Name: Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Découvrez le montage multicouche pour la microscopie à feuille de lumière in vivo de longue durée chez Danio rerio. Cette méthode permet d'observer le développement embryonnaire sur plusieurs jours avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

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Nous remercions la Société Max Planck, le Human Frontier Science Program (HFSP) et le Fonds Boehringer Ingelheim pour le financement et le soutien.

Une. Préparation du matériel <ol><li> Préparation de tubes FEP <ol><li> Nettoyez le tube FEP (figure 2A) par rinçage liquides (dans les étapes indiquées ci-dessous) à travers le tube et en utilisant une seringue attachée avec une extrémité émoussée canule (figure 2B) Note 1:.. Utiliser des gants tout au long de la procédure Note 2: Nous recommandons couper le tube en morceaux de ca. 1 m de longueur et de nettoyage celles en parallèle. <ol><li> Rincer d&#39;abord le tube avec 1 M NaOH à plusieurs reprises. Puis transférer le tube à un tube à centrifuger de 50 ml rempli de NaOH 0,5 M et ultrasonicate pendant 10 min. </li><li> Transférer le tube de polymère à un petit bassin avec le trou DDH 2 O. Rincer le premier tube avec le trou DDH 2 O et ensuite avec 70% EtOH. </li><li> Par la suite transférer le tube FEP dans un tube de centrifugeuse frais avec 70% EtOH. Encore une fois ultrasonicate ce tube à centrifuger pendant 10 min. </li></ol></li><li> Couper le tube FEP nettoyé en morceauxd&#39;environ 3 cm (une longueur typique pour une utilisation dans le montage de poisson zèbre et imagerie) et redresser si nécessaire. Stockez les tubes FEP nettoyés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml frais rempli de trou DDH 2 O (figure 2C). </li></ol></li><li> Préparation de Tricaine solution stock <ol><li> Préparer la solution Tricaine des stocks de 0,4% en dissolvant 400 mg Tricaine (MS-222) dans le trou DDH 2 97,9 ml O. Après la dissolution complète de la poudre, ajuster le pH à 7,0 en utilisant 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9,0). Protéger la solution de la lumière. aliquotes de conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Préparation de 3% de méthylcellulose <ol><li> Préparer une solution de méthylcellulose à 3% pour le revêtement intérieur des tubes FEP comme décrit ci-dessous. Chauffer E3 11 dans une bouteille en verre à environ 60 à 70 ° C et ajouter la quantité appropriée de poudre de méthylcellulose. Ajouter une barre d&#39;agitation et agiter à 4 ° C. Dès que la solution est refroidie en dessous de 30 ° C, ajouter la solution à un Tricaine c finaleoncentration de 100 mg / L. Gardez en remuant à 4 ° C pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparation de 1,5% et 0,1% d&#39;agarose dans E3 <ol><li> Dissoudre la quantité appropriée de poudre d&#39;agarose à bas point de fusion dans un volume défini d&#39;E3 dans un flacon en verre. Chauffer le mélange dans un micro-ondes et le secouer de temps en temps, jusqu&#39;à ce que la solution d&#39;agarose apparaît homogène, sans cristaux restants. </li><li> Préparer aliquotes de 1 ml de solution d&#39;agarose à 0,1% dans 1,5 ml de tubes de réaction. Les aliquotes peuvent être stockées à 4 ° C. </li><li> Utiliser la solution à 1,5% de revêtir une boîte de Pétri en matière plastique. L&#39;épaisseur de la couche d&#39;agarose doit être ca. 2 mm. Après l&#39;agarose est solidifiée, ajouter du milieu E3 sur le dessus de la couche pour l&#39;empêcher de sécher. Le plat revêtu peut être stocké à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparation de poisson-zèbre <ol><li> Gardez le poisson zèbre (Danio rerio) adultes et d&#39;embryons à 28,5 ° C et de les gérer selon les protocoles établis 11,12. </li><li> Mettre en place le poisson mâle et femelle dans l&#39;après-midi et les séparer à l&#39;aide d&#39;un diviseur. Enlevez le séparateur, le lendemain matin à autre l&#39;accouplement des poissons. </li><li> Recueillir les embryons dans un plat rempli d&#39;E3 et de les examiner à l&#39;aide d&#39;un microscope stéréoscopique. </li><li> À 24 HPF (ou le stade de développement de votre intérêt), sélectionnez l&#39;embryon de poisson zèbre pour l&#39;expression de la fluorescence et de transférer les aspects positifs à un nouveau plat avec E3 frais. </li><li> Dechorionate attentivement les embryons en utilisant deux pinces acérées (figures 2D et 2E). Utilisez les premières pinces pour saisir et tenir le chorion et la deuxième pince pour arracher ouverte et retirer Note 1:. Effectuez cette étape à l&#39;aide d&#39;une loupe binoculaire. </li></ol></li></ol> 2. Multicouche de montage <ol><li> Revêtement du tube de FEP <ol><li> Attacher une extrémité canule émoussée à une seringue. Insérez la canule attentivement pendant environ 3 mm à une extrémité d&#39;un nettoyage et couper le morceau de. Tubes FEP (figures 2F et 2G) Note 1: Utiliser des gants et éviter toute flexion ou compression du tube. </li><li> Trempez l&#39;extrémité libre du tube FEP dans 3% de méthylcellulose et remplir le tube avec la solution. </li><li> Relâchez lentement la méthylcellulose en poussant sur la seringue. Jeter la solution. </li><li> Répétez les étapes 2.1.2 et 2.1.3 en utilisant E3 Note 1:. Les tubes revêtus doivent être utilisés pour le montage immédiatement. </li></ol></li><li> Transfert du poisson zèbre à l&#39;agarose <ol><li> Chauffer une partie aliquote de 0,1% d&#39;agarose à 70 ° C dans un bloc chauffant. Vortex brièvement le tube de réaction et de le transférer à un bloc chauffant à 38 ° C (figure 2H). </li><li> Prenez le tube de réaction à partir du bloc de feu et laisser refroidir brièvement. Ajouter Tricaine à une concentration finale de 133 à 200 mg / L et de vortex à nouveau (figure 2I). </li><li> Sélectionnez l&#39;une des embryons de poisson zèbre dechorionated et transfe. r au tube de réaction avec le four préchauffé à 0,1% d&#39;agarose en utilisant une pipette Pasteur en verre (figures 2J et 2K) Note 1: Essayez de transférer aussi peu supplémentaire E3 que possible. </li></ol></li><li> Montage du poisson zèbre <ol><li> Prenez l&#39;embryon avec le tube de seringue FEP-jointe (figure 2L). . Le tube doit être complètement rempli avec 0,1% d&#39;agarose, avec l&#39;embryon placé près de la fin du tube et avec la tête tournée vers l&#39;ouverture du tube Note 1: Assurez-vous de prendre un peu d&#39;agarose avant de prendre le poisson. Note 2: Tirez très doucement sur ​​la seringue pour éviter les bulles Note 3:. Garder le tube dans une orientation horizontale pour éviter les fuites de son contenu (figures 2M et 2N). </li></ol></li><li> Brancher le tube <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Multicouche de montage pour les embryons de poisson zèbre. A) d&#39;éthylène-propylène fluoré (FEP) tubes sur un tambour à câble avant la préparation. B) Une seringue avec une extrémité canule émoussée ci-joint. C) Un nettoyés et coupés FEP tube. D, E) dechorionation de 24 HPF embryons de poisson zèbre. F) Fixation du tube à l&#39;extrémité canule émoussée. G) La seringue avec canule et le tube-joint. H) Une portion aliquote de 0,1% d&#39;agarose dans un tube de réaction tout en les transférant sur ​​un bloc chauffant. I) vortex du fondu agarose. J) Absorption d&#39;un embryon dechorionated en utilisant une pipette en verre. K) de transfert de l&#39;embryon dans l&#39;agarose fondu. L) de réception de l&#39;embryon avec entourant agarose dans le tube en FEP. M, N), l&#39;embryon de poisson zèbre à l&#39;intérieur du tube FEP . <strong&gt; O) coupe le tube entre l&#39;échantillon et la canule. P) Brancher le tube par l&#39;utilisation d&#39;un plat d&#39;agarose revêtues. Q) L&#39;embryon à l&#39;intérieur du tube branché. R) La préparation finale de l&#39;échantillon dans un support métallique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> Utilisez une lame de rasoir pour couper le tube de la canule (Figure 2O). </li><li> Coller lentement l&#39;extrémité du tube contenant le poisson à travers la totalité de la couche de 1,5% d&#39;agarose dans le plat en plastique pour boucher le tube (Figure 2P) Note 1:. Eviter la formation de bulles et essayer d&#39;obtenir une surface de prise droite en tenant le . Tube exactement perpendiculaire à la surface de la gélose Note 2: Tournez légèrement le tube pour obtenir une belle prise. </li><li> Garder le spécimen monté dans un tube de réaction de 1,5 ml avec de l&#39;E3 pour éviter le séchage. L&#39;échantillon est now prêt à imager. Avant imagerie, vérifier si le poisson est assis juste au-dessus du bouchon (figures 2T et 2R). Assurez-vous aussi d&#39;ajouter Tricaine au milieu intérieur de la chambre d&#39;imagerie à la même concentration que dans le milieu de montage. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Techniques de microscopie de pointe telles que la microscopie de nappe de lumière nous permettent d&#39;enregistrer des données d&#39;image avec une résolution spatiale et temporelle au cours de plusieurs jours, mais aussi nécessitent des techniques de montage d&#39;échantillons à améliorer. Nous présentons un protocole détaillé de multicouche de montage pour la microscopie nappe de lumière de développement du poisson zèbre. La méthode est simple à mettre en œuvre et nous l&#39;utilisons dans notre laboratoire sur une base quotidienne. Les tubes FEP Les éléments clés de notre stratégie de montage sont des tubes en l&#39;éthylène propylène fluoré polymère (FEP). Nous avons décidé d&#39;utiliser FEP principalement en raison de son indice de réfraction de 1,338, ce qui est similaire à l&#39;eau et donc parfaitement adapté pour la microscopie nappe de lumière avec les objectifs de l&#39;eau de trempage et de spécimens nécessitant des milieux aqueux. Les tubes de 0,8 mm de diamètre intérieur et de 0,4 mm d&#39;épaisseur de paroi adapter le poisson zèbre développe très bien, peuvent être utilisés avec des porte-échantillons typiques adaptés à 1,6 mmcapillaires et sont notre premier choix pour la méthode de fixation présenté. Nous avons testé à fond dans nos configurations assemblés ainsi que dans le système commercial &quot;Lightsheet Z.1&quot; par Carl Zeiss Microscopie et constaté que les tubes FEP offrir une stabilité à long terme, avoir qu&#39;un impact minimal sur les performances optiques et sont non fluorescent 10. Ils sont, cependant, ne conviennent pas pour des applications avec des échantillons qui nécessitent un indice de réfraction différent, par exemple effacé spécimen. Les tubes ainsi que des feuilles faites de FEP sont disponibles dans une variété de diamètres et épaisseurs. En outre, le FEP peut être fondu à 260 ° C et offre des possibilités quasi infinies pour l&#39;échantillon des supports de montage sur mesure ainsi. Les tubes de polymère ont tendance à être fourni non stérile, ce qui explique pourquoi le protocole de nettoyage comprend plusieurs mesures pour assurer la meilleure qualité optique. Le revêtement avec de la méthylcellulose garantit qu&#39;aucune partie de l&#39;embryon de poisson zèbre croissante colle au polymère. La décision pour 0,1% d&#39;agarose est basée sur des tests approfondis de taux et de l&#39;immobilité de croissance à différentes concentrations de l&#39;agarose et la méthylcellulose 10. Concentrations supérieures à 0,1% d&#39;agarose ont déjà montré un impact grave sur le taux de 24 HPF poisson zèbre de croissance. En outre, nous utilisons de faibles doses de la drogue anesthésiante Tricaine. les potentiels des blocs de tricaïne d&#39;action, inhibe ainsi la transmission des signaux entre le cerveau et les muscles et supprime les contractions musculaires 16. Une concentration de 133 à 200 mg / L assure l&#39;immobilisation suffisante de poisson zèbre entre 24-72 HPF. Cependant, Tricaine et d&#39;autres médicaments anesthésiants nous avons testé les effets secondaires dépendent spectacle de doses telles que l&#39;oedème cardiaque. En outre, la dose requise de tricaïne varie avec le stade de développement de l&#39;embryon. Nous recommandons donc de réduire la concentration Tricaine à la quantité nécessaire pour les stades de développement qui sont imagés. Pour assurer la meilleure performanCE et éviter la formation de sous-produits toxiques, solution stock Tricaine fraîchement préparée ou décongelé doit être utilisé, protégé de la lumière et non chauffé au-dessus de 30 ° C. L&#39;intégration dans des tubes FEP permet également de modifier facilement le milieu de montage pour tenir compte des besoins spécifiques. Pour l&#39;imagerie time-lapse du cœur, nous vous recommandons d&#39;utiliser 3% de méthylcellulose et 100 mg / L Tricaine au lieu de 0,1% d&#39;agarose et 200 mg / L pour le montage. La méthylcellulose est plus visqueux que 0,1% d&#39;agarose fournissant ainsi l&#39;immobilité plus haut sur sa propre tricaïne et moins qui doit être utilisé pour assurer le confinement de l&#39;embryon. Tricaïne est sensible à des températures supérieures à 30 ° C et peut également être diluée par le fluide dans la chambre d&#39;imagerie, ce qui conduit à une baisse des performances et des contractions possible de l&#39;embryon. Par conséquent, assurez-vous d&#39;utiliser Tricaine également dans le milieu de l&#39;imagerie dans lequel le spécimen monté est immergé. Si les expériences nécessitent l&#39;utilisation ultérieure detempératures, il est recommandé changeant le milieu dans la chambre d&#39;imagerie soit constamment en utilisant un système de perfusion ou manuellement avec un tube et une seringue entre deux points dans le temps. Les étapes critiques Les étapes critiques au cours du processus de montage de l&#39;échantillon sont l&#39;admission de l&#39;échantillon dans le tube et l&#39;insertion du bouchon d&#39;agarose. L&#39;apport définit la position initiale de l&#39;embryon, qui est encombrant pour changer par la suite. Spécimens multiples devraient être disponibles pour monter et la qualité de montage doivent être surveillées avec une loupe binoculaire. Si l&#39;orientation de l&#39;échantillon n&#39;est pas satisfaisante, la modification de la vitesse de l&#39;élaboration de l&#39;échantillon et éviter les mouvements ultérieurs du plongeur peut aider que ce tord souvent l&#39;embryon. Le bouchon d&#39;agarose à 1,5% est nécessaire pour éviter les fuites de l&#39;agarose à 0,1%. La surface de la fiche à l&#39;intérieur du tube doit être plat pour ne pas influencer l&#39;orientation de l&#39;échantillon au cours du développement. Pour atteindre un bon surfas, différentes épaisseurs des couches d&#39;agarose doivent être testés et le tube doit être mis dans l&#39;agarose normale à la surface. Tourner le tube un peu et en tirant le tube libère attentivement la fiche de l&#39;antenne. La qualité du montage doit être vérifiée avec un stéréomicroscope avant l&#39;imagerie. imagerie de Multiview Un avantage majeur de la microscopie à feuille de lumière est l&#39;imagerie multi-vues, la capacité de faire tourner l&#39;échantillon, acquérir z-piles sous des angles multiples et ensuite enregistrer et de les fusionner. Une méthode établie pour enregistrer les z-piles dans l&#39;espace 3D est l&#39;enregistrement sur ​​la base de perles en utilisant des billes fluorescentes autour de l&#39;échantillon en tant que marqueurs fiduciaires 17. Cette méthode repose toutefois sur un support de montage solide tel que 1,5% d&#39;agarose et semble donc incompatible avec le multicouche montage présenté ici. Mais plusieurs solutions alternatives fonctionnent selon l&#39;application. Tout d&#39;abord, les perles fluorescentes peutdoit être intégré dans le bouchon d&#39;agarose, qui doit être dans le champ de vision au cours de l&#39;acquisition. D&#39;autre part, les positions de la scène peuvent être étalonnés avant les expériences réelles en utilisant une colonne d&#39;agarose à 1,5% avec des billes fluorescentes. Troisièmement, les marqueurs de substitution tels que les noyaux fluorescents peuvent être utilisés pour identifier la position des empilements z par rapport à l&#39;autre. Évaporation Typiques des configurations de microscopie nappe de lumière utilisent une chambre d&#39;échantillon ouvert, qui conduit inévitablement à l&#39;évaporation du milieu. Depuis le milieu est essentiel pour la survie de l&#39;échantillon, pour limiter l&#39;évaporation du milieu de montage et de l&#39;indice de réfraction correcte entre l&#39;optique et de l&#39;échantillon, nous recommandons de prendre une ou plusieurs des mesures suivantes pour éviter l&#39;évaporation. Tout d&#39;abord, le milieu dans la chambre peut être échangée en permanence par un système de perfusion. En second lieu, le milieu peut être rempli manuellement. En troisième lieu, la chambre peut être recouvert d&#39;un couvercle ou d&#39;une feuille flexible. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; fourniture d&#39;oxygène Le FEP de polymère a été mise au point pour résister à une grande variété de produits chimiques et est donc robuste, chimiquement inerte et non perméable au gaz. Dans le cas de plusieurs couches de montage oxygène ne peut pénétrer à travers le bouchon d&#39;agarose et l&#39;interface agarose-air, mais il reste à démontrer si l&#39;apport d&#39;oxygène dans le montage multicouche est fortement inférieur à celui de monter à 1,5% d&#39;agarose sans tube support polymère. Cependant, comme dans le montage de 1,5% d&#39;agarose ne peut être utilisé pendant environ deux heures avant la morphologie du poisson zèbre est affectée montage multicouche semble être la meilleure solution globale pour l&#39;imagerie à long terme. Imagerie premiers stades de développement Multicouche de montage est devenu notre technique d&#39;encastrement standard pour feuille de lumière time-lapse microscopie de poisson zèbre âgés de plus de 24 HPF. En plus de cela, nous utilisons également des tubes de polymères pour l&#39;imagerie des embryons de stade précoce. L&#39;embryos restent dans leurs chorions et sont montés dans un tube en FEP avec un diamètre interne de 1 mm et remplis de E3. Le poisson zèbre peut développer librement à l&#39;intérieur du chorion et peut encore être imagé bien en utilisant la microscopie nappe de lumière. Perspective Le montage de l&#39;échantillon multicouche présenté libère le plein potentiel de la microscopie à feuille de lumière en temps réel la biologie du développement avec le poisson zèbre. Il peut facilement être adoptée pour d&#39;autres techniques de microscopie comme la tomographie à projection optique (OPT) et d&#39;autres organismes. Nous croyons que les tubes FEP taille standard ne sont que les premiers pas vers les techniques de montage d&#39;échantillons sur mesure pour des besoins spécifiques.

Pour comprendre les événements complexes et des interactions au cours de l&#39;embryogenèse, la recherche en biologie du développement est de plus en plus mobile de la microscopie de cellules et d&#39;organes simples à l&#39;imagerie in vivo d&#39;organismes entiers. Les techniques traditionnelles de microscopie ne généralement à offrir la résolution spatiale et temporelle de suivre les événements rapides sur une longue période de temps et provoquent le blanchiment ou les effets phototoxiques de l&#39;échantillon 1 souvent. Nous et d&#39;autres avons trouvé microscopie nappe de lumière (figure 1) soit la technique idéale pour l&#39;imagerie in vivo de poisson zèbre 2-4. L&#39;illumination de l&#39;échantillon avec une feuille mince de lumière laser, orthogonal à l&#39;axe de détection, propose un sectionnement optique rapide à haute résolution spatiale réduite au minimum ainsi que la photo-toxicité 5. Dans le même temps, en raison de cet agencement optique unique, les techniques de montage d&#39;échantillon traditionnels utilisant des boîtes de Pétri ou des chambres de culture ne sont pas adaptés. Dans une lumière typiquefeuille microscope trois moteurs de translation et de rotation d&#39;un moteur détiennent l&#39;échantillon, de telle sorte qu&#39;il peut être positionné avec précision, tournés et visualisées à partir de n&#39;importe quelle direction. Dans les spécimens dernières pour la microscopie nappe de lumière ont souvent été embarqué dans 1-2% d&#39;agarose dans un capillaire en verre 6,7. Dans ce cas, le cylindre d&#39;agarose solidifié avec l&#39;échantillon embarqué est extrudée hors du tube capillaire en verre dans la chambre de mesure remplie de l&#39;eau comme milieu de formation d&#39;image. Agarose a un indice de réfraction proche de l&#39;eau et est donc parfaitement adapté pour la microscopie nappe de lumière in vivo qui facilite l&#39;optique d&#39;illumination et de détection corrigé à l&#39;eau. L&#39;échantillon est confiné dans l&#39;agarose rigide et peut être bien imagée pour une courte période de temps, mais les changements morphogénétiques et la croissance de l&#39;embryon sont fortement compromise lors de l&#39;imagerie pendant plusieurs heures 7,8. Bien que des solutions pour d&#39;autres applications ont été développées 9, la non invasive à long terme time-lapse de poisson zèbre<html> potentiel de formation d&#39;image de microscopie à nappe de lumière ne peut pas être exploitée en utilisant le plongement classique d&#39;agarose à 1,5%. Nous avons donc développé une nouvelle stratégie de montage pour la microscopie nappe de lumière in vivo des embryons de poisson zèbre 10. L&#39;échantillon est monté dans 0,1% d&#39;agarose avec 200 mg / L Tricaine l&#39;intérieur d&#39;un tube en polymère fluoré d&#39;éthylène optiquement clair propylène (FEP). L&#39;embryon se développe normalement intégré raison de la faible viscosité du milieu. Dans le même temps, le tube FEP confine le support et l&#39;échantillon pour la durée de l&#39;expérience. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de la nouvelle technique de montage et présenter des données reflétant ses avantages sur le protocole classique. Nous démontrons que notre méthode de développement du poisson zèbre peut être imagée en continu avec une résolution spatiale et temporelle sur une période de plus de deux jours. 5po &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Le principe de la microscopie de nappe de lumière. Un poisson zèbre monté dans un tube en éthylène propylène fluoré (FEP) peut être traduit et mis en rotation à travers le plan focal de l&#39;objectif de détection. Une mince feuille de lumière laser (nappe de lumière) est projetée par l&#39;objectif d&#39;éclairage dans le plan focal de l&#39;objectif de détection et illumine seulement une section optique mince de l&#39;échantillon. Le signal de fluorescence émise est collectée par l&#39;objectif de détection et enregistrée sur une puce de caméra.

<table><tbody><tr><td>Tubes en éthylène-propylène fluoré (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0,8/1,6 mm diamètre intérieur/extérieur, autres tailles disponibles</td></tr><tr><td>Seringue Omnifix-F Solo 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Canule sterican à usage unique, émoussée</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0,8 mm x 22 mm, autres tailles disponibles, le diamètre extérieur de la canule doit s’adapter au diamètre intérieur du tube</td></tr> <tr><td>FEP50 ml Tube de centrifugation en polypropylène</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M NaOH&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>fourni sous forme de poudre</td></tr><tr><td>Milieu E3 (pour les embryons de poisson zèbre)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tube de réaction</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, basse température de gélification</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>fourni sous forme de poudre</td></tr><tr><td>Boîte</td> <td>de PétriGreiner</td><td>633180</td><td>plastique, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>synonymes :&nbsp ; Méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate, MS-222, TS 222, méthanesulfonate de tricaïne.</td></tr><tr><td>Objectif microscope 10X/0,3 W Leica</td><td></td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Appareil photo</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multicouche de montage pour à long terme fiche microscopie optique de poisson zèbre

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Feuille microscopie optique est la technique d&#39;imagerie idéal pour étudier le développement embryonnaire du poisson zèbre. En raison de la photo-toxicité et blanchiment minime, il est particulièrement adapté pour l&#39;imagerie time-lapse à long terme sur plusieurs heures jusqu&#39;à plusieurs jours. Cependant, une stratégie de fixation appropriée de l&#39;échantillon est nécessaire qui offre à la fois le confinement et le développement normal de l&#39;échantillon. Multicouche de montage, une nouvelle technique d&#39;enrobage à l&#39;aide de faible concentration d&#39;agarose dans des tubes optiquement transparents, surmonte maintenant cette limitation et libère le plein potentiel de la microscopie à feuille de lumière en temps réel la biologie du développement.

Imagerie Etapes de poisson zèbre Vasculature développement Nous utilisons une dpf Tg (kdrl: GFP) 13 poisson zèbre pour démontrer les avantages de la stratégie de montage multicouche pour microscopie optique de la feuille à long terme. Le but est la mise au point de l&#39;image de la vascularisation dans l&#39;ensemble du poisson zèbre-dessus d&#39;un espace de 2 jours. L&#39;embryon de poisson zèbre a été montée dans 0,1% d&#39;agarose dans un tube de polymère de méthylcellulose revêtue. Ici, le poisson zèbre ne soit pas limitée par le moyen de fixation et peut se développer normalement. Sa tête soulève, la queue s&#39;étend et germination vasculaire semble pas gênée (Figure 3). <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figure 3. D&#39;imagerie Etapes de développement du système vasculaire du poisson zèbre. Le système vasculaire d&#39;un multilatéralesyer monté 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 poisson zèbre se développe sans entrave dans une feuille microscope optique au cours de deux jours. Une feuille de lumière laser de 488 nm de la fluorescence excitée et le signal a été détecté en utilisant 10X/0.3 W objectif et une caméra EMCCD. Z-piles ont été acquises sur quatre positions adjacentes toutes les 10 min, puis cousues avec les Fidji 15. Projections maximales d&#39;intensité d&#39;un sous-ensemble de points de temps sont affichés. Barre d&#39;échelle:. 500 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Imaging of Early poisson zèbre embryogenèse Ici, nous démontrons la capacité de tubes FEP comme un support de montage pour la microscopie nappe de lumière de début de l&#39;embryogenèse du poisson zèbre pendant le premier jour après la fécondation. Le 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 embryon de poisson zèbre a été monté avec son chorion intacte à l&#39;intérieur d&#39;un tube E3-rempli avec un idiamètre de nner de 1 mm. Cela se traduit par un léger serrage du chorion. Tous les processus de développement au cours de l&#39;embryogenèse ne sont pas affectées par le montage et peuvent être visualisées de façon optimale en utilisant la microscopie nappe de lumière. Dans cet exemple, nous imager l&#39;échantillon sur un parcours de 12 heures (Figure 4). Changements de forme au cours de l&#39;embryogenèse précoce typiques, tels que l&#39;augmentation de l&#39;allongement du jaune et de l&#39;épaississement de tissu le long de la ligne médiane, seraient oppression lors de l&#39;utilisation du montage traditionnel sans chorion dans 1,5% d&#39;agarose. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figure 4 Imaging de début de l&#39;embryogenèse du poisson zèbre Un Tg (H2A: GFP). 14 poisson zèbre traverse l&#39;embryogenèse précoce. Une GFP excitée en feuille de lumière laser de 488 nm et le signal de fluorescence a été détectéeavec un objectif de 10X/0.3 W et une caméra EMCCD. Z-piles de deux angles ont été acquis toutes les 3 min sur un parcours de 12 heures. Projections d&#39;intensité maximale normalisée d&#39;un sous-ensemble de la time-lapse sont présentés. Visible flou de mouvement à 19 HPF résultats de l&#39;contractions embryon lors de l&#39;acquisition, aucune anesthésie ont été utilisés. Barre d&#39;échelle:. 150 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

Le développement de poisson zèbre peut être suivie au fil des jours avec la microscopie nappe de lumière lorsque les embryons sont incorporés dans des tubes de polymères optiquement transparents à faible concentration d&#39;agarose.

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

L'objectif général de cette procédure est de monter un embryon de poisson zèbre pour une microscopie en feuillet lumineux in vivo à long terme. Cette opération s'effectue tout d'abord en nettoyant un tube en FEP (polyéthylène tétrafluoroéthylène propylène) et en le recouvrant de méthylcellulose. Ensuite, l'embryon de poisson zèbre d'intérêt est recouvert. Ensuite, l'embryon est transféré d'abord dans de l'agarose fondue, puis dans le tube FEP revêtu. Enfin, le fond du tube est fermé avec un bouchon en aros et l'orientation de l'embryon monté est soigneusement vérifiée. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le développement non perturbé d'embryons de poisson zèbre pendant plusieurs jours, avec une résolution spatiale et temporelle élevée, grâce à la microscopie à feuillet lumineux in vivo.Eh bien, le principal avantage par rapport aux techniques existantes est que nous pouvons désormais observer les embryons de super-poisson sur plusieurs jours et non plus seulement quelques heures. Cette méthode peut fournir des informations précieuses sur l'embryogenèse à long terme du poisson-zèbre en utilisant la microscopie à feuillet de lumière. Elle peut également être appliquée à d'autres organismes petits, comme les petits organismes marins.Il peut également être utilisé avec d'autres techniques de microscopie telles que la tomographie par projection optique, la microscopie en champ large ou la microscopie confocale. Les personnes novices dans cette méthode pourraient éprouver des difficultés, car le protocole implique des étapes critiques dans le temps, et l'évaluation de la position finale de l'embryon nécessite une certaine expertise. Pour préparer un tube FEP, commencez par le nettoyer en le rinçant plusieurs fois avec une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire. Ensuite, transférez le tube dans un tube à centrifuger de 50 millilitres rempli d'hydroxyde de sodium à 0,5 molaire et soumettez-le à une ultrasonication pendant 10 minutes.Transférez le tube en polymère dans un petit récipient contenant de l'eau distillée et désionisée, puis rincez-le. Procédez ensuite à un rinçage avec de l'éthanol à 70 % avant de le transférer dans un nouveau tube de centrifugation. Avec de l'éthanol aux ultrasons.Soniquez le tube pendant 10 minutes avant de le transférer dans un petit récipient contenant de l'eau distillée désionisée et de le rincer à nouveau. Coupez le tube FEB propre en morceaux de trois centimètres de longueur et redressez-les si nécessaire. Conservez les tubes nettoyés dans un nouveau tube de 50 millilitres rempli d'eau distillée désionisée.Préparez la solution mère de Trica. 3 % de méthylcellulose et les deux types d’Aros à 1,5 % et 0,1 % selon le protocole indiqué. Faites fondre l’agarose à 1,5 % et versez-la dans une boîte de Pétri pour former une couche d'une épaisseur d'environ deux millimètres.Collecter les embryons de poisson zèbre au stade désiré ayant exprimé positivement le gène fluorescent choisi et les transférer dans une nouvelle boîte de E three sous un stéréomicroscope. À l’aide de deux paires de forceps pointus, recouvrir soigneusement les embryons en utilisant une paire de forceps pour maintenir la choriion et la seconde paire pour l’ouvrir en la déchirant et la retirer afin d’effectuer un montage multicouche. Avec des mains gantées, fixer une canule à extrémité émoussée à une seringue.Insérez soigneusement la canule d'environ trois millimètres dans une extrémité d'un morceau de tube FEP nettoyé. Ensuite, plongez l'extrémité libre du tube FEP dans du méthylcellulose à 3 % et remplissez le tube avec la solution. Puis, poussez lentement sur la seringue pour expulser le méthylcellulose à l'aide du milieu E trois moyen, répétez les étapes de trempage et d'expulsion.Entre-temps, dans un bloc chauffant, faites chauffer un aliquot de 0,1 % d'aros à 70 degrés Celsius. Vortexez brièvement le tube réactionnel avant de le transférer dans un bloc chauffant réglé à 38 degrés Celsius. Après chauffage, laissez refroidir le tube brièvement, puis ajoutez du trica à une concentration finale de 133 à 200 milligrammes par litre et vortexez.Encore une fois, à l’aide d’une pipette en verre. Transférez un embryon enrobé dans le tube à réaction avec l’AROS en transférant le moins possible d’E3. À l’aide du tube FEP et de la seringue attachée, aspirez délicatement une petite quantité d’AROS avant de prélever l’embryon, puis remplissez complètement le tube avec l’AROS.L'embryon doit être positionné à l'une des extrémités du tube, la tête orientée vers l'ouverture. Pour éviter toute fuite du contenu, maintenir le tube en position horizontale afin de le boucher. Utiliser une lame de rasoir pour le détacher de la canule.Ensuite, en tenant le tube perpendiculairement, insérez lentement son extrémité à travers toute la couche d'aros à 1,5 % et faites-le tourner légèrement. Pour éviter le dessèchement, conservez l'échantillon monté dans un tube à réaction de 1,5 millilitre rempli de milieu E trois avant l'acquisition d'images. Vérifiez que le poisson à l'intérieur du tube FEP est bien positionné à plat et que sa tête repose directement sur le bouchon pour l'imagerie.Ajouter du trica au milieu à l'intérieur de la chambre d'observation. On voit ici un embryon de poisson zèbre transgénique d'un jour après la fécondation, portant la séquence K-G-R-L-G-F-P, observé pendant deux jours afin de suivre le développement du système vasculaire.Le poisson zèbre n'est pas limité par le milieu de montage et peut se développer normalement. Par exemple, sa tête se soulève. La queue s'étend et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins apparaît sans entrave.Cette technique peut être réalisée en 10 minutes si elle est effectuée correctement et si tous les matériaux sont facilement disponibles. Veillez à exécuter toutes les étapes principales sans aucun retard. Gardez toutes les solutions propres, car la saleté peut altérer la qualité finale de l'image.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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Préparation d’échantillons de microscopie à feuillet de lumière : montage d’embryons de poisson-zèbre vivants pour l’imagerie à long terme

Cet article décrit une méthode pour monter des embryons de poisson-zèbre vivants pour l’imagerie à long terme. Cette méthode est rentable et facile à mettre en œuvre à l’aide de boîtes de microscopie à fond de verre ordinaires pour l’imagerie au microscope inversé. Le montage est effectué en couches d’agarose à différentes concentrations.

Montage de gélose en couches : préparation d’embryons de poisson-zèbre vivants pour l’imagerie à long terme avec un microscope inversé

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Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.

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