Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

L’objectif global de cette procédure est de marquer les protéines à la surface des neurones vivants et de distinguer par la suite les protéines de surface des protéines internalisées en utilisant le marquage différentiel des anticorps secondaires. Pour ce faire, des neurones primaires cultivés sur du verre de couverture sont incubés avec un anticorps dirigé contre un épitope de surface et incubés pour permettre l’internalisation. Après l’incubation, un anticorps secondaire marqué par fluorescence est appliqué pour identifier les protéines exposées à la surface.

Ensuite, un excès d’anticorps secondaires non marqués est appliqué pour bloquer tous les complexes d’anticorps primaires de protéines de surface restants. Les neurones cultivés sont ensuite perméés et un anticorps secondaire d’une couleur différente est appliqué pour détecter les protéines internalisées. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les niveaux relatifs de protéines internalisées par rapport aux protéines de surface grâce à la microscopie d’immunofluorescence.

À la suite de cette procédure, il est possible d’obtenir une évolution temporelle de l’internalisation des protéines de surface source, ce qui permet d’obtenir des informations sur les taux de trafic de protéines dans des conditions de basilic et de stimulation. Commencez cette procédure en préparant des lamelles de recouvrement pour la culture cellulaire Laver des lamelles de verre bolique de 18 millimètres revêtues de polylysine préparées la veille en les trempant dans trois plats de rinçage séparés contenant du PBS Ajoutez 500 microlitres de solution stratifiée dans les puits d’une plaque de 12 puits, puis à l’aide d’une pince, placez les lamelles de couverture dans chacun. Bien appuyer sur chaque lamelle pour vous assurer qu’elle est à plat dans la base du puits d’incubation pendant deux heures à 37 degrés Celsius, ce protocole peut être effectué à l’aide de cortex de souris E 15 ou d’hippopotame de rat E 18 Campi.

Dans cette démonstration, des cortex de souris sont utilisés. Placez les cortex d’une demi-portée ou d’une portée d’embryons sur de la glace dans un récipient d’un millilitre contenant du PBS avec du calcium et du magnésium et placez-les sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette d’un millilitre, retirez le PBS du tissu cortical.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de la solution d’ADN d’un Pappa au tissu cortical à partir d’une demi-portée d’embryons. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. Deux fois pendant la période d’incubation, retournez doucement le tube pour mélanger le contenu après l’incubation, utilisez une pipette à pâte siliconée polie à la flamme pour réévaluer doucement le tissu 10 à 15 fois jusqu’à ce que la dispersion cellulaire soit obtenue.

Peu de morceaux de tissu non dissocié, voire aucun, devraient rester pour éviter la génération de bulles. Superposez soigneusement la suspension cellulaire dissociée sur un coussin de trois millilitres de 4 % BS, A dans le BSS de Hank avec des additifs. Puis dans une centrifugeuse de paillasse avec une centrifugeuse à rotor pivotant à 100 fois G pendant sept minutes.

Après l’essorage, retirez délicatement le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer la pastille cellulaire. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu neurobasal complet, pipetez doucement de haut en bas pour remettre en suspension les cellules granulées. Ensuite, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration de cellules vivantes.

Seules les cellules à brillance de phase doivent être considérées comme actives immédiatement avant le placage. Aspirez l’excès de solution de sérum laminé des lamelles dans les puits et remplacez-la par un milieu de culture de neurones primaires. Ajoutez ensuite 75 000 à 100 000 neurones primaires à chaque puits.

Cultivez les neurones jusqu’à 21 jours dans un milieu neurobasal à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone le septième jour, et chaque semaine par la suite, ajoutez du fluoro anti-mitotique, de la désoxy-uridine uridine pour prévenir la prolifération gliale et effectuez un demi-changement de milieu. Au cours de la première semaine de culture, les neurones ont développé des arborescences dendritiques, comme le montre cette image d’une culture vieille de deux jours. De la deuxième à la troisième semaine, ils ont mûri et subiront une synaptogenèse.

Cette figure prise à 14 jours in vitro permet de marquer les protéines exposées en surface d’intérêt, d’ajouter l’anticorps primaire directement dans le milieu conditionné à la concentration appropriée. Quatre témoins, du sérum pré-immun ou des anticorps qui reconnaissent les régions intracellulaires de la protéine qui ne sont pas exposées lors de l’exocytose peuvent être utilisés à la même dilution que l’anticorps primaire testé. Remettez les cellules dans l’incubateur de culture pendant une, deux ou quatre heures après l’incubation, aspirez le milieu contenant l’anticorps, lavez les puits une fois doucement mais rapidement avec du PBS.

Ajoutez la température ambiante en ajoutant la solution dans les puits, puis en aspirant. Ajoutez ensuite du para-formaldéhyde 4 % fraîchement préparé et laissez incuber pendant cinq minutes. Ajouter à température ambiante pour fixer les cellules après la fixation.

Retirez la solution de paraformaldéhyde des puits et jetez-la dans un récipient à déchets liquides dans la hotte. Ensuite, rincez rapidement les cellules trois fois avec du PBS comme précédemment. Laissez le troisième lavage en place afin que la lamelle puisse être facilement retirée.

Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement les lamelles de la plaque et placez-les, côté cellule vers le haut, sur une feuille de paramètre à la base ou au couvercle d’une plaque de culture jetable. Le reste du protocole de coloration sera effectué sur cette surface, pipetant doucement une solution bloquant le PBS 5 % BSA sur les cellules pour faire une goutte arrondie en forme de bulle sur la lamelle de recouvrement afin qu’elle ne se dessèche pas. Incuber pendant 30 minutes.

Il est important de ne pas oublier de ne pas ajouter de détergent à la solution de blocage. À ce stade, les cellules ne doivent pas être imprégnées lorsque seules les protéines de surface cellulaire doivent être marquées. Après le blocage, aspirez la solution de blocage, puis pour marquer les protéines exposées à la surface, appliquez un anticorps secondaire marqué par fluorescence, puis incubez pendant deux heures à température ambiante après l’incubation, aspirez l’anticorps secondaire et lavez les lamelles deux fois avec du PBS pendant cinq minutes à chaque fois pour bloquer toute protéine à la surface de la cellule non liée par l’anticorps secondaire marqué.

Incuber les neurones non perméables avec une forte concentration d’anticorps secondaires non marqués pendant la nuit. À température ambiante. L’incubation pendant la nuit est cruciale.

Des périodes d’incubation plus courtes ne bloqueront pas complètement les anticorps primaires qui ne sont pas entièrement liés par l’anticorps secondaire marqué. Le lendemain, lavez les lamelles de couverture deux fois pendant cinq minutes chacune avec du PBS comme précédemment. Ensuite, postfixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans un tampon de phosphate pendant cinq minutes à température ambiante après le retrait du fixateur.

Rincez rapidement les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, pour le marquage intracellulaire, perméez et bloquez les cellules avec du PBS contenant 5 % de BSA et 0,1 % de Triton X 100 à température ambiante pendant 30 minutes. Après la perméation, retirez la solution de blocage.

Veiller à ce que les lamelles ne se dessèchent pas. Ajoutez un anticorps secondaire étiqueté différemment et incubez pendant deux heures à température ambiante. Après avoir retiré le deuxième anticorps secondaire, lavez les lamelles trois fois pendant cinq minutes avec du PBS.

Ensuite, lavez-les brièvement avec un support d’eau déminéralisé. Le couvercle se glisse sur les lames de verre avec un support de montage aqueux contenant un agent anti-décoloration et leur permet de stocker les lames à sec dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pour une préservation optimale du signal fluorescent. Imagez les cellules d’immunocoloration sur un microscope confocal à l’aide des filtres d’excitation et d’émission appropriés.

Utilisez les mêmes paramètres d’acquisition d’imagerie pour toutes les répétitions et conditions après l’imagerie. Utilisez un logiciel d’analyse d’images standard tel que Fiji Image J ou metamorph pour déterminer la densité intégrée des régions d’intérêt standard ou les attributs de Punta, tels que le nombre et la taille, afin de déterminer si le gène six ou six lié à la crise était présent et internalisé à partir de la surface du neurone. Le marquage bicolore des neurones de l’hippocampe d’un rat en culture a été effectué comme décrit dans cette vidéo.

Sur cette image, les protéines de surface cellulaire étiquetées sont indiquées en cyan et les protéines internalisées sont indiquées en vert. La double coloration indiquée par la pointe de flèche n’a été observée que dans une cellule qui semblait malsaine pour déterminer si la protéine internalisée pendant l’incubation de l’alimentation en anticorps localisée dans les endosomes Les neurones exprimant le marqueur endosomique de recyclage précoce transferrine mCherry ont été immuno-colorés après perméation comme montré dans cette région de l’arbre dendritique, il y avait un chevauchement étendu de la coloration ponctuée avec la transferrine confirmant que la protéine internalisée localisée aux endosomes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’un seul anticorps peut être utilisé pour distinguer la surface cellulaire des pools de protéines internalisées.