Name: Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier Chlamydia Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence pour visualiser et quantifier la dynamique de croissance des inclusions de Chlamydia dans des cellules hôtes vivantes. Cette technique permet d'analyser en temps réel l'infectiosité de Chlamydia.

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Les auteurs remercient Ian Clarke et P. Scott Hefty pour les plasmides pGFP-SW2 et pASK-GFP-mKate2-L2, respectivement. Nous remercions Paul Miller pour l’assistance technique et Richard Stephens pour les autres ressources. Ce travail a été financé par une subvention AI095603 des NIH (KH).

1. Génération de lignées cellulaires hôtes Fluorescent <ol><li> Jour 1. Plate cellules 293T (ou autre ligne d&#39;emballage retroviral) sur des plaques à 6 puits à 2 x 10 6 cellules / puits, à ~ 75% de confluence le lendemain. Si on le souhaite, la plaque de puits en double pour chaque rétrovirus à être utilisés. </li><li> Jour 2. Aspirer cellules et ajouter 2 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamine). Transfecter des cellules avec 5-8 ug de chaque vecteur retroviral (contenant la GFP) et le vecteur de l&#39;emballage (par ex., PVSVg) en utilisant de la Lipofectamine 2000 ou similaire réactif et en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Incuber les cellules avec de l&#39;ADN de 4-6 heures dans un incubateur à CO 2 C 37 ° C, et ensuite remplacer milieu avec 1 ml de milieu de croissance. </li><li> Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 ° C CO 2 incubateur. </li><li> Jour 3. cellules de plaques cibles (par ex., HeLa) sur des plaques à 6 puits à une densité approximative de 10 5 cellules / puits, à ~ 50% de confluence lele prochain jour. Vérifier positif transfection dans des cellules 293T en surveillant fluorescence de la GFP sur un microscope inversé. </li><li> Jour 4. Recueillir surnageants hors des cellules 293T aide d&#39;une pipette et filtrer le surnageant à travers un filtre d&#39;acétate de la seringue de 0,45 um de cellulose contenant un rétrovirus. </li><li> Retirer moyen de cellules HeLa et ajouter du milieu 0,5 ml de croissance contenant 16 pg / ml de polybrène. Ajouter ~ 0,5 ml de rétrovirus filtrée aux cellules goutte à goutte et incuber les cellules dans un C CO 2 incubateur à 37 ° pendant 24 heures. Rangez les éventuels rétrovirus restants (à savoir, à partir du puits en double) à 4 ° C. </li><li> Jour 5. Si les puits en double ont été effectués afin de générer rétrovirus supplémentaire, répétez l&#39;étape 1.7 pour infecter en série avec les particules rétrovirales restants. </li><li> Jour 6. Passage transfectées cellules HeLa 1: 1 dans une boîte de 10 cm contenant le choix des antibiotiques (par exemple, 500 ug / ml de néomycine). </li><li> Attendez suffisamment de temps pour les cellules transduites à repousser en présence de sélection antibiotic, après quoi les cellules peuvent être propagées par des techniques standard avec une concentration plus faible de sélection antibiotique (par ex., 200 pg / ml de néomycine). Note: Les cellules peuvent également être choisis par clonage pour la luminosité idéale à ce moment, si nécessaire. </li></ol> 2. Génération de la GFP exprimant Chlamydia trachomatis <ol><li> Préparer 2x CaCl2 tampon (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM de CaCl2) et le tampon 4SP (0,4 M de saccharose, 16 mM de Na 2 HPO 4). </li><li> Jour 1. Décongelez C. trachomatis de stock sur la glace et diluer immédiatement 10 bactéries ul dans 50 pl 2x tampon CaCl 2. Ajouter 3 ADN plasmidique pg (par ex., PASK-GFP-mKate2-L2), bien mélanger et incuber pendant 30 min à 25 ° C. </li><li> Au cours de cette étape, la préparation des cellules hôtes par trypsinisation un flacon T-75 de cellules de McCoy dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspend culot cellulaire en volume approprié de tampon de CaCl2 1x pour donner une concentration finale de 4 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Après l&#39;incubation de 30 minutes (de l&#39;étape 2.2), ajouter 100 ul de cellules de McCoy préparés tube de mélange de transformation (volume total 200 ul) et incuber 20 minutes supplémentaires à 25 ° C. Ajouter 100 ul de ce mélange de cellules transformées à un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits avec du milieu de recouvrement et 2 ml de la croissance. Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 2 jours. </li><li> Jour 3. Lyse cellules McCoy infectées par le C. trachomatis en remplaçant moyenne avec 1 ml dH 2 O et le grattage des cellules avec une pipette de 1000 pi plié. Ajouter 1 ml de tampon 4SP et passer la suspension à travers une aiguille de 27,5 G ~ 5 fois pour la lyse cellulaire efficace et la libération de C. trachomatis. </li><li> Transfer 2 ml de lysat cellulaire contenant C. trachomatis dans un flacon T-75 contenant une monocouche confluente de fraîchement plaqué McCcellules Oy; ajouter 8 ml de DMEM (sans FBS) et incuber pendant 2 heures à 25 ° C pour permettre C. trachomatis à adhérer aux cellules. </li><li> Aspirer les cellules et ajouter milieu de croissance frais supplémenté avec 10 U / ml de pénicilline G et 1 ug / ml de cycloheximide. Incuber pendant 48 h ballon dans un incubateur à 37 ° C de CO 2. </li><li> Jour 4. Vérifiez par microscopie optique que les cellules sont infectées et les inclusions contiennent Chlamydia aberrante. Identifier les inclusions que vacuoles lumineuses sur un microscope optique standard, et les organismes de Chlamydia aberrantes comme des objets en forme d&#39;anneau dans inclusions qui sont supérieures à 2 pm de diamètre. </li><li> Jour 5. Lyse culture en remplaçant moyenne avec 2 ml dH2Û et gratter les cellules en suspension. Ajouter 2 ml de tampon 4SP et passer la suspension à travers une aiguille de 27,5 G ~ 5 fois. </li><li> Utiliser 2 ml de lysat cellulaire à infecter une monocouche fraîche de cellules de McCoy dans un seul puits dans une plaque à 6 puits. Incuber les cellules avec lysat pendant 2 heures à 25 ° C, aspirer et ajouter croissance fraismilieu contenant de la pénicilline G et cycloheximide. </li><li> Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C de CO 2 pendant 3-5 jours, en fonction de la santé générale des cellules. </li><li> Répétez les étapes 2.9-2.10 une ou plusieurs fois, selon les besoins, les cultures des passages dans des puits frais dans une plaque à 6 puits jusqu&#39;à ce que les inclusions d&#39;apparence normale (dépourvus de corps aberrantes) ont vu le jour. A ce moment utiliser un microscope inversé à fluorescence pour vérifier que C. trachomatis exprimer mKate2 (rouge). </li><li> Intensifier les cultures infectées pour la production des stocks de Chlamydia de titre élevé, par exemple en récoltant transformants Chlamydia à partir de cellules McCoy ou HeLa infectées cultivées en flacons T-150. </li></ol> 3. infection de cellules avec Chlamydia <ol><li> Plate cellules HeLa GFP-sur récipient de culture souhaitée, par exemple des plats de fond de verre ou des diapositives de la chambre pour l&#39;imagerie haute résolution, ou des plaques à 24 puits pour la détermination IFU et le dépistage à puits multiples. </li><li> Décongeler froTube zen contenant C. trachomatis, C. muridarum, ou C. pneumoniae sur de la glace et diluées dans du HBSS à la multiplicité désirée de l&#39;infection (MOI), par exemple MOI = 1. </li><li> Effectuer infections statiques ou assistée par centrifugation en fonction de la souche de Chlamydia particulier qui sera utilisé. <ol><li> Pour les infections à C. trachomatis LGV sérotype L2 ou C. muridarum, laver les cellules GFP-HeLa avec HBSS et incuber des bactéries dilué pendant 2 heures à 25 ° C. Aspirer et laver les cellules avec HBSS, et incuber les cellules dans un milieu de croissance de 37 ° C CO 2 incubateur. </li><li> Pour les infections à C. trachomatis serotype D ou C. pneumoniae, laver les cellules GFP-HeLa avec HBSS et ajouter des bactéries aux cellules dilué. Placez plaque multi-puits ou un plat à fond de verre (fixé par un ruban dans un couvercle de plaque multi-puits) dans un support de plaque à puits multiples d&#39;un rotor attachement à godet oscillant dans une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Centrifuger les cellules à 900 g à 25 ° C pendant 1 h. </li&gt; <li> Retirer les contenants de la culture d&#39;une centrifugeuse et placer dans un incubateur à 37 ° C CO 2 pendant 1 heure. </li><li> Aspirer cellules dans une enceinte de sécurité biologique, laver les cellules deux fois avec HBSS, et ajouter du milieu de croissance frais. La place des cellules dans un C CO 2 incubateur à 37 °. </li></ol></li></ol> 4. cellules vivantes Visualisation de Chlamydia Inclusions <ol><li> Retirer Chlamydia infectés cellules GFP-HeLa de CO 2 incubateur et remplacer moyenne avec RPMI sans rouge de phénol + 5% de FBS. </li><li> Cellules de montage sur un microscope à fluorescence inversé (Nikon Eclipse Ti-E ou similaire) en utilisant un objectif 20X ou plus d&#39;huile. </li><li> En utilisant un logiciel d&#39;imagerie (Volocity 6 ou similaire), se concentrer sur et identifier les cellules infectées par Chlamydia GFP-HeLa: cellules vertes contenant de grandes trous noirs (inclusions de Chlamydia). </li><li> Marquer les endroits xyz de régions contenant des cellules infectées par Chlamydia d&#39;intérêt en utilisant un logiciel d&#39;imagerie (Volocity 6 ou similaire). Effectuez cette manuellement par «Ajout de points de la tandis que dans le mode d&#39;affichage XY scène. De cette manière, coordonnées XYZ sont enregistrées pour chaque emplacement marqué. </li><li> Dans la boîte de dialogue de configuration d&#39;acquisition, configurer le logiciel pour acquérir verte (GFP, HeLa cytosol) et rouge (mKate2, C. trachomatis) chaînes, et à un taux de nouvelles images par canal toutes les 5 min. </li><li> Acquérir la séquence d&#39;images en utilisant l&#39;acquisition protocole est entré ci-dessus en cliquant sur le &quot;Capture / Enregistrement&quot; bouton. </li></ol> 5. La quantification des paramètres de croissance d&#39;inclusion dans les cellules vivantes <ol><li> À certains moments souhaités post-infection (par ex., 24, 48 HPI) éliminer les cellules infectées par Chlamydia GFP-HeLa de l&#39;incubateur et monter sur un microscope à fluorescence inversé. Note: Un objectif 20X ou 40X air avec une haute NA est le mieux adapté pour les plaques à 24 puits, et un objectif de l&#39;huile 40X est recommandé pour les diapositives de la chambre. Cultiver les cellules de chaque substrat pour cet âneAy. </li><li> Focus sur plan médian de cellules, où les inclusions sont à leur diamètre maximum et obtenir des bords nets. </li><li> Acquérir les images pour les nombreux domaines dans chaque puits (au moins 10 par puits); puits représentent généralement les répliques ou les variables expérimentales. </li><li> Énumérer le nombre d&#39;inclusions manuellement, par l&#39;oeil (les inclusions sont compartiments noirs dans les cellules HeLa-GFP) ou utiliser des algorithmes de logiciels d&#39;imagerie pour identifier automatiquement et compter inclusions. <ol><li> Trouver cellules GFP-HeLa par l&#39;intensité de fluorescence («Trouvez les objets de la commande) et d&#39;ajuster l&#39;intensité de seuil de fluorescence en fonction des intensités relatives des cellules. </li><li> Filtrer les objets sélectionnés à l&#39;aide des lignes directrices de la taille de garder ceux-là seulement supérieure à 5 pm 2. Ceci est «population 1 &#39;. </li><li> Appliquer &quot;remplir les trous dans les objets de la commande à l&#39;aide de« population 1 &#39;comme entrée. Cette étape génère «population 2 &#39;. </li><li> «Population 1 &#39;Soustraire de&#39; population 2 &#39;pour donner positivement marqué inclusions de Chlamydia, désignés comme «population 3&#39;. </li><li> Appliquer un filtre de taille pour &#39;population 3&#39; (&#39;Filtrez population&#39; commande), par exemple des objets de maintien supérieure à 25 um 2 pour les inclusions dans les cellules infectées pendant 24 heures ou plus. Pour des temps de début de l&#39;infection, comme avant 18 heures, réglez filtre de taille pour garder les objets de plus de 4 pm 2, que ces inclusions sont beaucoup plus petits. Les résultats de filtrage de taille dans une population d&#39;objets désignés comme des «inclusions». </li><li> Calculer des données à partir d&#39;images quantitative, par exemple, le numéro de l&#39;inclusion, la taille de l&#39;inclusion, et l&#39;inclusion circonférence, en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+infections%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).</li>
<li>Schachter, J. Infection and disease epidemiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchachter%2C+J+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).</li>
<li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).</li>
<li>Hackstadt, T. Cell biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHackstadt%2C+T+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells%3A+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li>
<li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li>
<li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li>
<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous décrivons ici la stratégie expérimentale pour générer des cellules hôtes fluorescents pour de vrai visualisation et l&#39;analyse des inclusions de Chlamydia temps. Cette approche vacuole de visualisation confère la capacité puissante pour éclairer, de suivre et de mesurer quantitativement les propriétés dynamiques des inclusions à Chlamydia dans les populations de cellules ou dans des cellules individuelles au fil du temps. Inclusions de Chlamydia dans les cellules de protéine marquée fluorescent...

Les maladies infectieuses causées par des espèces de la bactérie Chlamydia intracellulaire suscitent un fardeau important sur ​​la santé mondiale, y compris les maladies sexuellement transmissibles, la maladie inflammatoire pelvienne, la cécité, la pneumonie et, éventuellement, l&#39;athérosclérose 1-4. La capacité de Chlamydia d&#39;interagir avec la cellule hôte, à partir de l&#39;intérieur d&#39;une vacuole (appelée inclusion), est un facteur déterminant de leur infection réussie de cellules et de l&#39;hôte. L&#39;inclusion est un compartiment pathogène roman qui permet la croissance de la chlamydia et est modifié dynamiquement tout au long du cycle de développement 2-3 jours de Chlamydia 5. La nature intracellulaire obligatoire de Chlamydia présente de nombreux défis à la communauté de la recherche, en particulier pour étudier directement la biologie unique de l&#39;inclusion. Un handicap majeur a été l&#39;incapacité de visualiser efficacement soit Chlamydia intracellulaire ou leur inclusion par l&#39;approche fluorescentees dans les cellules vivantes. Une découverte récente a finalement révélé les moyens de générer exprimant la GFP C. 6 trachomatis; Toutefois, cette constatation n&#39;a pas encore abouti à un étiquetage spécifique de l&#39;inclusion. Certaines techniques ont été décrites pour l&#39;étiquetage des bactéries et des inclusions 7,8, mais ils souffrent de lacunes tels que la non-spécificité, l&#39;éphémère et la susceptibilité à photoblanchiment. Une découverte clé de notre groupe a établi une nouvelle stratégie pour éclairer l&#39;inclusion en utilisant exprimant la GFP cellules hôtes 9. Cette stratégie exploite rationnellement l&#39;imperméabilité intrinsèque de la membrane de l&#39;inclusion de molécules supérieur à 10 520 Da. Lorsque les cellules sont manipulées pour exprimer de façon stable une protéine fluorescente cytosolique particulier (par exemple, la GFP ou mCherry), inclusions à Chlamydia sont visibles avec une clarté remarquable par leur exclusion complète de la fluorescence. Cette stratégie d&#39;imagerie inverse permet la visualisation immédiate des inclusions pour tous Chlespèces amydia et il peut être facilement adaptés pour la plupart des cellules hôtes d&#39;intérêt. Comme une démonstration de son utilité, cette méthode a été utilisée précédemment pour révéler et de définir les voies de sortie cellulaires pour Chlamydia spp 9. Ici, nous démontrons encore comment cette méthode est effectuée, et peut être exploitée pour obtenir des données quantitatives clés sur la dynamique de croissance de l&#39;inclusion. En outre, il peut effectivement se substituer aux méthodes de dénombrement à base d&#39;anticorps coûteux et peut être utilisé en tandem avec d&#39;autres marqueurs fluorescents, comme mKate2 exprimant Chlamydia 11. Cette puissante combinaison d&#39;outils permet l&#39;exploration des propriétés physiques de la membrane de l&#39;inclusion Chlamydia intérieur des cellules hôtes de vie.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro ; filtres m</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 sans rouge phénol</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; chlamydia</em&gt; vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

La bactérie intracellulaire obligatoire Chlamydia fait peser un lourd fardeau sur la santé publique mondiale. C. trachomatis est la principale cause bactérienne d’infection sexuellement transmissible et également la principale cause de cécité évitable dans le monde. Un déterminant essentiel du succès de l’infection des cellules hôtes par la chlamydia est la capacité de la bactérie à manipuler la signalisation de la cellule hôte à partir d’un nouveau compartiment vacuolaire appelé inclusion. De l’intérieur de l’inclusion, Chlamydia acquiert les nutriments nécessaires à sa croissance développementale de 2 à 3 jours, et elle sécrète en outre un panel de protéines effectrices sur la face cytosolique de la membrane de la vacuole et dans le cytosol de l’hôte. Cependant, les lacunes dans notre compréhension de la biologie de Chlamydia présentent des défis importants pour la visualisation et l’analyse de ce compartiment intracellulaire. Récemment, une stratégie d’imagerie inverse permettant de visualiser l’inclusion à l’aide de cellules hôtes exprimant la GFP a été décrite. Cette approche exploite rationnellement l’imperméabilité intrinsèque de la membrane d’inclusion aux grosses molécules telles que la GFP. Dans ce travail, nous décrivons comment les cellules hôtes exprimant la GFP ou la mCherry sont générées pour la visualisation ultérieure des inclusions de chlamydia. De plus, il a été démontré que cette méthode se substitue efficacement aux méthodes coûteuses de dénombrement basées sur les anticorps, peut être utilisée en tandem avec d’autres marqueurs fluorescents, tels que Chlamydia exprimant la GFP, et peut être exploitée pour obtenir des données quantitatives clés sur la croissance des membranes d’inclusion à partir d’une gamme d’espèces et de souches de Chlamydia.

Les cellules de mammifères exprimant des protéines cytosoliques fluorescents (par exemple, GFP) peuvent être conçus pour permettre un éclairage d&#39;inclusions à Chlamydia, dans des cultures de cellules infectées vivantes. Lors de l&#39;infection à Chlamydia, les inclusions sont facilement visibles sous forme de taches noires dans les cellules hôtes (figure 1). La clarté des inclusions de fluorescence manque peut être exploitée pour l&#39;identification automatique des inclus...

Un procédé basé sur des protéines fluorescentes de cellules vivantes pour éclairer des vacuoles cellulaires (inclusions) contenant Chlamydia est décrit. Cette stratégie permet une détermination rapide et automatisée de l’infectiosité de Chlamydia dans les échantillons et peut être utilisée pour étudier quantitativement la dynamique de croissance des inclusions.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier la dynamique de croissance des inclusions chlamydiennes dans des cellules vivantes. Cela est réalisé en premier lieu en générant des cellules hôtes fluorescentes qui expriment de façon stable une protéine fluorescente telle que la GFP dans leur cytoplasme. Ensuite, les cellules hôtes sont infectées par la chlamydia et incubées.Ensuite, les cellules infectées sont visualisées par microscopie à fluorescence en temps réel. Enfin, les caractéristiques des inclusions de chlamydia sont quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse microscopique ; la microscopie à fluorescence en temps réel est ainsi utilisée pour visualiser les inclusions chlamydiennes au sein de la cellule hôte et mesurer les paramètres biologiques des inclusions afin d’obtenir des résultats quantitatifs. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le dénombrement basé sur les anticorps, sont que cette stratégie d’imagerie inverse peut être appliquée à des cellules vivantes et utilisée conjointement avec d’autres marqueurs fluorescents pour quantifier la dynamique des inclusions de toutes les espèces de chlamydia.En outre, contrairement aux méthodes courantes qui marquent les bactéries à l'intérieur des cellules, cette approche illumine la membrane de l'inclusion dans des cellules vivantes et peut ainsi révéler des propriétés dynamiques importantes de ce compartiment contenant le pathogène. Après avoir généré des cellules HeLa fluorescentes, selon le protocole indiqué, plaquez les cellules HeLa exprimant la GFP dans un récipient de culture approprié, tel que des boîtes avec fond en verre pour une imagerie haute résolution, ou des plaques 4 ou 24 puits pour la détermination des unités formant des inclusions (IFU) et les criblages multipuits. Décongelez un tube contenant Crich Cotus, ou toute autre souche de chlamydia souhaitée, sur de la glace et diluez-le dans du HBSS selon la multiplicité d'infection souhaitée. Pour réaliser une infection statique avec Crich Cotus, LGV sérovar 2, aspirez le milieu des puits et utilisez du HBSS pour laver les cellules HeLa GFP.Ajoutez des bactéries diluées dans les puits et incubez à 25 degrés Celsius pendant deux heures, aspirez les cellules et rincez avec du HBSS. Ensuite, après ajout du milieu de croissance, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur au dioxyde de carbone afin d'effectuer une infection assistée par centrifugation avec crich vers la sérovar D ou toute autre souche de chlamydia. Utilisez du HBSS pour laver les cellules HeLa GFP et ajoutez des bactéries diluées aux cellules.Ensuite, placer la boîte de cellules infectées dans un support de plaque multipuits d'un rotor à godets oscillants dans une centrifugeuse de banc. Centrifuger les cellules à 900 × g et à 25 degrés Celsius pendant une heure. Puis placer les récipients de culture dans une étuve à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une hotte de sécurité biologique, aspirer les cellules, les laver deux fois avec du HBSS et ajouter le milieu de croissance.Incuber la boîte de cellules infectées à 37 degrés Celsius. Pour visualiser les inclusions de chlamydia, retirer les cellules HeLa GFP infectées par la chlamydia de l'incubateur au dioxyde de carbone et utiliser du RPMI sans rouge de phénol et contenant 5 % de FBS pour remplacer le milieu. Placer la boîte ou la plaque multi-puits sur un microscope à fluorescence inversé équipé d'un objectif à immersion huile de 20 x ou supérieur. À l'aide d'un logiciel d'imagerie, identifier les cellules HeLa GFP infectées par la chlamydia qui apparaissent comme des cellules vertes contenant de grands trous noirs.Dans la boîte de dialogue de configuration de l'acquisition, paramétrez le logiciel pour acquérir le canal vert et tout autre canal ajouté à l'échantillon. Utilisez le bouton capture/enregistrement pour acquérir l'image aux moments souhaités après l'infection. Retirez les cellules HeLa GFP infectées par Chlamydia de l'incubateur et placez la boîte sur un microscope à fluorescence inversé.Se concentrer sur la région médiane des cellules, où les inclusions présentent leur diamètre et leur rendement maximaux. Acquérir des images aux bords nets dans au moins 10 champs par puits. Les puits représentent généralement des réplicats ou des variables expérimentales.Pour trouver les cellules HeLa GFP sous l'onglet mesures, utilisez la commande « trouver les objets » et sélectionnez le canal vert. Ajustez l'intensité du seuil en fonction des intensités relatives des cellules. Comptez manuellement le nombre d'inclusions ou de compartiments noirs et des cellules HeLa GFP à l'œil nu, ou utilisez des algorithmes de logiciel d'imagerie pour identifier et compter automatiquement les inclusions.Filtrez les objets sélectionnés en conservant uniquement ceux dont la surface est supérieure à cinq micromètres carrés. Désignez-les par population un. À l'aide de cette population, appliquez la commande de remplissage des trous dans les objets, l'entrée de cette étape générant la population deux.Soustrayez la population un à la population deux afin d'obtenir des inclusions de chlamydia marquées positivement, désignées comme population trois. Utilisez la commande filtrer la population pour appliquer un filtre de taille à la population trois. Par exemple, pour conserver les objets de plus de 25 micromètres carrés pour les inclusions dans les cellules infectées pendant 24 heures ou plus, définissez le filtre de taille afin de garder les objets supérieurs à quatre micromètres carrés pour les temps précoces d'infection.Étant donné que ces inclusions sont beaucoup plus petites, le filtrage par taille donne une population d'objets désignés comme des inclusions. Utilisez le logiciel d'imagerie pour calculer des données quantitatives à partir des images, telles que le nombre d'inclusions, la taille des inclusions et le périmètre des inclusions. Après infection par Chlamydia, les inclusions sont facilement visibles sous forme de taches noires ainsi que les cellules hôtes ou la protéine fluorescente exprimée par Chlamydia à l'intérieur des cellules hôtes, et leur netteté peut être exploitée pour une identification automatisée sur de nombreux champs d'observation et/ou traitements.Comme le montre ce graphique, une application majeure consiste à déterminer les unités formant des inclusions de chlamydia dans des cellules vivantes infectées, ce qui élimine la nécessité de recourir à des procédures d'immunofluorescence, à la fois longues et coûteuses. Une autre caractéristique essentielle de cette approche d'imagerie est qu'elle peut être facilement appliquée à n'importe quelle espèce ou souche de chlamydia. Dans cet exemple, une analyse cinétique de cellules HeLa exprimant la GFP infectées par l'une des quatre espèces ou souches de chlamydia a été réalisée pour chacune de ces espèces ou souches.Les inclusions ont été marquées et analysées afin de calculer leur périmètre, leur surface moyenne et leur nombre par cellule aux moments indiqués. Ces attributs fournissent des informations importantes sur la biologie des inclusions chlamydiennes, notamment sur leur interaction avec la cellule hôte. On voit ici une vidéo de cellules HeLa exprimant mCherry infectées par GFPC, Tracom L deux, composée d'images en prise de vue instantanée prises à des intervalles de cinq minutes pendant 125 minutes, en commençant 48 heures après l'infection.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cette technique d'imagerie inversée non seulement pour visualiser les inclusions chlamydiennes, mais aussi pour quantifier la dynamique des inclusions, comme la surface, le périmètre des inclusions et le nombre d'inclusions par cellule. Cette technique est économique par rapport aux méthodes de visualisation plus classiques et fonctionne avec toutes les espèces et souches de Chlamydia.

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