Name: Minimalement invasive Création dmurin orthotopique de la vessie xénogreffes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Apprenez à créer des xénogreffes orthotopiques de cancer de la vessie chez la souris par une technique échoguidée percutanée minimalement invasive. Cette méthode rapide permet de suivre la croissance tumorale par imagerie.

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Les auteurs tiennent à remercier Eliana Beraldi pour effectuer la transduction virale des lignées cellulaires tumorales et Ben Deeley pour son instruction sur l&#39;utilisation de la petite plate-forme d&#39;imagerie par ultrasons des animaux. Ce projet a été soutenu par le système Fondation allemande (DFG; juge 2117/1-1: 1), l&#39;Institut de recherche de la Société canadienne du cancer et une Scientist Award du mentorat des médecins de l&#39;Institut de recherche en santé Vancouver Coastal. La plate-forme d&#39;imagerie par ultrasons a été financée par la Fondation canadienne pour l&#39;innovation.

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été réalisés selon les directives du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Le protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l&#39;Université de la Colombie-Britannique (numéro de protocole: A10-0192). Une. Préparation de lignées cellulaires <ol><li> Confirmer l&#39;identité des lignées de cellules de cancer de la vessie humaine respectifs par les empreintes génétiques 7. </li><li> Pour l&#39;analyse de la croissance de tumeurs de xénogreffes par bioluminescence, transfecter des lignées de cellules avec un produit d&#39;assemblage lentiviral portant le gène de la luciférase de luciole 3. </li><li> Dégel et d&#39;étendre les lignes de cellules existant dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%. Passage des cellules au moins 3x mais éviter les temps de culture de plus de 3 mois. </li></ol> 2. Préparation de suspension cellulaire <ol><li> Décongeler Matrigel. Maintenir la température en dessous de4 ° C pour éviter d&#39;accroître la viscosité du gel. </li><li> Trypsiniser les cellules à une confluence de 70% et de mettre en suspension dans un milieu de croissance normal. </li><li> Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre ou compteur de cellules automatique. </li><li> Faire tourner la suspension de cellules pendant 5 min à 200 x g. Retirer le surnageant. </li><li> Ajouter le volume approprié de DMEM (FBS à 10%) et Matrigel (rapport 1:1) pour parvenir à la concentration cellulaire désirée qui dépend de la lignée cellulaire utilisée et la cinétique de croissance souhaités (8-15 x 10 6 / ml). Le volume injecté de la tumeur suspension cellulaire sera de 40 ul. </li><li> Mélangez bien par aspiration et refoulement (P1000), éviter de créer des bulles d&#39;air dans la suspension. </li></ol> 3. Préparation des animaux Remarque: En raison de la nécessité éventuelle de cathétérisme endoscopique à l&#39;étape 4.7, les souris femelles sont le genre préféré dans ce modèle animal. <ol><li> Les souris domestiques selon gu institutionnel et les soins des animaux nationaleidelines. Obtenir l&#39;approbation du comité d&#39;éthique pour toutes les expériences sur des souris. </li><li> Anesthésier les souris avec de l&#39;isoflurane mélange / oxygène de 3%. Confirmer le bon anesthésie des animaux (par exemple, l&#39;absence de réponse à pincées d&#39;orteil). </li></ol> 4. Expérimental <ol><li> Couper la stabilisation de la vessie à partir de tout type de plat en matière plastique rigide [Figure 2 I]. Inspectez soigneusement la courroie et retirez les arêtes vives avant l&#39;application sur les souris. </li><li> Montez l&#39;animal sur la table d&#39;imagerie chauffée [Figure 1 I] de la petite plate-forme d&#39;imagerie animale avec un suivi continu des signes vitaux. Fixer les membres inférieurs avec une bande de caoutchouc [Figure 1 III]. </li><li> Désinfecter l&#39;abdomen avec 2% de gluconate de chlorhexidine et essuyer la peau avec un coton-tige stérile. </li><li> Immobiliser la vessie avec la sangle de stabilisation de la vessie [Figure 2 II]. Ainsi, une évasionde la vessie lors de l&#39;injection intra-muros à l&#39;étape 5.6 seront évités. </li><li> Appliquer le gel d&#39;échographie stérile à l&#39;abdomen inférieur. </li><li> Approchez lentement la tête de balayage à ultrasons (fréquence de 40 MHz) [figure 1 IV] de la peau (longitudinal avec un angle de 45-70 ° crânienne) et de visualiser la vessie sur l&#39;écran de l&#39;échographie [Figure 3 I]. </li><li> Si la vessie est vide, remplissez-le avec 50 pi stérile, chaud salines de tampon phosphate (PBS) à un G angiocathéter transurétrale 24. </li></ol> 5. La séparation des couches de la vessie mur <ol><li> Attacher une seringue 1,0 ml rempli avec du PBS et reliée à un 30 G, ¾ en aiguille (biseau dirigé en avant) de la bride de la seringue. </li><li> Positionner l&#39;aiguille vers la peau juste au-dessus de l&#39;os pubien dans un angle de 30-45 ° (80 à 90 ° par rapport à l&#39;axe longitudinal de la tête de balayage ultrasonore [Figure 1]). </li><li> Détecter l&#39;aiguillesur l&#39;écran d&#39;ultrasons. </li><li> Lentement perforer la peau et les muscles de la paroi abdominale [Figure 3 II]. </li><li> Tourner le biseau de l&#39;aiguille 180 ° (maintenant dirigé en arrière). </li><li> Insérer la pointe de l&#39;aiguille dans la paroi de la vessie sans pénétrer la muqueuse [Figure 3 III] </li><li> Injecter lentement 50 pi de PBS entre la couche musculaire et la muqueuse afin de créer un espace artificiel [Figure 3 IV]. Remarque: Si la muqueuse est accidentellement perforé lors de l&#39;étape 5.6, tirez lentement l&#39;aiguille et injecter 50 ul de PBS après la couche de muqueuse a basculé en arrière sur la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Retirer l&#39;aiguille. </li></ol> 6. Intra-muros inoculation de cellules cancéreuses de la vessie <ol><li> Attacher une seconde seringue 1,0 ml (rempli avec des cellules cancéreuses mises en suspension dans du Matrigel) avec un 30 G, ¾ en aiguille à l&#39;étrier de seringue. </li><li> Guider la pointe de l&#39;aiguille à la mêmeEspace PBS-rempli qui a été créé à l&#39;étape 5.7. </li><li> Injecter 40 ul de la suspension cellulaire dans cet espace [Figures 3 V et VI]. </li><li> Retirer l&#39;aiguille. </li></ol> 7. Soins de soutien post-interventionnelle <ol><li> Démonter la souris à partir de la plate-forme d&#39;imagerie. </li><li> Garder l&#39;animal dans un environnement confortable et chaleureux sous surveillance continue lors de la récupération de l&#39;anesthésie. </li><li> Après avoir repris conscience et de reprendre la marche normale, placez le dos de l&#39;animal dans sa cage. </li></ol>

<ol><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li>
<li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse%3A+the+importance+of+orthotopic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).</li>
<li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Kang, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Bladder+Tumor+Model+and+the+Evaluation+of+Intravesical+saRNA+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
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<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+view%3A+Genetic+profiling+reveals+decades+old+cross-contamination+of+bladder+cancer+cell+line+KU7+with+HeLa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa.</a> J. Urol. (13), (2013).</li>
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<li>Black, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

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Presque toutes les grandes avancées dans le traitement du cancer, il faudra des tests dans des modèles animaux avant d&#39;entamer les essais cliniques. Des modèles animaux de cancer sont des outils indispensables qui permettent aux chercheurs d&#39;étudier la biologie des tumeurs in vivo. Modèles de xénogreffe orthotopique restent la norme de l&#39;or 1,2 et continuent d&#39;offrir le plus de flexibilité (en termes de sélection de lignées cellulaires) et ont la plus grande utilité pratique. La procédure illustrée est une modification peu invasive du modèle orthotopique décrit précédemment par Dinney et al. 12 Nous avons établi des tumeurs de xénogreffes par injection percutanée guidée par ultrasons de trois lignées cellulaires différentes avec un taux de réussite de 100% technique. Pendant un suivi continu, 98% des souris a démontré l&#39;augmentation constante du volume de la tumeur. En effectuant une technique mini-invasive, nous avons pu tenir compte des limites existantes du modèle intra-muros. Outre respection du bien-être animal, le caractère invasif réduit de cette procédure contribue également à la reproductibilité des expériences in vivo en diminuant le nombre de complications chirurgicales. Il est très efficace pour éviter les temps d&#39;une laparotomie abdominale et le besoin associé à la fermeture de la plaie. Nous avons réussi à diminuer de manière significative le temps de la procédure par animal à 3,4 min (± 1,6). Cependant, le principal avantage de notre nouvelle approche est sa précision. Haute résolution échographie permet de visualiser l&#39;espace créé par l&#39;injection de solution saline sous la muqueuse de la paroi de la vessie. Cette première étape d&#39;injection facilite l&#39;injection de cellules tumorales dans une deuxième étape, et minimise le risque de renversement de la cellule tumorale. Cela contraste avec la technique de l&#39;injection intra-muros après laparotomie, où il est impossible de visualiser le placement de l&#39;aiguille et il ya toujours un élément d&#39;incertitude quant à la profondeur exacte de l&#39;injection. En outre, comme nous l&#39;inoculation des cellules tumorales strictement dans la paroi de la vessie antérieure, growt de tumeurh sur la paroi postérieure de la vessie est évitée. Par la suite, le taux de complications obstructives raison de la croissance de la tumeur à proximité des orifices urétéraux est extrêmement rare. Cet effet permet d&#39;accompagnement des périodes de croissance et de traitement plus longues. La principale limitation de l&#39;inoculation de la tumeur guidée par échographie est la nécessité d&#39;un équipement technique adéquat. Par conséquent, la performance de cette procédure sera probablement limité à des centres qui sont spécialisés dans des modèles animaux de cancer humain. Cela devrait encourager les collaborations entre les groupes de recherche en dehors de ces institutions et les groupes ayant une expertise dans ce roman modélisation animale. Bien que dépendant de familiarité avec l&#39;imagerie par ultrasons et une certaine dextérité manuelle, ce modèle est facile à apprendre sur instruction compétent. L&#39;étape clé dans le procédé est la création d&#39;une sous-muqueuse de l&#39;espace artificiel dans la paroi de la vessie avec une solution saline. Une fois cet espace est créé sans perforation of la couche muqueuse, il reste stable pendant plusieurs minutes. L&#39;orientation de la seconde aiguille dans cet espace afin d&#39;inoculer les cellules tumorales est relativement simple. La principale complication lors de la création de l&#39;espace sous-muqueux est la perforation de l&#39;aiguille dans la lumière de la vessie. La création d&#39;un espace sous-muqueux, reste cependant réalisable. L&#39;aiguille doit être retirée lentement dans la paroi de la vessie et de la solution saline injectée juste au moment où la couche muqueuse renversent la pointe de l&#39;aiguille. Après cette manoeuvre l&#39;espace sous-muqueux est moins stable (solution saline va échapper à la lumière à l&#39;intérieur de la vessie 30 à 60 sec) et l&#39;injection de cellules tumorales doit être effectué rapidement. Déversement de cellules tumorales dans la lumière de la vessie peut se produire dans ces cas avec la perforation de la muqueuse. Bien que la perte de cellules tumorales à partir de l&#39;espace intra-muros pourrait conduire à une diminution de volume de la tumeur au cours du suivi, nous n&#39;avons jamais observé de captation tumorale intravésicale. Un autre c potentielomplication est le déversement des cellules tumorales dans la cavité péritonéale à travers le canal d&#39;injection. Nous avons observé une seule diffusion des cellules tumorales par voie intrapéritonéale à 50 animaux, et cela s&#39;est produit dans l&#39;un de nos premiers essais. On attribue ceci à l&#39;injection d&#39;un volume trop important de la suspension de cellules tumorales. Ceci a été corroboré par le fait que la réduction du volume de 50 à 40 ul a donné lieu à aucune autre fuite intrapéritonéale. Cette inoculation minimalement invasive de souris orthotopique xénogreffe de cancer de la vessie représente une modification innovatrice du «modèle intra-muros&quot; existant, bénéficiant à la fois l&#39;enquêteur et les animaux aussi. Les avantages de ce modèle d&#39;encourager son adaptation à d&#39;autres organes tels que les reins, de la prostate et du foie afin d&#39;établir des tumeurs de xénogreffe orthotopique de manière mini-invasive.

recherche sur le cancer est tributaire des modèles animaux de cancer humain utilisant des lignées cellulaires dérivées de tumeurs de patients afin d&#39;approfondir notre compréhension de la biologie de la tumeur. Pour l&#39;analyse in vivo de la croissance des sous différentes stratégies de traitement des modèles de cancer de la vessie murin orthotopique restent l&#39;étalon de référence de 1,2. L&#39;inoculation des cellules cancéreuses de la vessie humaines chez des souris immunodéprimées (modèle de xénogreffe) repose sur l&#39;instillation intravésicale (&quot;modèle intravésicale&quot;) 3,4,5 ou injection directe dans la paroi de la vessie (&quot;modèle intra-muros&quot;) 6,7. Les deux techniques peuvent également être effectuées sur des rats 8,9. Instillation intravésicale induit la formation de tumeurs sur la surface urothéliale de la vessie, qui sont susceptibles d&#39;être ensuite instillation intravésicale ultérieure de nouveaux agents thérapeutiques. Toutefois, le nombre de lignées cellulaires qui sont de façon fiable lorsque tumorigène envoyé par cette méthode est limitée d&#39;uned l&#39;une de ces lignées cellulaires, KU7, a récemment été démontré que les cellules HeLa 4,10. Instillation intravésicale est également beaucoup de temps en raison des temps de séjour nécessaires, et il induit souvent la croissance tumorale dans les éléments adjacents de l&#39;appareil urinaire, y compris l&#39;urètre, l&#39;uretère et bassinet 11. En outre, instillation intravésicale conduit souvent à la croissance de la tumeur sur le plancher de la vessie, où les uretères pénètrent dans la vessie, et cela peut provoquer une obstruction des voies supérieure et une insuffisance rénale concomitante. Xénogreffes de cancer de la vessie invasifs primaires qui sont appropriées pour des traitements systémiques sont créées par l&#39;injection directe de cellules tumorales dans la paroi de la vessie 12. Bien que de nombreuses lignées cellulaires croissent convenablement dans ce modèle, la limitation est le pouvoir envahissant du modèle relative à la nécessité d&#39;une incision abdominale 13. Le modèle est également difficile à apprendre en raison de la difficulté technique de l&#39;injection de cellules précisément dans la paroi du musclede la vessie. Une nouvelle approche pour établir des xénogreffes primaires orthotopiques de cancer invasif de la vessie chez les souris a été développé dans notre département afin de combler les lacunes existantes du «modèle intra-muros&quot;. Nous avons été en mesure d&#39;optimiser l&#39;injection percutanée guidée par ultrasons des cellules du cancer de la vessie dans la paroi antérieure de la vessie résultant de cette nouvelle technique de remplacer avec succès le modèle établi invasive. En outre, nous avons potentiellement accroître la précision et la reproductibilité du &quot;modèle intra-muros&quot;.

<table><tbody><tr><td>Gluconate de chlorhexidine (2 %)</td><td>Aplicare</td><td>82-319</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3008101</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Corporation</td><td>402-069-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,25 %)</td><td>Seringue</td><td>SH3004202</td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>(1 ml)</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille hypodermique (30 G ; &frac34 ; po)</td><td>Kendall</td><td>830340</td><td></td></tr><tr><td>Angiocathéter (24 G)</td><td>BD Bioscience</td><td>381112</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 Plateforme d’imagerie pour petits animaux</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RMV 706 Tête d’échographie</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

minimalement invasive création d&#39;murin orthotopique de la vessie xénogreffes

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Xénogreffes de cancer de la vessie orthotopique sont l&#39;étalon-or pour étudier manipulations cellulaires moléculaires et de nouveaux agents thérapeutiques in vivo. Des lignées cellulaires appropriées sont inoculés soit par instillation intravésicale (modèle de croissance invasive non musculaire) ou par injection intra-muros dans la paroi de la vessie (modèle de croissance invasive). Les deux procédures sont complexes et très chronophage. En outre, le modèle superficiel a ses défauts dus à l&#39;absence de lignées cellulaires qui sont tumorigènes instillation de ce qui suit. Injection intra-muros, d&#39;autre part, est marquée par le caractère invasif de la procédure et la morbidité associée à la souris hôte. Avec ces lacunes à l&#39;esprit, nous avons modifié les méthodes précédentes de développer une approche minimalement invasive pour la création de xénogreffes de cancer de la vessie orthotopique. Utilisation échographie nous avons effectué avec succès inoculation percutanée des lignées cellulaires de cancer de la vessie UM-UC1, UM-UC3 et UM-UC13 dans 50 nu athymiques. Nous avons pu démontrer que cette approche est temps efficace, précise et sûre. Avec cette technique, d&#39;abord un espace est créé sous la muqueuse de la vessie avec du PBS, et les cellules tumorales sont ensuite injecté dans cet espace, dans une deuxième étape. La croissance tumorale est surveillée à intervalles réguliers avec l&#39;imagerie par bioluminescence et les ultrasons. Les volumes tumoraux moyens ont augmenté de façon constante dans tout, mais l&#39;un de nos 50 souris sur la période d&#39;étude. Dans notre institution, cette nouvelle approche, qui permet de xénogreffe de cancer de la vessie inoculation de manière mini-invasive, rapide et très précis, a remplacé le modèle traditionnel.

<html> Injection intra-muros de trois lignées cellulaires de tumeurs différentes (UM-UC1 luc, UM-UC3 luc et UM-UC13 luc) a été réalisée dans 50 animaux sous échographie orientation sur trois jours consécutifs. L&#39;inoculation a été réalisée avec l&#39;efficacité (temps moyen de 5,7 min / animal) et n&#39;a pas été associée à des complications intra-ou post-interventionnelles. Le suivi de la croissance tumorale a été effectuée par imagerie par ultrasons et la bioluminescence. Le jour # 3 une tumeur a pu être détecté par échographie de la vessie antérieure de tous les 50 animaux [Figure 4 I]. 98% des souris ont montré une croissance tumorale constante au cours de la période de suivi [Figures 4 et 5]. Suite à l&#39;inoculation de UM-UC3 luc, une souris a développé la dissémination tumorale intrapéritonéale et la tumeur involution après jour # 7 dans un deuxième animal [Tableau 1]. Il s&#39;agissait du premier groupe de souris inoculées avec cette nouvelle technique. nt &quot;&gt; Les souris ont été sacrifiées le jour # 24, # 28 et # 37 après l&#39;inoculation de UM-UC3 luc, UM-UC1 luc et UM-UC13 luc, respectivement. tumeurs de xénogreffes ont été récoltées et examinées sur hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E ) sections. Toutes les tumeurs étaient muscle invasive et certains se sont infiltrés dans la graisse perivesical, mais pas d&#39;invasion dans des organes adjacents a été observée [Figure 6 I]. 60% des souris portant des tumeurs de luc UM-UC13 et 20% des souris porteuses de UM-UC3 luc tumeurs développées rétropéritonéale métastases ganglionnaires qui ont été confirmés par coloration H &amp; E [Figure 6 II]. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;image et l&#39;illustration schématique du dispositif expérimental. L&#39;souris est monté sur la table d&#39;opération chauffée (I) et maintenu sous anesthésie (&lt;strong&gt; II) avec le mélange d&#39;isoflurane / oxygène de 3%. Les membres inférieurs sont fixés avec une bande de caoutchouc (III). Après s&#39;approchant de la tête de balayage à ultrasons (IV) sur la peau (d&#39;alignement longitudinal avec un angle de 45-70 ° crânienne) la vessie (V) est visualisée sur l&#39;écran de l&#39;échographie. Une seringue avec une aiguille 30 G (VI) est guidé sur la peau sous un angle de 30 à 45 ° (de 80 à 90 ° par rapport à l&#39;axe longitudinal de la tête de balayage à ultrasons). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;immobilisation de la vessie. Dimensions illustration et de construire la sangle de stabilisation de la vessie (I) La sangle est attachée à l&#39;abdomen inférieur et immobilise la vessie (II). Ainsi, une évasion de la<html> la vessie lors de l&#39;injection intra-muros est évitée. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> Figure 3. Inoculation intra-muros de cellules tumorales. Visualisation de la vessie sur l&#39;écran d&#39;ultrasons (I). La perforation de la peau et des muscles de la paroi abdominale (II). l&#39;insertion dans la paroi de la vessie de l&#39;aiguille sans pénétration de la muqueuse (III). PBS (50 ul) entre la couche musculaire et la muqueuse après injection lente (IV). Les cellules tumorales en suspension dans Matrigel dans l&#39;espace intra-muros créé artificiellement (V, VI). 1123fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. . Suivi par échographie suivi continu par ultrasons montré une augmentation significative du volume de la tumeur (I: jour # 3, II: jour # 7, III: jour # 13). <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> Figure 5. Suivi par bioluminescence. Continu suivi par bioluminescence montré une augmentation constante de la luminescence au cours de la période d&#39;étude. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> Figure 6. Histologie de xénogreffe tumorale et métastase ganglionnaire., En somme section H &amp; E d&#39;une xénogreffe représentant tu<html> mor démontrant croissance invasive dans le muscle sans invasion dans les organes adjacents (I). 60% des souris portant des tumeurs de luc UM-UC13 et 20% des souris porteuses de UM-UC3 luc tumeurs métastases ganglionnaires rétropéritonéales présentés (II). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Lignée de cellules inoculées </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC3 luc </td><td style="width:64px;"> Luc UM-UC13 </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> Nombre de souris </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 20 </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Volume injecté, uL </td>idth: 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 40 </td><td style="width:64px;"> 50 </td><td style="width:64px;"> 50 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> La numération cellulaire absolue </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5,5 x 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Temps par animal, min </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,4 (± 1,6) </td><td style="width:64px;"> 7,7 (± 3,7) </td><td style="width:64px;"> 6,8 (± 2,9) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> L&#39;incidence tumorale </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (98%) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> 20 (100%) </td><td style="width:64px;"> 14 (93%) </td><td style="width:64px;"> 15 (100%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Métastases ganglionnaires </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (20%) </td><td style="width:64px;"> 9 (60%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Suivi (jours) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [avant le traitement] </td><td style="width:64px;"> 28 [avant le traitement] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Le volume des tumeurs (uL) </td><td style="width:64px;"> 4 jours </td><td style="width:64px;"> 11,6 (± 1,3) </td><td style="width:64px;"> 12,5 (± 1,7) </td><td style="width:64px;"> 14,4 (± 1,3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" rowdurée = &quot;hauteur: 61px; largeur: 64px;&quot; &quot;2&quot; style =&gt; </td><td style="width:64px;"> fin </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394,6 (± 72,4) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288,7 (± 66,1) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78,3 (± 13,4) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> suivi </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> Tumeur luminescence (photons / sec) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 4 jours </td><td style="width:64px;"> 4,6 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2,0 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5,8 x 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (± 9,4 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 3,7 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 1,3 x 10 8) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"style = &quot;height: 67px; largeur: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> fin </td><td style="width:64px;"> 1,9 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,4 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,5 x 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> suivi </td><td style="width:64px;"> (± 4,0 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 2,3 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 1,9 x 10 9) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Injection de cellules tumorales guidée par échographie - procédure et les résultats.

La technique établie pour inoculer des xénogreffes invasifs primaires de cancer de la vessie orthotopique nécessite une laparotomie et de mobilisation de la vessie. Cette procédure inflige une morbidité importante sur les souris, est techniquement difficile et de longue haleine. Nous avons donc développé une haute précision, approche percutanée utilisant un guidage échographique.

Minimalement invasive Création d&#39;murin orthotopique de la vessie xénogreffes

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

L'objectif général de cette procédure est de créer des xénogreffes orthotopiques de cancer de la vessie de manière rapide, précise et peu invasive. Cette étape est réalisée en premier lieu en amplifiant la lignée cellulaire tumorale spécifique et en suspendant les cellules tumorales dans du Matrigel. Ensuite, l'animal est placé sur la plateforme d'imagerie et la vessie est visualisée par échographie.Ensuite, les couches muqueuse et musculaire de la vessie sont séparées par une injection de sérum physiologique. Enfin, la suspension de cellules tumorales dans le Matrigel est injectée dans cet espace artificiellement créé. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant la croissance tumorale par imagerie échographique et bioluminescence.L'avantage principal de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, comme l'utilisation de la laparotomie pour l'inoculation de xénogreffes primaires, est qu'elle est rapide, précise et peu invasive. Les implications de ces techniques s'étendent au diagnostic et au traitement du cancer de la vessie, car les xénogreffes autochtones constituent la référence pour les études précliniques de nouveaux traitements. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'injection sont très difficiles à apprendre, et la paroi vésicale est très fine. La démonstration de cette procédure s'avérera donc cruciale.Igor Mosca est chercheur assistant et Wolfgang Yeager, chercheur postdoctoral. Tous deux sont urologues. Après avoir confirmé l'identité des lignées cellulaires humaines respectives de cancer de la vessie pour cette étude par empreinte génétique, utilisez un vecteur rétroviral lentiviral portant le gène de la luciférase de luciole pour l'analyse de croissance par bioluminescence de tumeurs xénogreffées afin de transfecter les lignées cellulaires.Lorsque vous êtes prêt à commencer la procédure, décongelez et utilisez le DMEM avec 10 % de FBS pour amplifier les lignées cellulaires existantes, puis incubez à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Pour préparer une suspension cellulaire à injecter après décongélation, ajoutez du matrigel et maintenez la trypsine au froid ; récupérez les cellules à 70 % de confluence et utilisez le milieu de croissance normal pour les resuspendre, puis comptez les cellules et centrifugez la suspension à 200 × g pendant cinq minutes. Après élimination du surnageant, ajoutez la quantité appropriée de volumes égaux de D-M-E-M-F-B-S et de MATRIGEL afin d'obtenir la concentration cellulaire souhaitée pour injecter un volume de 40 microlitres par animal.Mélanger soigneusement et éviter de créer des bulles d'air à partir de tout matériau plastique plat et rigide. Découper soigneusement un stabilisateur de vessie, inspecter la sangle et retirer toutes les arêtes tranchantes avant l'application sur les souris. Après avoir anesthésié les souris femelles avec 3 % d'isoflurane dans l'oxygène et effectué un pincement du orteil.Pour assurer une sédation adéquate, fixez l'animal sur la table d'imagerie chauffante de la plateforme d'imagerie pour petit animal et surveillez continuellement ses signes vitaux à l'aide d'un bandeau en caoutchouc. Immobilisez les membres inférieurs et utilisez du chlorhexidine digluconate à 0,5 % pour désinfecter l'abdomen avant de nettoyer la peau avec un coton stérile. Ensuite, à l’aide de la sangle de stabilisation de la vessie, immobilisez la vessie afin d’éviter tout déplacement pendant l’injection intramurale.Appliquez ensuite du gel échographique stérile sur l'abdomen inférieur. Avancez lentement la sonde échographique vers la peau et visualisez la vessie sur l'écran échographique. Si la vessie est vide, utilisez 50 microlitres de PBS tiède dans un cathéter angio de calibre 24 transurétral pour la remplir, afin de séparer les couches de la paroi vésicale.Commencez par fixer une seringue de 1,0 millilitre remplie de PBS, reliée à une aiguille de calibre 30 et de trois quarts de pouce, dans la pince à seringue. Placez l'aiguille vers la peau juste au-dessus du pubis. Sous un angle de 30 à 45 degrés, détectez l'aiguille sur l'écran d'échographie avant de percer lentement la peau et les muscles de la paroi abdominale.Ensuite, faites pivoter l'aiguille de 180 degrés de manière à ce que le biseau soit orienté vers l'arrière, puis insérez la pointe de l'aiguille dans la paroi de la vessie sans pénétrer la muqueuse. Pour créer un espace artificiel, injectez lentement 50 microlitres de PBS entre la couche musculaire et la muqueuse avant de retirer l'aiguille. Pour injecter les cellules de cancer de la vessie, fixez une deuxième seringue de 1,0 millilitre remplie de la suspension de cellules cancéreuses dans du Matrigel, ainsi qu'une aiguille de calibre 30 et de longueur trois-quarts de pouce, au support de seringue.Dirigez la pointe de l'aiguille vers l'espace rempli de PBS. Injectez immédiatement 40 microlitres de la suspension dans cet espace. Puis retirez l'aiguille après avoir retiré la souris de la plateforme d'imagerie.Le maintenir dans un environnement chaud et confortable sous surveillance continue. Une fois que l'animal a retrouvé conscience et une marche normale, le replacer dans sa cage d'origine. Une injection intramuraire de trois lignées cellulaires tumorales différentes a été réalisée chez 50 animaux sous guidage échographique pendant trois jours consécutifs.L'inoculation a été réalisée de manière efficace et n'a été associée à aucune complication intra- ou post-interventionnelle. La surveillance de la croissance tumorale a été effectuée par imagerie échographique et bioluminescence. Au troisième jour, une tumeur a pu être détectée par échographie dans la vessie antérieure des 50 animaux, et 98 % des souris ont présenté une croissance tumorale constante pendant la période de suivi suivant l'inoculation de uc.Three.L'un des souris a développé une dissémination tumorale intrapéritonéale et la tumeur a régressé après le septième jour chez un second animal. Il s'agissait du premier groupe de souris inoculées avec cette nouvelle technique après l'inoculation de uc.Three. Luke uc, un Luke et uc.13 Luke. Les souris ont été sacrifiées respectivement aux jours 24, 28 et 37. Les tumeurs xénogreffées ont été prélevées et examinées par des coupes H et D.Toutes les tumeurs étaient infiltrantes au niveau musculaire et certaines pénétraient dans la graisse périvertérienne, mais aucune invasion d'organes adjacents n'a été observée. 60 % des uc, 13 Luke et 20 % des uc. Trois souris porteuses de tumeurs Luke ont développé des métastases dans les ganglions lymphatiques rétropéritonéaux, confirmées par une coloration hématoxyline-éosine.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois minutes. Une familiarité avec l'imagerie par échographie est un prérequis pour effectuer cette procédure. Après que les tumeurs ont été inoculées de cette manière, l'échographie nous permet non seulement de surveiller la croissance tumorale au fil du temps, mais aussi d'examiner la perfusion tumorale à l'aide de microbulles. Elle nous permet également d'effectuer des injections intratumorales avec de nouveaux agents expérimentaux.

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