neurale peut être mélangé avec du mésoderme céphalique et ne peut pas être complètement ...

La crête neurale (NC) est une population de cellules embryonnaires transitoires qui se dégage du tube neural à la fin de la neurulation dans des embryons de vertébrés. Les événements de signalisation et génétiques qui contrôlent la spécification NC commencent dès la gastrulation. Le NC est spécifié à la frontière entre le neural et ectoderme non-neural par des signaux provenant de tissus dorsaux environnantes. A la fin de la neurulation, les cellules subissent une transition NC épithélium-mésenchyme à-(EMT) et migrent en détail dans la suite de l&#39;embryon routes stéréotypés en répondant à des signaux de guidage entourant. Une fois qu&#39;ils ont atteint leur destination finale, ils se différencient en une vaste gamme de produits dérivés, par exemple les neurones, les cellules gliales, les os, le cartilage et les cellules pigmentées 1-5. En raison de leur contribution à de nombreux types de cellules et de tissus embryonnaires, les défauts à toute étape du développement des cellules NC, de l&#39;induction de la différenciation finale, peut provoquer des syndromes congénitaux nommés neurocristopathies 6. Emanipulation Xperimental de la NC en développement à différents stades - Spécification, EMT, de migration et de différenciation - permettra d&#39;améliorer notre compréhension de neurocristopathies et permettre la conception de stratégies thérapeutiques potentielles. L&#39;embryon de Xenopus laevis est un modèle de choix pour étudier le développement NC. Un grand nombre d&#39;embryons sont faciles à obtenir, et la fécondation externe donne accès aux toutes premières étapes du développement. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement X. laevis développement embryonnaire. Gain de fonction et knockdown gène sont faciles à effectuer par micro-injection de cellules individuelles de début blastulas. Tissus embryonnaires peuvent être coupés pour réassociation in vitro 7-11 ou tests de back-greffes 12,13. Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer prémigratoire crânienne NC dans X. laevis neurulas fin, avant la migration. Ces explants peuvent être cultivées sur fibronectine coateplaques d pour étudier la migration et la différenciation en contrôlées in vitro conditions expérimentales. NC explants peuvent également être greffés sur des embryons normaux de l&#39;hôte ou manipulées pour étudier leur migration et la différenciation in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fibronectine du plasma bovin</td><td>Sigma</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, fraction V</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td> Une <td>qualité inférieure peut convenir à cette application</td></tr><tr><td>Épingles à insectes en acier inoxydable, taille 000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection de<em&gt; xenopus laevis</em&gt; crête neurale pour<em&gt; in vitro</em&gt; culture explantation ou<em&gt; in vivo</em&gt; transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

La crête neurale (NC) est une population de cellules du tube neural dorsal transitoire qui subit une transition épithélium-à-mésenchyme (EMT) à la fin de la neurulation, migre beaucoup vers divers organes, et se différencie en de nombreux types de produits dérivés (neurones, cellules gliales, cartilage et l&#39;os, les cellules pigmentées et endocriniens). Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer la prémigratoire crânienne NC de Xenopus laevis embryons, afin d&#39;étudier le développement NC in vivo et in vitro. Le modèle de grenouille offre de nombreux avantages pour étudier le développement précoce; lots abondantes sont disponibles, les embryons se développent rapidement, le gain in vivo et la perte de stratégies de fonctions permettent la manipulation de l&#39;expression des gènes avant NC dissection chez le donneur et / ou embryons hôtes. Les explants CN peuvent être plaqués sur la fibronectine et utilisés pour des études in vitro. Elles peuvent être mises en culture pendant plusieurs jours dans un milieu défini sans sérum. Nous décrivons également comment greffer NC explants de retourdans des embryons d&#39;accueil pour l&#39;étude de la migration et la différenciation NC in vivo.

Lorsque plaqué sur la fibronectine, les explants de la crête neurale attachent rapidement (15-30 min) et l&#39;expiant propage à plat dans 2 heures (figure 1A). Après 3-6 cellules h commencent à se disperser. À 24 heures à 15 ° C, de nombreuses cellules ont commencé à migrer loin de l&#39;explant (Figures 1B et 1C). Jaune rend les cellules très lumineux sous contraste de phase (figure 1B). protubérances cellulaires (filopodes et lamellipodes) sont clair...

Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d&#39;étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.

Dissection de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crête neurale pour<em&gt; In vitro</em&gt; Culture explantation ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

L'objectif général de la procédure suivante est de suivre la migration des cellules de la crête neurale opus Lavis. Cela est réalisé en dissociant d'abord les crêtes neurales d'embryons au stade neural. Dans une deuxième étape, les explants sont mis en culture dans une boîte revêtue de fibronectine afin d'étudier leur migration cellulaire in vitro.Alternativement, après l'ablation de la crête neurale d'un embryon hôte, des explants peuvent être greffés à nouveau afin de suivre leur migration in vivo. En définitive, on peut étudier la contribution de la migration des cellules de la crête neurale embryonnaire au développement de l'opus lavis. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car les embryons précoces sont fragiles.La crête neurale est une population cellulaire relativement restreinte, et vous devez fabriquer vos propres outils de dissection. La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle. Chaque étape du processus de dissection a été optimisée afin de garantir un prélèvement complet et précis de la crête neurale.Le jour de l'expérience, prenez une boîte de dissection de 60 millimètres recouverte d'environ 10 millilitres

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Des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; Xenopus laevis</em

Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l'élévation des plis...

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

Ici, nous développons les outils nécessaires...

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Cette vidéo illustre une technique permettant d’isoler les plis neuraux crâniens de la région du mésencéphale des embryons de poulet. Il présente un processus de dissection détaillé des plis neuraux, leur placement et leur fixation sur des lamelles recouvertes de fibronectine, suivi de l’observation de la migration des cellules de la crête neurale à partir des plis neuraux.

Isolement des plis neuraux crâniens d’un embryon de poulet pour une culture cellulaire de crête neurale

Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui...

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Une technique de transplantation de "Extreme antérieur domaine" mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d'un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l'étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d'interactions entre les régions du visage de signalisation.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Dans les embryons de xénope, les cellules du toit du blastocèle sont pluripotentes et peuvent être programmées pour générer divers tissus. Ici, nous décrivons des protocoles permettant d’utiliser des explants de toit de blastocèle d’amphibiens comme système de test pour étudier les principales caractéristiques in vivo et in vitro du développement neuronal précoce.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

La transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) permet aux cancers de devenir invasifs. Pour étudier l’EMT, un modèle in vitro basé sur des cellules souches neurales (NSC) dépourvu de sérum et d’enzymes est décrit. Ce système standardisé permet une évaluation quantitative et qualitative de la migration cellulaire, de l’expression des gènes et des protéines. Le modèle est adapté à la découverte de médicaments.

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Ce protocole décrit la dissection et la culture des cellules de crête neurale crânienne des modèles de souris, principalement pour l'étude de la migration cellulaire. Nous décrivons les techniques d'imagerie en direct utilisées et l'analyse des changements de vitesse et de forme cellulaire.

Dissection, culture et analyse des cellules neurales primaires de crête neurale de la souris pour l'étude de la délamination et de la migration neurales de cellules de crête

Nous présentons un protocole en deux parties qui combine l’imagerie fluorescente de calcium avec l’hybridation in situ, permettant à l’expérimentateur de corréler des modèles de l’activité de calcium avec des profils d’expression de gène sur un niveau unicellulaire.

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Découvrez la dissection de la crête neurale de Xenopus laevis pour étudier la migration cellulaire in vitro et in vivo. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes du développement embryonnaire vertébré.

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