Souris humanisée modèle pour étudier les infections bactériennes Cibler la microvascularisation

L’objectif global de cette procédure est d’étudier les mécanismes par lesquels la bactérie de la méningite infecte les vaisseaux sanguins humains in vivo. Ceci est accompli en greffant d’abord de la peau humaine sur une souris immunodéficiente, introduisant ainsi des vaisseaux sanguins dermiques humains. Dans la deuxième étape, les souris humanisées sont infectées par la bactérie.

L’infection est alors laissée se poursuivre pendant une période de temps prédéterminée. Dans la dernière étape, des échantillons de sang et de tissus sont prélevés pour évaluer l’issue de l’infection. En fin de compte, une combinaison d’histologie, d’immunofluorescence et d’analyse de sang et de tissus est utilisée pour étudier la progression de l’infection dans les vaisseaux humains.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que les modèles de culture cellulaire ou les modèles animaux, est que, pour la première fois, nous pouvons observer la pathologie clinique typique qui se déroule lors de ces infections. Dès que possible après la collecte, nettoyez la surface de la peau humaine avec de l’éthanol à 70 %, puis posez-la à plat sur une surface bien propre, de préférence sous une hotte d’évacuation. Ensuite, utilisez un dermatome d’une épaisseur prédéfinie pour couper des tranches de 200 à 400 micromètres du haut de la peau.

Vérifiez l’intégrité des tranches, puis coupez-les davantage en carrés de deux centimètres sur deux. Placez les carrés dans le PBS, puis nettoyez la zone rasée d’une souris beige immunodéficiente sévère sévère préparée chirurgicalement âgée de six à huit semaines avec 70 % d’éthanol. Après avoir appliqué un anesthésique local sur le site de greffe, utilisez des ciseaux incurvés pour retirer soigneusement la couche superficielle de peau de souris dans une zone légèrement plus petite que les morceaux de greffe, en prenant soin de ne pas perturber le système vasculaire sous-jacent.

En agissant rapidement pour éviter de dessécher le greffon, placez l’une des tranches de peau humaine sur le lit de greffe, en vous assurant que la face épidermique est tournée vers le haut. Alignez le bord du tissu et fixez-le avec de la colle à tissu. Ensuite, ajustez soigneusement le reste de la peau humaine au lit de greffe, en plaçant de petites quantités de colle tissulaire autour de chaque bord.

Coupez toujours la peau humaine à la bonne taille plutôt que d’agrandir le lit de greffe. Après avoir vérifié que chaque coin est fixé, nettoyez la zone avec une solution iodée et appliquez un pansement fermement mais pas serré avec le côté coussin sur le greffon, en veillant à ce que la respiration de l’animal ne soit pas affectée, puis fixez le pansement avec du ruban adhésif et laissez l’animal récupérer sur une surface chaude. Une fois réveillé, retournez l’animal dans sa cage jusqu’à ce que l’injection bactérienne réinocule une culture sur plaque pendant la nuit en culture liquide.

Le matin de l’infection, lorsque les bactéries atteignent la concentration souhaitée, diluez les cellules à une fois 10 à la septième unité formant une colonie par millilitre. Puis après anesthésie, confirmer la sédation des souris greffées par l’orteil. Pincez et placez les animaux sur un coussin chauffant.

Placez une pommade pour les yeux sur les yeux de l’animal, puis ip. Injectez à chaque souris huit milligrammes de transfert humain dans une solution saline. Ensuite, pour chaque animal, coupez le bout de la queue et étalez une petite goutte de sang de la queue sur une plaque de gélose pour confirmer que le sang est stérile avant l’infection.

Injectez ensuite 100 microlitres de la culture bactérienne par voie intraveineuse par injection rétroorbitaire. Après quelques minutes, coupez à nouveau l’extrémité de la queue et étalez également cet échantillon de sang sur des plaques de gélose fraîches. Pour établir les unités formant la colonie sanguine immédiatement après l’infection, scellez la queue avec de la colle tissulaire, puis diluez l’inoculum bactérien et étalez-le sur des plaques de gélose avec les antibiotiques appropriés.

Pour établir les unités formant la colonie d’inoculum six heures après l’infection, prélevez une autre petite quantité de sang de chacune des queues de souris, puis diluez et mettez en plaque les gouttes de sang comme nous venons de le démontrer pour établir les unités formant la colonie à six heures. Ensuite, incubez toutes les plaques à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit pour effectuer la formation de colonies d’organes. Nombre d’unités des animaux infectés.

Commencez par faire une incision médiane chez chaque souris euthanasiée. Ensuite, pour chaque animal, coupez la côte et faites une incision dans le cœur. À l’aide d’une seringue stérile, prélevez le plus de sang possible du cœur et de la cavité thoracique, et distribuez-le dans des tubes stériles individuels pour chaque échantillon.

Ensuite, retirez les organes d’intérêt, puis transférez les greffes de peau et les sections de peau de souris qui les accompagnent sur une plaque stérile par animal. Laissez le sang collecté coaguler pendant 15 minutes, puis faites-le tourner. Ensuite, retirez le plasma du sang et conservez-le à moins 80 degrés Celsius pour une analyse ultérieure.

Ensuite, pesez les tubes d’homogénéisation contenant chacun 500 microlitres de PBS. Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie stérile pour prélever quatre échantillons de biopsie millimétriques de chaque tissu disséqué. Placez les biopsies individuellement dans les tubes d’homogénéisation avec une bille de deux millimètres dans chaque tube contenant un échantillon de peau.

Conservez les tissus restants dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pour la microscopie et pesez les tubes d’homogénéisation pour établir le poids de la biopsie. Ensuite, homogénéisez les échantillons à 6 000 tr/min pendant 30 secondes, en répétant l’homogénéisation de la peau jusqu’à ce que l’homogénat soit étourdi. Enfin, étalez les boues cellulaires de chaque tube sur des plaques de gélose fraîche et cultivez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Établir le nombre d’unités formant une colonie d’organes dans ces résultats représentatifs. Une souche de méningite à N positive à la GFP. Le sérogroupe C a été utilisé.

La numération globulaire a montré que cinq minutes après l’injection IV d’un fois 10 aux six unités formant une colonie de bactéries, il y avait une moyenne de 1,5 fois 10 à la cinquième unité formant une colonie par millilitre circulant dans le sang. Après six heures, les dénombrements sont en moyenne de 4,8 fois 10 à la quatrième colonie, formant des unités par millilitre après 24 heures. Les dénombrements moyens étaient de 2,4 fois 10 à la quatrième colonie formant des unités par millilitre.

Mais dans ce groupe de 10 souris, cinq n’avaient aucune bactérie circulante détectable, tandis que les cinq autres avaient des nombres relativement élevés. Ces barres sur ces graphiques montrent les valeurs médianes pour chaque groupe de comptages d’UFC prélevés sur la peau. Les échantillons montrent que la majorité des souris ont des comptes considérables dans la peau humaine, en moyenne 2,1 fois 10 à la quatrième UFC par milligramme de tissu à six heures, et 4,4 fois 10 à la deuxième UFC par milligramme de tissu à 24 heures.

Les échantillons de peau de souris controlatérales n’ont montré aucun nombre de bactéries à 24 heures et seulement un nombre très faible à six heures, démontrant la forte préférence pour la méningite terminale aux vaisseaux humains dans le tissu greffé. En général, le nombre de bactéries était très faible ou non détectable dans l’autre organe échantillonné, bien que deux animaux aient montré des nombres qui peuvent être corrélés à un nombre élevé de bactéries en circulation. Ce modèle peut également être utilisé pour déterminer le rôle des facteurs de virulence in vivo.

Par exemple, dans cette expérience, des souches bactériennes dépourvues de pilule de type quatre fonctionnelle ont été utilisées, des souris infectées par ces souches mutantes n’ont montré aucune adhérence bactérienne dans les greffes de peau humaine, confirmant le rôle crucial que joue la pilule de type quatre I dans l’adhésion in vivo. Sur ces images confocales d’une greffe de peau, deux heures après l’infection, on peut observer des vaisseaux humains colorés à la lectine UEA conjuguée à la romine. Le bord dermique épidermique de la peau est clairement identifiable et la GFP positive infectieuse et la méningite peuvent être clairement observées dans tous les vaisseaux.

Cette greffe de peau humaine colorée h et e présente une inflammation et des fuites vasculaires, ainsi qu’une thrombose concentrée sur les vaisseaux proches du bord dermique de l’épiderme. 24 heures après l’infection Dans environ 30 % des infections, des adhérences bactériennes dans la peau ont conduit au développement d’un purpura détectable par macroscopique. Ainsi, le développement de cette technique ouvre la voie aux chercheurs impliqués dans la recherche et les interactions hôte-pathogène pour étudier les mécanismes de la maladie dans le contexte des vaisseaux humains.