Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est de monter un embryon de poisson zèbre pour une microscopie en feuillet lumineux in vivo à long terme. Cette opération s'effectue tout d'abord en nettoyant un tube en FEP (polyéthylène tétrafluoroéthylène propylène) et en le recouvrant de méthylcellulose. Ensuite, l'embryon de poisson zèbre d'intérêt est recouvert.

Ensuite, l'embryon est transféré d'abord dans de l'agarose fondue, puis dans le tube FEP revêtu. Enfin, le fond du tube est fermé avec un bouchon en aros et l'orientation de l'embryon monté est soigneusement vérifiée. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant le développement non perturbé d'embryons de poisson zèbre pendant plusieurs jours, avec une résolution spatiale et temporelle élevée, grâce à la microscopie à feuillet lumineux in vivo.

Eh bien, le principal avantage par rapport aux techniques existantes est que nous pouvons désormais observer les embryons de super-poisson sur plusieurs jours et non plus seulement quelques heures. Cette méthode peut fournir des informations précieuses sur l'embryogenèse à long terme du poisson-zèbre en utilisant la microscopie à feuillet de lumière. Elle peut également être appliquée à d'autres organismes petits, comme les petits organismes marins.

Il peut également être utilisé avec d'autres techniques de microscopie telles que la tomographie par projection optique, la microscopie en champ large ou la microscopie confocale. Les personnes novices dans cette méthode pourraient éprouver des difficultés, car le protocole implique des étapes critiques dans le temps, et l'évaluation de la position finale de l'embryon nécessite une certaine expertise. Pour préparer un tube FEP, commencez par le nettoyer en le rinçant plusieurs fois avec une solution d'hydroxyde de sodium à un molaire. Ensuite, transférez le tube dans un tube à centrifuger de 50 millilitres rempli d'hydroxyde de sodium à 0,5 molaire et soumettez-le à une ultrasonication pendant 10 minutes.

Transférez le tube en polymère dans un petit récipient contenant de l'eau distillée et désionisée, puis rincez-le. Procédez ensuite à un rinçage avec de l'éthanol à 70 % avant de le transférer dans un nouveau tube de centrifugation. Avec de l'éthanol aux ultrasons.

Soniquez le tube pendant 10 minutes avant de le transférer dans un petit récipient contenant de l'eau distillée désionisée et de le rincer à nouveau. Coupez le tube FEB propre en morceaux de trois centimètres de longueur et redressez-les si nécessaire. Conservez les tubes nettoyés dans un nouveau tube de 50 millilitres rempli d'eau distillée désionisée.

Préparez la solution mère de Trica. 3 % de méthylcellulose et les deux types d’Aros à 1,5 % et 0,1 % selon le protocole indiqué. Faites fondre l’agarose à 1,5 % et versez-la dans une boîte de Pétri pour former une couche d'une épaisseur d'environ deux millimètres.

Collecter les embryons de poisson zèbre au stade désiré ayant exprimé positivement le gène fluorescent choisi et les transférer dans une nouvelle boîte de E three sous un stéréomicroscope. À l’aide de deux paires de forceps pointus, recouvrir soigneusement les embryons en utilisant une paire de forceps pour maintenir la choriion et la seconde paire pour l’ouvrir en la déchirant et la retirer afin d’effectuer un montage multicouche. Avec des mains gantées, fixer une canule à extrémité émoussée à une seringue.

Insérez soigneusement la canule d'environ trois millimètres dans une extrémité d'un morceau de tube FEP nettoyé. Ensuite, plongez l'extrémité libre du tube FEP dans du méthylcellulose à 3 % et remplissez le tube avec la solution. Puis, poussez lentement sur la seringue pour expulser le méthylcellulose à l'aide du milieu E trois moyen, répétez les étapes de trempage et d'expulsion.

Entre-temps, dans un bloc chauffant, faites chauffer un aliquot de 0,1 % d'aros à 70 degrés Celsius. Vortexez brièvement le tube réactionnel avant de le transférer dans un bloc chauffant réglé à 38 degrés Celsius. Après chauffage, laissez refroidir le tube brièvement, puis ajoutez du trica à une concentration finale de 133 à 200 milligrammes par litre et vortexez.

Encore une fois, à l’aide d’une pipette en verre. Transférez un embryon enrobé dans le tube à réaction avec l’AROS en transférant le moins possible d’E3. À l’aide du tube FEP et de la seringue attachée, aspirez délicatement une petite quantité d’AROS avant de prélever l’embryon, puis remplissez complètement le tube avec l’AROS.

L'embryon doit être positionné à l'une des extrémités du tube, la tête orientée vers l'ouverture. Pour éviter toute fuite du contenu, maintenir le tube en position horizontale afin de le boucher. Utiliser une lame de rasoir pour le détacher de la canule.

Ensuite, en tenant le tube perpendiculairement, insérez lentement son extrémité à travers toute la couche d'aros à 1,5 % et faites-le tourner légèrement. Pour éviter le dessèchement, conservez l'échantillon monté dans un tube à réaction de 1,5 millilitre rempli de milieu E trois avant l'acquisition d'images. Vérifiez que le poisson à l'intérieur du tube FEP est bien positionné à plat et que sa tête repose directement sur le bouchon pour l'imagerie.

Ajouter du trica au milieu à l'intérieur de la chambre d'observation. On voit ici un embryon de poisson zèbre transgénique d'un jour après la fécondation, portant la séquence K-G-R-L-G-F-P, observé pendant deux jours afin de suivre le développement du système vasculaire.

Le poisson zèbre n'est pas limité par le milieu de montage et peut se développer normalement. Par exemple, sa tête se soulève. La queue s'étend et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins apparaît sans entrave.

Cette technique peut être réalisée en 10 minutes si elle est effectuée correctement et si tous les matériaux sont facilement disponibles. Veillez à exécuter toutes les étapes principales sans aucun retard. Gardez toutes les solutions propres, car la saleté peut altérer la qualité finale de l'image.