Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier Chlamydia Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de quantifier la dynamique de croissance des inclusions de chlamydia dans les cellules vivantes. Ceci est accompli en générant d’abord des cellules hôtes fluorescentes qui expriment de manière stable une protéine fluorescente telle que la GFP dans leur cytoplasme. Ensuite, les cellules hôtes sont infectées par la chlamydia et laissées incuber.

Ensuite, les cellules infectées sont visualisées par microscopie à fluorescence en direct. Enfin, les caractéristiques des inclusions de chlamydia sont quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse au microscope ; finalement, la microscopie à fluorescence en direct est utilisée pour visualiser les inclusions de chlamydia dans la cellule hôte et pour mesurer les paramètres biologiques des inclusions afin d’obtenir des résultats quantitatifs. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le dénombrement basé sur les anticorps sont que cette stratégie d’imagerie inverse peut être utilisée sur des cellules vivantes et également en collaboration avec d’autres marqueurs fluorescents pour quantifier la dynamique d’inclusion de toutes les espèces de chlamydia.

De plus, contrairement aux méthodes de routine qui marquent les bactéries dans les cellules, cette approche met en lumière la membrane d’inclusion dans les cellules vivantes et peut ainsi révéler des propriétés dynamiques importantes de ce compartiment contenant des agents pathogènes. Après avoir généré des cellules hela fluorescentes, selon la plaque de protocole de texte, les cellules GFP Hela sur un récipient de culture souhaité, tel que des boîtes à fond de verre pour l’imagerie haute résolution 4 plaques à 24 puits pour la détermination de l’IFU et le criblage multi-puits, décongelent un tube congelé contenant du crich cotus, ou toute autre souche de chlamydia souhaitée sur de la glace et diluent dans HBSS à la multiplicité d’infection souhaitée. Pour effectuer une infection statique avec Crich Cotus, LGV zéro VL deux aspire le milieu des puits et utilise HBSS pour laver les cellules GFP hela.

Ajoutez des bactéries diluées dans les puits et incubez à 25 degrés Celsius pendant deux heures, aspirez les cellules et lavez-les avec HBSS. Ensuite, après avoir ajouté un milieu de croissance, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pour effectuer une infection assistée par centrifugation avec du crich au sérovar D ou à toute autre souche de chlamydia. Utilisez HBSS pour laver les cellules hela GFP et ajouter des bactéries diluées aux cellules.

Placez ensuite la boîte de cellules infectées dans un support de plaque à plusieurs puits d’un rotor à godets oscillant dans une centrifugeuse de paillasse. Centrifugez les cellules à 900 fois G et 25 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, placez les récipients de culture dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une armoire de biosécurité, aspirez les cellules, lavez-les deux fois avec HBSS et ajoutez un milieu de croissance.

Incuber la boîte de cellules infectées à 37 degrés Celsius. Pour visualiser les inclusions de chlamydia, retirez les cellules hela GFP infectées par la chlamydia de l’incubateur de dioxyde de carbone et utilisez du RPMI sans rouge de phénol et 5 % FBS Pour remplacer le support, placez la parabole ou la plaque multipuits sur un microscope à fluorescence inversée avec un objectif à huile de 20 x ou plus. À l’aide d’un logiciel d’imagerie, identifiez les cellules hela GFP infectées par la chlamydia qui apparaissent comme des cellules vertes contenant de grands trous noirs.

Dans la boîte de dialogue de configuration de l’acquisition, configurez le logiciel pour acquérir le canal vert et tout autre canal ajouté dans l’échantillon. Utilisez le bouton d’enregistrement de capture slash pour acquérir l’image aux moments souhaités. Après l’infection. Retirez les cellules hela GFP infectées par la chlamydia de l’incubateur et placez la parabole sur un microscope à fluorescence à onduleur.

Focus sur les plaines moyennes des cellules où les inclusions sont à leur diamètre et à leur rendement maximum. Les bords nets permettent d’acquérir des images dans au moins 10 champs par puits. Les puits représentent généralement des répétitions ou des variables expérimentales.

Pour rechercher des cellules hela GFP sous l’onglet mesures, utilisez la commande rechercher des objets et sélectionnez le canal vert. Ajustez l’intensité du seuil en fonction de l’intensité relative des cellules. Comptez manuellement le nombre d’inclusions ou de compartiments noirs et de cellules hela GFP par œil ou utilisez les algorithmes d’un logiciel d’imagerie pour identifier et compter automatiquement les inclusions.

Filtrez les objets sélectionnés en ne conservant que ceux de plus de cinq micromètres carrés. Appelez cela la première population. À l’aide de cette population, appliquez la commande Remplir les trous dans les objets comme l’entrée cette étape génère la population deux.

Soustraire la population un de la population deux pour obtenir des inclusions de chlamydia marquées positivement désignées comme population trois. Utilisez la commande filter population pour appliquer un filtre de taille à la population trois. Par exemple, si vous conservez des objets de plus de 25 micromètres carrés pour les inclusions dans les cellules, infectés pendant 24 heures ou plus longtemps pour les périodes d’infection précoces, définissez le filtre de taille pour conserver les objets de plus de quatre micromètres carrés.

Comme ces inclusions sont beaucoup plus petites, le filtre de taille entraîne une population d’objets désignés comme inclusions. Utilisez le logiciel d’imagerie pour calculer des données quantitatives à partir des images, telles que le nombre d’inclusions, l’inclusion, la taille et l’inclusion. La circonférence lors de l’infection par des inclusions de chlamydia est facilement visible sous forme de taches noires et les cellules hôtes ou la protéine fluorescente exprimant la chlamydia dans les cellules hôtes, et leur clarté peut être exploitée pour l’identification automatisée dans de nombreux champs de vision et/ou traitements.

Comme le montre ce graphique, l’une des principales applications est la détermination des unités formant des inclusions de chlamydia dans des cellules infectées vivantes, ce qui évite le besoin de procédures d’immunofluorescence, qui sont à la fois longues et coûteuses. Une autre caractéristique clé de cette approche d’imagerie est qu’elle peut être facilement appliquée à n’importe quelle espèce ou souche de chlamydia. Dans cet exemple, une analyse temporelle des cellules hela GFP infectées par l’une des quatre espèces ou souches de chlamydia a été effectuée pour chacune de ces espèces et souches.

Les inclusions ont été marquées et analysées pour calculer leur aire moyenne, leur périmètre, leur longueur et leur nombre par cellule aux moments indiqués. Ces attributs fournissent des informations importantes sur la biologie des inclusions de chlamydia, y compris sur la façon dont elles interagissent avec la cellule hôte. Voici une vidéo de cellules helmatiques infectées par le GFPC, Tracom L deux composée d’images en accéléré prises à cinq minutes d’intervalle pendant 125 minutes, à partir de 48 heures après l’infection.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser cette technique d’imagerie inverse non seulement pour visualiser les inclusions de Chlamydia, mais aussi pour quantifier la dynamique des inclusions telles que la zone d’inclusion, le périmètre et le nombre d’inclusions par cellule. Cette technique est rentable par rapport aux techniques de visualisation plus traditionnelles et fonctionne avec toutes les espèces et souches de chlamydia.