Name: Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Apprenez à créer des facteurs de transcription artificiels inductibles et à valider leur activation GFP par cytométrie en flux dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet une induction sélective et réversible de l'expression génique.

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RSM reconnaît financement de la NSF Graduate Research Fellowship. MBN reconnaît financement d&#39;un Lewis-Sigler bourse et le don doté de Peter Lewis. DB reconnaît financement du NIH (GM046406) de l&#39;Institut national de sciences médicales général Centre pour la biologie quantitative (GM071508). Nous reconnaissons Christina DeCoste de l&#39;aide pour des expériences de cytométrie de flux.

La figure 2 fournit un schéma de sections de protocole 1-3. Une. Création des carburants de remplacement <ol><li> Créer amorces pour la PCR d&#39;amplification domaine de liaison à l&#39;ADN d&#39;intérêt. Homologie avec le récepteur du promoteur de l&#39;hormone et ACT1 (tel que décrit dans les figures 3 et 4) est ajoutée par PCR afin de faciliter correct recombinaison dans la souche yMN15. </li><li> Amplifier par PCR DBD d&#39;intérêt en utilisant une polymérase haute fidélité. </li><li> Transformation&gt; 1 ug de produit de PCR purifié dans la levure en utilisant la méthode à l&#39;acétate de lithium 13. </li><li> Après transformation, les cellules de spin à la vitesse supérieure pour 15 secondes à centrifuger et éliminer mélange de transformation. </li><li> Remettre en suspension dans ~ 200 ul d&#39;eau stérile et la plaque sur YPD. </li><li> Le lendemain, plaque de réplique de YPD sur des plaques 5-FOA (plaques 5-FOA sont faites comme décrit dans le Manuel de levure Cold Spring Harbor) 13. </li><li> Permettre la croissance de 2-4 days, et restreak au moins 5-10 colonies sur YPD. Effectuer une PCR de colonie en utilisant les amorces dans le tableau 1 et séquence pour vérifier l&#39;insertion. </li></ol> 2. Création d&#39;ATF plasmide Reporter <ol><li> Déterminer le site de liaison de l&#39;ATF (plus susceptibles de provenir de la littérature). </li><li> Ordre souhaite région de liaison comme les oligos (ou Ultramers, si nécessaire). Commandez en haut et en bas des brins avec des surplombs correctes pour Notl et Xbal comme indiqué dans le tableau 2. </li><li> Diluer oligos à des concentrations équimolaires (100 pM). </li><li> Phosphoryler utilisant la T4 polynucléotide kinase et ensuite recuit dans un thermocycleur. Les conditions de réaction sont dans le tableau 3. </li><li> Digest ~ 2.1 ug de pMN8 avec Notl et Xbal-HF pendant 1 heure à 37 ° C (conditions de réaction dans le tableau 4). </li><li> Gel purifier la bande dorsale. </li><li> Diluer l&#39;épine dorsale purifiée à 10 ng / ul. </li><li> Diluer le double brin, phosphoryleATED site de liaison à 5 fois la concentration molaire de squelette par pi. </li><li> En utilisant l&#39;ADN ligase T4, ligaturer les sites de liaison dans le squelette digéré à la température ambiante pendant 30 min (tableau 5). </li><li> Pour la transformation, ajouter la moitié de la réaction de ligature de 50 pi d&#39;étalon, Escherichia coli chimiquement compétentes telles que XL1-Blue ou DH5-alpha. </li><li> cellules de choc de chaleur pour 45 secondes dans un bain d&#39;eau à 42 °, puis placer sur la glace pendant 2 min. </li><li> Ajouter 900 ul de milieu SOC à une réaction de transformation. </li><li> Croître à 37 ° C pendant 1 h sur un rouleau tambour. </li><li> Étaler 100-200 cellules par ul LB + AMP (100 pg / ml) et incuber pendant la nuit. </li><li> Grandir E. coli dans du LB + AMP de l&#39;ADN plasmidique liquide et la récolte. Séquence vérifier nouveau plasmide rapporteur de colonies de ligature en utilisant l&#39;amorce 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Transformer nouveau plasmide rapporteur en contenant ATF-levure strain de la section 1 à l&#39;aide lithium transformation de l&#39;acétate. </li></ol> 3. Quantifier l&#39;effet d&#39;ATF induction sur l&#39;expression du gène GFP Utilisation Reporter Préparation des échantillons: <ol><li> Faire 25 mM de β-estradiol actions (10 ml d&#39;éthanol + 0,0681 g de β-estradiol). Conserver au réfrigérateur. </li><li> Cultiver ATF + Reporter contenant la souche nuit dans 5 ml SC-URA. </li><li> Obtenir neuf 250 ml secouer les flacons et ajouter 25 ml SC-URA à chacun. </li><li> Ajouter 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM ou 10 uM β-estradiol. Ceci est plus facile à faire en faisant des dilutions en série de 10 fois le stock de β-estradiol 25 mM. Pour obtenir une concentration finale de 10 uM de β-estradiol, ajouter 10 ul de la langue β-oestradiol de 25 mM à 25 ml de SC-URA. </li><li> Ajouter 125 ul de cultures de la nuit dans des flacons (1:200 dilution). </li><li> Pour les 2 flacons restants, inoculer avec une GFP production strai constitutiven et une souche dépourvue GFP. Ceux-ci sont nécessaires pour l&#39;étalonnage du cytomètre de flux. </li><li> Agiter à 200 rpm à 30 ° C pendant 12-18 heures. Remarque: Le temps d&#39;incubation optimale est déterminée par l&#39;identification quand GFP induction ne change plus après l&#39;addition de β-estradiol. </li><li> Prenez 500 pi de chaque culture et de spin dans des tubes de 1,7 ml à centrifuger distincts. </li><li> Aspirer SC-URA. </li><li> Laver une fois dans 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 et aspirer. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 et de remettre en suspension. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 dans des tubes Falcon. </li><li> Ajouter les cellules remises en suspension à tubes de 5 ml (volume final = 2 ml) (peut être stockée à 4 ° C pendant plusieurs jours). </li><li> Facultatif: cellules soniquer légèrement à la rupture des cellules agglomérées. La cytométrie en flux analyse: Vue d&#39;ensemble: La fluorescence de 10.000-100.000 cellules est généralement analysé par échantillon. Les données peuvent être traitées soit dans FlowJo ou en utilisant des scripts personnalisés dans MATLAB ouR. Assurez-vous de calibrer la tension de la chaîne de la GFP en utilisant des contrôles positifs et négatifs GFP. Une fois que les fichiers sont exportés FCS, un script tel que celui de la figure 6 avec les fca_readfcs de fonction ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> ) peut être utilisé pour traiter l&#39; données. </li><li> Effectuer la cytométrie de flux. <ol><li> Utilisez de diffusion vers l&#39;avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) pour identifier les cellules de levure. </li><li> Réglez le débit de ~ 3000 cellules / sec. </li><li> Mesurer la GFP (canal FITC). </li><li> Une fois les données sont collectées, à l&#39;exportation. FCS fichiers </li></ol></li><li> Chargez MATLAB. </li><li> Déplacez les fichiers. FCS, fcs_readfcs.m, et un script similaire à celle de la figure 6 dans le même dossier. </li><li> Changer le répertoire de travail actuel pour le dossier contenant les données et les scripts. </li><li> Exécutez le script de la figure 6 (note: l&#39;la légende a été saisi manuellement pour produire ce qui est vu sur la figure 7). </li></ol> 4. Quantifier l&#39;effet d&#39;ATF induction sur la croissance cellulaire <ol><li> De stocks congelés, série à la fois (1) une souche contenant ATF et (2) une souche de ATF-manque (comme yMN15) sur des plaques YPD distincts. </li><li> Après 2 jours de croissance, ensemencer des tubes de culture séparés contenant 5 ml de liquide YPD avec chaque souche et faire croître pendant une nuit à 30 ° C. </li><li> Effectuer 10 dilutions en série d&#39;un mM β-estradiol solution 0,25 boursier jusqu&#39;à 10.000 fois (0,025 uM β-estradiol) dans 100% d&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 40 ul de cultures d&#39;une nuit de 10 ml de liquide YPD (1 à 250 de dilution). </li><li> Pour chaque souche, ajouter 96 pi de cellules diluées à 18 puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Ajouter 4 ul de β-oestradiol sur les cellules. Un point essentiel est de s&#39;assurer que chaque bien a la même quantité d&#39;éthanol totale. (Sinon, un mo<html> re mère concentrée de β-oestradiol peut être utilisé et ensuite dilué au point l&#39;effet de l&#39;éthanol sur la croissance n&#39;est pas mesurable). </li><li> Effectuer en trois exemplaires. Trois des puits pour chaque souche devrait être de l&#39;éthanol-seuls contrôles. </li><li> Couvrir la plaque à 96 puits à membrane perméable aux gaz. </li><li> Surveillance de la croissance (DO 600) dans le lecteur de plaque. </li><li> Quantifier les taux de croissance en utilisant un certain nombre de méthodes standard telles que trouver la pente maximale. Remarque: Nous avons eu un bon succès avec le open source logiciel Grofit 14, qui s&#39;exécute dans l&#39;environnement de programmation R Il est à noter que, bien que les taux de croissance calculés à partir des essais de plaques à 96 puits par rapport à secouer des flacons (25 ml de cultures). ne sont pas nécessairement les mêmes (en raison à la fois des différences dans la physiologie et de l&#39;instrumentation), nous avons observé que les taux de croissance relatifs sont similaires (bien que ce ne soit pas toujours le cas). </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. Créer inductibles génomiques allèles <ol><li> Obtenir pMN10, un plasmide avec le promoteur noncentromeric d&#39;ATF-sensible de pMN8 fusionné à KanMX (dans l&#39;orientation opposée). </li><li> Restriction digérer le squelette du vecteur et l&#39;extrait de gel comme dans la section 2. </li><li> Recuit, phosphorylation, et oligos de ligaturer contenant des sites de liaison appropriés, comme décrit dans la section 2. </li><li> Séquence vérifier. Ce plasmide va maintenant servir de matrice d&#39;ADN pour créer l&#39;allèle inductible. </li><li> Obtenir la souche de levure exprimant l&#39;ATF correspondant d&#39;intérêt. </li><li> Amplifier par PCR la cassette KanMX-promoteur (~ 2 kb) en utilisant des amorces dans le tableau 6. </li><li> Transformer le produit de PCR dans la souche d&#39;ATF-exprimant l&#39;aide de la méthode à l&#39;acétate de lithium. </li><li> Plaque sur YPD et la plaque de réplique sur YPD + G418 le lendemain. </li><li> Confirmez insertion appropriée du promoteur en utilisant l&#39;amorce sens (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) et une amorce inverse interne à ee gène dont le promoteur a été remplacé. L&#39;amorce inverse est généralement conçu pour être comprise entre 200 à 300 pb en aval du premier ATG 15. Le produit final de la PCR est de ~ 1,2 kb. </li></ol>

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</ol>

McIsaac, Noyes, et Botstein (avec d&#39;autres) ont présenté une partie de ce système comme une description du brevet.

Les commutateurs à base d&#39;hormones décrits ici ont des applications multiples, à partir de l&#39;étude de la biologie de la cellule native à tester la capacité d&#39;un domaine de liaison d&#39;ADN d&#39;intérêt à une cible, une séquence d&#39;ADN in vivo. Le système a beaucoup de caractéristiques souhaitables, y compris une réponse graduée à inducteur, action rapide, et une réglementation stricte (c&#39;est à dire. Pas perméabilité mesurables, voir figure 7). Cependant, il ya encore place à l&#39;amélioration et à l&#39;expansion. Les travaux récents de la biologie synthétique a souligné systèmes synthétiques de multiplexage et d&#39;élargir le répertoire de bien caractérisés, parties d&#39;ADN programmables 16. Indépendante, expression conditionnelle de gènes cibles distincts nécessite deux inducteurs multiples et les domaines de liaison d&#39;ADN qui sont dépourvus de spécificité se chevauchent. La disponibilité des récepteurs d&#39;ingénierie ainsi naturellement fournit un large éventail de parties avec lesquelles pour développer de nouveaux facteurs de transcription artificiel. Élargissement de larépertoire de commutateurs orthogonales a été grandement facilité par l&#39;évolution dirigée approches 17,18. Les efforts actuels pour reprogrammer la spécificité de liaison de ligand de nos facteurs de transcription artificiels seront présentés à l&#39;avenir. Auparavant, les conséquences phénotypiques de délétion du gène / surexpression ont été largement étudiés dans la levure 19,20. Cependant, il n&#39;a pas été facile à étudier l&#39;effet de l&#39;expression de phénotypes différents dans une gamme de niveaux d&#39;expression. Une caractéristique principale du système présenté ici est sa nature graduelle (figure 8). Bien que souvent supposé, la relation entre l&#39;expression des gènes et les phénotypes d&#39;intérêt n&#39;est pas nécessairement monotone. Facteurs de transcription artificiels tels que Z 3 et Z 4 EV EV rendra la tâche de dosage des réponses phénotypiques à des changements dans l&#39;expression des gènes simple. Enfin, les protocoles de discutered dans ce manuscrit sont pour l&#39;ingénierie et la caractérisation des facteurs de transcription artificiels qui répondent aux β-œstradiol, mais une alternative importante à des domaines chimiquement réactifs est l&#39;utilisation de domaines sensibles à la lumière (comme le PhyB/Pif3, LOV, et BLUF), dont les activités sont réversibles sans avoir à perturber le milieu de croissance de culture 21-23. Des systèmes basés sur la lumière de faciliter le contrôle spatio-temporel de l&#39;expression génique, les interactions protéine-protéine, le transport d&#39;ions, et l&#39;activité enzymatique, qui ont déjà prouvé puissant 21-26. En conclusion, nous avons présenté des procédés pour la construction rapide de inductibles, des facteurs de transcription artificiels dans la levure. Ce protocole fournit un modèle pour leur construction en liaison avec les reporters GFP apparentées, ainsi que des méthodes d&#39;analyse des données de rapporteur utilisant la cytométrie en flux et le dosage de l&#39;effet de l&#39;activation de l&#39;ATF sur la croissance.

Développer commutateurs génétiques dans la levure est d&#39;un grand intérêt dans la recherche académique et industrielle. Dans le cas idéal, les commutateurs génétiques peuvent être utilisés pour activer un gène particulier (ou un ensemble de gènes) que lorsque souhaitée par l&#39;expérimentateur. La séquence codante d&#39;un gène placé en aval d&#39;un promoteur synthétique n&#39;est pas exprimé en l&#39;absence d&#39;une molécule induisant: lors de l&#39;addition de l&#39;inducteur le gène doit être exprimé rapidement. Il a récemment été démontré qu&#39;un tel interrupteur peut être conçu dans une levure, où, en l&#39;absence d&#39;inducteur, la souche présente un phénotype de suppression, mais en présence d&#39;un inducteur, d&#39;expression est activé en fonction du niveau de l&#39;inducteur dans toutes les cellules 1,2. Historiquement, les systèmes d&#39;expression conditionnelles dans la levure se sont fortement appuyés sur des séquences d&#39;ADN nutriments sensibles, y compris le MET, PHO, et les promoteurs de GAL (dont les activités sont sensibles aux niveaux extracellulaires de la méthionine, phosphate, etgalactose, respectivement). Bien que l&#39;expression conditionnelle peut être atteint, il se fait au prix d&#39;effets pléiotropiques importantes. Les récepteurs hormonaux, tels que les récepteurs d&#39;œstrogènes humains se sont révélés être efficaces chez les eucaryotes commutateurs 3,4. En l&#39;absence d&#39;hormone, une protéine fusionnée à un récepteur hormonal peut être séquestré dans le cytoplasme, où elle interagit avec le complexe chaperone Hsp90. Lors de la liaison du ligand approprié, le récepteur subit un changement de conformation, l&#39;amenant à être libéré du complexe chaperone Hsp90 et de révéler un signal de localisation nucléaire. Pour observer la dynamique de la localisation d&#39;une protéine contenant un récepteur d&#39;hormone particulier, nous avons créé une fusion C-terminale de Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, un facteur de transcription synthétique contenant le domaine de liaison Gal4p ADN, le domaine de liaison du ligand du récepteur oestrogène humain et VP16) avec deux GFP. Localisation nucléaire a été observée dans 8 min après l&#39;addition desaturant les montants de l&#39;inducteur, ß-estradiol, à laquelle levure de type sauvage est complètement inerte. A cette époque, la majorité des cellules ont des sites de transcription actifs clairement visibles de gènes cibles de GEV (testés par hybridation fluorescente in situ), ainsi que les ARNm pleine maturité 2,5. gènes cibles GEV augmenté en expression&gt; 2 fois 2,6 à 2,5 min (mesuré au moyen de puces), ce qui montre qu&#39;il faut &lt;2,5 min pour l&#39;activateur chimérique à une translocation vers le noyau, lier l&#39;ADN, et activer la transcription. Bien que plusieurs autres sur les commutateurs ont été appliquées dans la levure qui utilisent diverses petites molécules ou médicaments (y compris les commutateurs à base de doxycycline classiques de Escherichia coli 7,8 et un commutateur à base d&#39;indigo-9 d&#39;Arabidopsis thaliana), aucun n&#39;a atteint la vitesse, spécificité, ou de l&#39;oppression de la réglementation présentée par les commutateurs à base d&#39;hormones. Il est à noter tchapeau rapide hors-commutateurs ont également été développés dans la levure, et travaillent généralement par fusion d&#39;un gène à une protéase ou ubiquitine ligase séquence de ciblage 2,10,11,12. La capacité à éliminer rapidement une protéine cible à partir de la cellule facilite l&#39;étude des gènes essentiels ainsi que les gènes qui sont sujettes à la suppression génétique lorsque supprimé 10. Les méthodes décrites dans ce protocole sont pour la construction et la caractérisation de synthèse sur les commutateurs dans la levure. Tout d&#39;abord, nous montrons comment générer rapidement des protéines de fusion génomiquement intégrés constitués d&#39;un domaine de liaison à l&#39;ADN d&#39;intérêt, domaine du récepteur oestrogène humain de liaison du ligand, et VP16 (DBD-VE). Suite à notre protocole, la protéine de fusion est exprimée à partir d&#39;un promoteur d&#39;ACT1. Nous montrons ensuite comment créer un plasmide rapporteur apparenté pour l&#39;ATF et de tester ses fonctionnalités en utilisant la cytométrie de flux. Bien que nous envisageons ces plasmides rapporteurs utilisés avec de nouveaux carburants de remplacement (Figure 1), ils peuvent be utilisé comme journalistes pour un activateur de la transcription natif ainsi. Enfin, les détails de tester l&#39;effet de l&#39;activation de l&#39;ATF sur la croissance des cellules dans des plaques à 96 puits et de l&#39;ingénierie génomique allèles inductibles sont fournis.

<table><tbody><tr><td>Nom de l’entreprise du réactif</td><td></td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires&nbsp ;</td></tr><tr><td>Expand Système de PCR haute fidélité</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Compétent E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>ADN du spermatozoïde de saumon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Plasmides pMN8 et pMN10 ; souche de levure yMN15</td><td>Noyes ou Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>ÉQUIPEMENT :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyomètre de débit LSRII&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>Divers modèles</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB ou FlowJo</td><td>MATLAB ou FlowJo</td><td></td><td>Logiciel d’analyse. Fichiers FCS issus d’expériences de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>R</td><td>Open Source</td><td></td><td>Pour l’analyse des données de taux de croissance du lecteur de plaques.</td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Eppendorf&nbsp ; Tubes</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Shake Flasks</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96 puits, à fond plat Lecteur de</td> plaques <td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>(Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy Membranes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>diverses entreprises</td><td>Différents modèles</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura poudre</td><td>MP Biomedicals</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec reporters base gfp

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

La biologie synthétique vise à concevoir de façon rationnelle et construire des circuits synthétiques avec des propriétés quantitatives souhaitées, ainsi que de fournir des outils pour interroger la structure des circuits de commande d&#39;origine. Dans les deux cas, la possibilité de programmer l&#39;expression génique d&#39;une façon rapide et réglable, sans effets hors-cible, peut être utile. Nous avons construit des souches de levure contenant le promoteur ACT1 en amont d&#39;une cassette URA3 suivi par le domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène humain et VP16. Par transformation de cette souche avec un produit de PCR linéaire contenant un domaine de liaison à l&#39;ADN et la sélection contre la présence de URA3, un facteur de transcription exprimé de manière constitutive artificiel (ATF) peut être généré par recombinaison homologue. ATF modifiées de cette façon peuvent activer un gène cible unique en présence d&#39;un inducteur, ce qui élimine à la fois l&#39;activation hors cible et des conditions de croissance non physiologiques trouvés chez les conditi couramment utiliséonal des systèmes d&#39;expression de gènes. Un procédé simple pour la construction rapide de plasmides rapporteurs GFP qui répondent spécifiquement à un facteur de transcription natif ou artificiel d&#39;intérêt est également fourni.

<html> La figure 5 montre l&#39;induction de la GFP par Z 3 EV, Z 4 EV, ou GEV au fil du temps. Notez l&#39;augmentation de la production de GFP en réponse aux carburants de remplacement contenant des domaines de liaison à l&#39;ADN nonyeast. Récemment, nous avons émis l&#39;hypothèse que cela résulte de ces facteurs ayant atteint spécificité seul gène dans le génome de la levure 1. GEV induction seul conduit à l&#39;activation / la répression de centaines de gènes, tandis que Z 3 et Z 4 EV EV seulement activer l&#39;expression d&#39;un gène cible placée en aval d&#39;un promoteur synthétique contenant des sites de liaison appropriés (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;et 5&#39;- GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, respectivement) 1. Figure 7 montre la réglementation stricte du système (pas de résultats inducteurs en aucun GFP détectable) et que toutes les cellules se induits en réponse à inducteur La capacité de Z 3 EV pour induire GFP à travers une gamme de concentrations β-oestradiol est représenté sur la figure 8. <html> ent &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Figure 1. Facteurs de transcription artificiels interagissent avec la protéine Hsp90, en l&#39;absence de β-oestradiol. Lorsque β-estradiol se lie à l&#39;ATF, Hsp90 se dissocie, ce qui permet l&#39;ATF pour entrer dans le noyau et activent l&#39;expression à partir du plasmide rapporteur. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de protocole pour les souches d&#39;ingénierie qui contiennent des facteurs de transcription artificiels et le renforcement / tester journalistes GFP apparentées. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. L&#39;séquence ACT1pr-URA3-EV dans la souche yMN15 au niveau du locus LEU2. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Figure 4. Conception des amorces de PCR pour l&#39;amplification d&#39;un domaine de liaison à l&#39;ADN d&#39;intérêt avec une homologie de séquence supplémentaire pour générer une nouvelle protéine de fusion lorsqu&#39;il est transformé avec succès dans yMN15. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figure 5. GFP induction par trois paires différentes ATF-promoteur en réponse à 1 uM β-estradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figure 6. Un script MATLAB pour l&#39;écoulement de traitement données de cytométrie. Ce script a été adapté à partir de <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figure 7. Induction de la GFP par Z 3 EV en réponse à 0 μ M β-estradiol et 1 uM β-estradiol suivant 18 heures d&#39;induction. Fluorescence a également été meaassurée de cellules dépourvues de GFP pour illustrer la réglementation stricte du système EV Z 3. Cette figure a été produite en utilisant le code de la figure 6. <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figure 8. La relation entre la concentration d&#39;inducteur et la sortie de l&#39;expression est évaluée avec un coefficient de Hill de ~ 1. (A) les distributions de l&#39;expression de GFP en fonction de la concentration en β-estradiol. (B) La fluorescence moyenne des distributions de (A). Les données ont été ajustées à la fonction G (D) = G min + (U max-U min) D n / (K n + D n) où D est la dose de β-estradiol, G min et G max sont les minimum et valeurs de GFP maximum, respectivement, n est le coefficient de Hill, et K est la dose de β-estradiol qui donne ½ (G + G max min). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Oligonucléotide de séquence </td><td> Nom </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Vérifier avant </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD vérification des </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Amorces pour confirmer la fusion correcte du DBD de l&#39;intérêt pour le récepteur oestrogène. L&#39;amorce sens est homologue du promoteur de ACT1 et l&#39;amorce inverse est homologue au récepteur de l&#39;œstrogène. Pour DBD typiques (~ 300 pb), le produit de PCR est &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Oligonucléotide de séquence </td><td> Nom </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD site boulimie ... t-3 &#39; </td><td> Top oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... site de liaison de l&#39;ADN inverse ... gc-3 &#39; </td><td> Oligo bas </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x Zif268 sites de liaison </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Oligo bas + 6x Zif268 sites de liaison </td></tr></tbody></table> Tableau 2. S tructure d&#39;amorces pour la création d&#39;ADN double brin contenant des sites de liaison d&#39;intérêt. Pour créer le Z 3 EV promoteur sensible, les oligonucléotides Top oligo + 6x Zif268 sites de liaison et d&#39;oligo Bas + 6x Zif268 liaison ont été utilisés.Séquences pour créer des surplombs d&#39;ADN correctes sont en minuscules. Le site de liaison de consensus Zif268, GCGTGGGCG, est soulignée dans l&#39;oligo haut. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> T4 Polynucleotide Kinase tampon </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> T4 Polynucléotide Kinase (@ 10 000 unités / ml) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Top oligo (100 M) </td><td> 1,5 pl </td></tr><tr><td> Oligo Bas (100 M) </td><td> 1,5 pl </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 41 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Phosphorylent et des amorces de recuit dans un thermocycleur en utilisant 50 pi de la réaction décrite ci-dessus. S&#39;effectue en deux étapes de thermocycleur. Etape 1: 37 ° C 30 min (phosphoryler), et étape 2: 95 ° C 30 sec (démissionner de 1 ° C toutes les 30 secondes jusqu&#39;à ce que à 4 ° C; recuit). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Montant </td></tr><tr><td> XbaI </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Notl-HF </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> L&#39;ADN plasmidique </td><td> 5 pi (1-2 pg) </td></tr><tr><td> 10x Smart Cut tampon </td><td> 5 pl </td></tr><tr><td> Eau </td><td> 38 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Digestion de restriction du plasmide pMN8 avec Xbal et Notl. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Réactif </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Montant </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 ligase Buffer </td><td> 2 pl </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 Ligase </td><td> 0,2 pl </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / pl </td><td> 1 pl </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Les séquences de liaison @ 5x concentration molaire / pl </td><td> 1 pl </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Eau </td><td> 15,8 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 5. Ligaturer les sites de liaison à l&#39;ADN plasmidique. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Apprêt </td><td> Description </td></tr><tr><td> ~ 40 pb en amont de l&#39;ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Amorce sens pour amplifier KanMX-promoteur </td></tr><tr><td> 5&#39;-inverse complément (ATG + ~ 37 pb) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Inverser primer pour amplifier KanMX-promoteur </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Amorce sens pour faire promoteur de GCN4 swap. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Amorce inverse pour faire promoteur de GCN4 swap. </td></tr></tbody></table> Tableau 6. Amplifier par PCR KanMX-promoteur pour faire allèle titratible.

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour la construction rapide des facteurs de transcription artificiels (atfs) avec les journalistes de la GFP apparentées et la quantification de la capacité des carburants de remplacement à stimuler l&#39;expression de la GFP par cytométrie de flux.

Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

L'objectif général de cette procédure est de créer, tester et valider des facteurs de transcription artificiels inducibles, ou ATF, codés génétiquement et dotés d'une spécificité souhaitée. Cette étape est réalisée en premier lieu en créant l'ATF par une simple transformation levure au cours de laquelle l'inclusion d'un produit PCR d'un domaine de liaison à l'ADN conduit à une fusion en phase avec un récepteur d'œstrogène humain et VP16. La deuxième étape de la procédure consiste à créer un plasmide rapporteur GFP pour l'ATF en remplaçant les sites de liaison du plasmide PMN8 par des séquences cibles du facteur de transcription.La troisième étape de la procédure consiste à tester la capacité des ATF à activer le rapporteur GFP et à évaluer leur effet sur la physiologie de la levure en mesurant la vitesse de croissance. La dernière étape de la procédure consiste à utiliser un facteur de transcription validé pour exprimer de façon conditionnelle une cible génomique native. En définitive, tout gène cible d'intérêt peut être rendu conditionnellement actif.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'induction médiée par le galactose de l'expression génique, est que l'induction sélective peut être obtenue dans diverses conditions nutritionnelles et physiologiques sans effets pléiotropes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des levures grâce à l'introduction rapide et réversible de produits géniques souhaités, permettant l'étude des effets de gain comme de perte de fonction. Pour commencer, amplifier par PCR le domaine de liaison à l'ADN ou DVD d'intérêt en utilisant une polymérase de haute fidélité.Transformer plus d'un microgramme du produit PCR purifié dans des cellules de levure en utilisant la méthode de l'acétate de lithium. Après la transformation, centrifuger les cellules à vitesse maximale pendant 15 secondes dans une microcentrifugeuse, éliminer le mélange de transformation et resuspendre les cellules dans environ 200 microlitres d'eau stérile avant de les ensemencer sur du milieu extrait de levure, peptone, dextrose ou milieu YPD. Le jour suivant, réaliser une repiquage de YPD sur cinq plaques contenant de l'acide 5-fluororacétique.Après une croissance de deux à quatre jours, repiquer au moins cinq à 10 colonies sur YPD. Ensuite, réaliser une PCR sur colonies en utilisant les amorces décrites dans le protocole et séquencer pour vérifier l'insertion. Diluer les oligonucléotides de la région de liaison souhaitée à des concentrations équimolaires.Phosphorylez la région de liaison à l'aide de la polynucléotide kinase T4, puis utilisez un thermocycleur néo selon les conditions de réaction décrites dans le protocole. Ensuite, digérez environ un à deux microgrammes de PMN8 avec NotI-HF et XbaI pendant une heure à 37 degrés Celsius sur gel.Purifiez la bande du squelette et diluez le squelette purifié à 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, diluez le site de liaison phosphorylé double brin à cinq fois la concentration molaire du squelette par microlitre. À l’aide de la ligase T4 ADN, liguez les sites de liaison dans le squelette digéré à température ambiante pendant 30 minutes.Réaliser la transformation en ajoutant la moitié de la réaction de ligation à 50 microlitres de cellules EIA coli chimiquement compétentes standard, puis suivre la procédure indiquée dans le protocole écrit. Après récupération des cellules, ajouter de 100 à 200 microlitres de cellules par plaque luria berti ou plaque lb plus ampicilline, et incuber toute la nuit. Le jour suivant, cultiver les e coli dans un milieu liquide lb plus ampicilline, puis extraire l'ADN plasmidique selon la méthode décrite dans le protocole écrit.Ensuite, séquencer et vérifier le nouveau plasmide rapporteur à partir des colonies de ligation. Enfin, transformer le nouveau plasmide rapporteur dans la souche E contenant le facteur de transcription (A TF) en utilisant la transformation par acétate de lithium. Pour commencer, faire croître une souche contenant le facteur de transcription et le rapporteur pendant la nuit dans cinq millilitres de milieu synthétique complet dépourvu d'uracile.Se procurer 9 flacons de 250 millilitres et ajouter 25 millilitres de SC privé d'URA à chacun. Préparer ensuite sept de ces flacons avec différentes dilutions de bêta-estradiol, comme indiqué dans le protocole textuel, à partir d'une dilution sérielle au dixième d'une solution mère de bêta-estradiol à 25 millimolaire, en ajoutant 125 microlitres des cultures de nuit à ces sept flacons ; pour les deux flacons restants, réaliser l'inoculation avec une souche produisant de la GFP de façon constitutive et une souche dépourvue de GFP. Ces dernières sont nécessaires pour l'étalonnage du cytomètre en flux.Agiter le flacon à 200 tr/min et à 30 degr&eacute;s Celsius pendant 12 &agrave; 18 heures. Ensuite, pr&eacute;lever 500 microlitres de chaque culture et centrifuger dans des tubes Eppendorf de 1,7 millilitre s&eacute;par&eacute;s. Apr&egrave;s avoir aspir&eacute; le surnageant, laver les cellules pellet&eacute;es une fois avec du tampon de cytom&eacute;trie en flux, puis resuspendre les cellules dans un millilitre du m&ecirc;me tampon.Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de cytométrie en flux à neuf falcons deux. Ajoutez les cellules resuspendues aux tubes falcon contenant le tampon, pour un volume final égal à deux millilitres. Enfin, effectuez la cytométrie en flux.Utilisez la diffusion directe et la diffusion latérale pour identifier les cellules de levure. Réglez le débit d'écoulement à environ 3000 cellules par seconde. Mesurez la GFP à l’aide du canal 50 et procédez comme indiqué dans le protocole écrit : à partir de stocks congelés, étaler à la fois une souche contenant un A TF et une souche dépourvue d’A TF sur du YPD. Après deux jours de croissance, ensemencez séparément des tubes de culture contenant cinq millilitres de milieu liquide YPD et faites croître chaque souche durant la nuit à 30 degrés Celsius.Effectuez des dilutions sérielles dix fois d'une solution mère de bêta-estradiol à 0,25 millimolaire jusqu'à 10 000 fois, dans de l'éthanol à 100 %. Ajoutez 40 microlitres de chaque culture ensemencée la nuit précédente à 10 millilitres de milieu liquide YPD. Pour chaque souche, ajoutez 96 microlitres des cellules diluées dans 18 puits d'une plaque de 96 puits.Ensuite, ajoutez quatre microlitres de bêta-estradiol aux cellules. Un point essentiel est de s'assurer que chaque puits contient la même quantité totale d'éthanol. Effectuez un tripliqué avec trois puits pour chaque souche, contenant uniquement de l'éthanol.Les témoins recouvrent la plaque de 96 puits d'une membrane perméable aux gaz. Surveillez la croissance à une densité optique de 600 nanomètres à l'aide d'un lecteur de plaques. Quantifiez les taux de croissance à l'aide de diverses méthodes, telles que la détermination de la pente maximale.Après avoir préparé le plasmide selon les instructions du protocole textuel de PCR, amplifier le cassette promoteur can MX. Transformer le produit de PCR dans une souche exprimant A TF en utilisant la méthode au chlorure de lithium, ensemencer les cellules transformées sur YPD et réaliser une plaque de réplica sur YPD additionné de l'antibiotique G quatre 18 le lendemain. Enfin, confirmer l'insertion correcte du promoteur à l'aide d'une amorce directe et d'une amorce inverse interne au gène dont le promoteur a été remplacé.Le produit final de PCR est d’environ 1,2 KB. On observe ici l’induction de la GFP par trois paires différentes de promoteurs de TF : Z quatre EVZ, trois EV ou GEV, au cours du temps en réponse à une concentration d’un micromolaire de bêta-estradiol. Remarquez l’augmentation de la production de GFP en réponse aux ATF contenant des domaines de liaison à l’ADN non issus de levure. Ceci pourrait résulter du fait que ces facteurs atteignent une spécificité monocellulaire dans le génome de la levure.L'induction par le GEV seule entraîne l'activation ou la répression de centaines de gènes, tandis que Z trois EV et Z quatre EV n'activent l'expression que d'un gène cible placé en aval d'un promoteur synthétique contenant des sites de fixation appropriés. Ici, l'induction de la GFP par Z trois EV en réponse à zéro nanomolaire de bêta-estradiol, et à un micromolaire de bêta-estradiol après 18 heures d'induction est illustrée. La fluorescence a également été mesurée à partir de cellules dépourvues de GFP afin de montrer la régulation stricte du système Z trois EV. La capacité de Z trois EV à induire la GFP sur une gamme de concentrations de bêta-estradiol est présentée ici.La fluorescence moyenne des distributions révèle que la relation entre la concentration de l'inducteur et le niveau d'expression est progressive, avec un coefficient de Hill d'environ un, indiquant une liaison indépendante de Z trois EV. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les puces à ADN pour l'expression génique pourraient être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont la modification de l'expression d'un seul gène affecte les profils génomiques d'expression génique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, tester et valider l'efficacité de facteurs de transcription artificiels. Ces facteurs de transcription artificiels contrôlent de façon conditionnelle l'expression des gènes placés en aval de séquences cibles d'ADN appropriées.

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