Minimalement invasive Création d'murin orthotopique de la vessie xénogreffes

L’objectif global de cette procédure est de créer des xénogreffes orthotopiques de cancer de la vessie de manière rapide, précise et peu invasive. Ceci est accompli en élargissant d’abord la lignée cellulaire tumorale particulière et en suspension des cellules tumorales dans Matrigel. Ensuite, l’animal est monté sur la plate-forme d’imagerie et la vessie est visualisée par échographie.

Ensuite, les couches muqueuses et musculaires de la vessie sont séparées par une injection de solution saline. Enfin, la suspension de matrigel de cellules tumorales est injectée dans cet espace créé artificiellement. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la croissance tumorale grâce à l’imagerie par ultrasons et à la bioluminescence.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes, telles que l’utilisation de la laparotomie pour l’inoculation de xénogreffes primaires, est que cette approche est rapide, précise et peu invasive. Les implications de ces techniques s’étendent au diagnostic et au traitement du cancer de la vessie, car les auto-xénogreffes sont l’étalon-or pour l’étude préclinique de nouveaux traitements. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’injection sont assez difficiles à apprendre et l’eau est très mince.

Igor Mosca a un assistant de recherche et Wolfgang Yeager, un boursier postdoctoral. Les deux sont urologues après avoir confirmé l’identité des lignées cellulaires respectives du cancer de la vessie humaine. Pour cette étude par empreinte génétique, utilisez une construction lentivirale portant le gène de la luciférase pour l’analyse de la croissance de la bioluminescence des tumeurs xénogreffées afin de transfecter les lignées cellulaires.

Lorsque vous êtes prêt à commencer la procédure, décongelez et utilisez du DMEM avec 10 % de FBS pour élargir les lignées cellulaires existantes, incubez à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Pour préparer une suspension cellulaire pour injection après décongélation, matrigel et maintien sur glace trypsine yeux, 70 % cellules de confluence et utiliser un milieu de croissance normal pour suspendre, puis compter les cellules et faire tourner la suspension à 200 fois G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, ajouter la quantité appropriée de volumes égaux de D-M-E-M-F-B-S et de MATRIGEL pour atteindre la concentration cellulaire souhaitée pour l’injection d’un volume de 40 microlitres par animal.

Mélangez bien et évitez de créer des bulles d’air à partir de tout type de matière plastique plate et rigide. Coupez un stabilisateur de vessie, inspectez soigneusement la sangle et retirez tous les bords tranchants avant de l’appliquer sur les souris. Après avoir anesthésié des souris femelles avec 3 % d’isoflurane dans de l’oxygène et effectué un pincement des orteils.

Pour assurer une sédation adéquate, montez l’animal sur la table d’imagerie chauffante de la plateforme d’imagerie des petits animaux, en surveillant continuellement ses signes vitaux à l’aide d’un élastique. Fixez les membres inférieurs et utilisez du gluconate de chlorhexidine à 0,5 % pour désinfecter l’abdomen avant d’utiliser un coton-tige stérile pour essuyer la peau. Ensuite, à l’aide de la sangle de stabilisation de la vessie, immobilisez la vessie pour éviter une évasion de celle-ci lors de l’injection intra-murale.

Appliquez ensuite du gel à ultrasons stérile sur le bas-ventre. Faites avancer lentement l’échographie, dirigez-vous vers la peau et visualisez la vessie sur l’écran de l’échographie. Si la vessie est vide, utilisez 50 microlitres de PBS chaud dans un angio-cathéter transurétral de calibre 24 pour le remplir afin de séparer les couches de la paroi de la vessie.

Commencez par fixer une seringue de 1,0 millilitre remplie de PBS et connectée à une aiguille de 30 calibre 30 de trois quarts de pouce à la pince de seringue. Positionnez l’aiguille vers la peau juste au-dessus de l’os pubien. À un angle de 30 à 45 degrés, détectez l’aiguille sur l’écran d’échographie avant de perforer lentement la peau et les muscles de la paroi abdominale.

Ensuite, tournez le biseau de l’aiguille de 180 degrés pour qu’il soit tourné vers l’arrière et insérez la pointe de l’aiguille dans la paroi de la vessie sans pénétrer dans la muqueuse. Ensuite, pour créer un espace artificiel, injectez lentement 50 microlitres de PBS entre la couche musculaire et la muqueuse avant de retirer l’aiguille. Pour injecter des cellules cancéreuses de la vessie, fixez une deuxième seringue de 1,0 millilitre remplie de suspension de matrigel de cellules cancéreuses et une aiguille de trois quarts de pouce de calibre 30 à la pince de seringue.

Guidez la pointe de l’aiguille vers l’espace rempli de PBS. Je viens de créer et d’injecter 40 microlitres de suspension dans l’espace. Retirez ensuite l’aiguille après avoir démonté la souris de la plate-forme d’imagerie.

Conservez-le dans un environnement chaud et confortable sous surveillance continue. Après avoir repris conscience et s’être promené normalement, remettez l’animal dans sa cage d’origine. L’injection intra-muros de trois lignées cellulaires tumorales différentes a été réalisée chez 50 animaux sous guidage échographique pendant trois jours consécutifs.

L’inoculation a été réalisée efficacement et n’a pas été associée à des complications intra ou post-interventionnelles. Le suivi de la croissance tumorale a été effectué par imagerie par ultrasons et bioluminescence. Le troisième jour, une tumeur a pu être détectée par échographie dans la vessie antérieure des 50 animaux, et 98 % des souris ont présenté une croissance tumorale constante pendant la période de suivi suivant l’inoculation de la colite ulcéreuse. Trois.

Luke, une souris, a développé une dissémination tumorale intrapéritonéale et la tumeur s’est involuée après le septième jour chez un deuxième animal. C’était le premier groupe de souris inoculé avec cette nouvelle technique après l’inoculation de la colite ulcéreuse. Trois. Luc uc, un Luc, et uc.

13 Luc. Les souris ont été sacrifiées respectivement aux jours 24, 28 et 37. Les tumeurs xénogreffées ont été prélevées et examinées via des coupes h et d.

Toutes les tumeurs étaient invasives sur le plan musculaire et certaines se sont infiltrées dans la graisse perviscérale, mais aucune invasion dans les organes adjacents n’a été observée. 60 % de la colite ulcéreuse, 13 de Luke et 20 % de la colite ulcéreuse. Trois souris porteuses d’une tumeur Luke ont développé des métastases ganglionnaires rétropéritonéales, qui ont été confirmées par une coloration h et e.

Une fois la maîtrise, cette technique peut être réalisée en trois minutes. La familiarité avec l’imagerie par ultrasons est une condition préalable à la réalisation de cette procédure Après que les tumeurs ont été inoculées de cette manière, l’échographie nous permet non seulement de surveiller la croissance tumorale au fil du temps, mais également d’examiner la perfusion tumorale avec des microbulles. Il nous permet également de réaliser des injections intratumorales avec de nouveaux agents expérimentaux.