Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

L’objectif global de cette procédure est de créer, tester et valider des facteurs de transcription artificiels ou ATF génétiquement codés et inductibles avec la spécificité souhaitée. Ceci est accompli en créant d’abord le A TF via une simple transformation de levure dans laquelle l’inclusion du produit PCR du domaine de liaison à l’ADN A entraîne une fusion dans le cadre avec un récepteur d’œstrogène humain et VP 16. La deuxième étape de la procédure consiste à créer un plasmide rapporteur GFP pour le TF A en remplaçant les sites de liaison dans le plasmide PMN huit par des séquences ciblant le TF.

La troisième étape de la procédure consiste à tester la capacité des ATF à activer le rapporteur GFP et à évaluer son effet sur la physiologie de la levure en mesurant le taux de croissance. La dernière étape de la procédure consiste à utiliser un TF validé pour exprimer conditionnellement une cible génomique native. En fin de compte, tout gène cible d’intérêt peut être rendu actif conditionnellement.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’induction de l’expression génique médiée par le galactose est que l’induction sélective peut être réalisée dans diverses conditions nutritionnelles et physiologiques sans effets pléotropiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la biologie de la levure grâce à l’introduction rapide et réversible des produits géniques souhaités, permettant d’étudier à la fois le gain et la perte de fonction. Pour commencer, la PCR amplifie le domaine de liaison à l’ADN ou DVD d’intérêt à l’aide d’une polymérase haute fidélité.

Transformer plus d’un microgramme du produit PCR purifié en levure à l’aide de la méthode de l’acétate de lithium. Après la transformation, faites tourner les cellules à vitesse maximale pendant 15 secondes dans une micro-centrifugeuse, retirez le mélange de transformation et remettez les cellules en suspension dans environ 200 microlitres d’eau stérile avant de les enrober sur de l’extrait de levure. Le lendemain, le pepto-dextrose ou le ypd moyen la réplique de la plaque de ypd sur cinq plaques d’acide fluoro-érotique.

Après une croissance de deux à quatre jours, reconstituer au moins cinq à 10 colonies sur YPD. Effectuez ensuite une PCR de colonie à l’aide des amorces du protocole de texte et de la séquence pour vérifier l’inclusion. Diluer les oligonucléotides de la région de liaison souhaitées à des concentrations équimolaires.

Phosphoryler la région de liaison à l’aide de la polynucléotide kinase T quatre, puis d’un néo thermocycleur selon les conditions de réaction du protocole de texte. Ensuite, digérez environ un à deux microgrammes de PMN huit sans un HF et xb. Un pour une heure à 37 degrés Celsius gel.

Purifiez la bande vertébrale et diluez la colonne vertébrale purifiée à 10 nanogrammes par microlitre. Diluez ensuite le site de liaison phosphorylé double brin à cinq fois la concentration molaire du squelette par microlitre. À l’aide de T quatre, l’ADN ligase ligature les sites de liaison dans le squelette digéré à température ambiante pendant 30 minutes.

Effectuez la transformation en ajoutant la moitié de la réaction de ligature à 50 microlitres de cellules EIA coli standard chimiquement compétentes, et en suivant la procédure indiquée dans le protocole de texte. Après avoir récupéré les cellules, ajoutez 100 à 200 microlitres de cellules par luria berti ou lb plus une plaque d’ampicilline, incubez pendant la nuit. Le lendemain, faites pousser e coli et lb plus ampicilline liquide et récoltez l’ADN plasmidique comme décrit dans le protocole de texte.

Ensuite, vérifiez séquentiellement le nouveau plasmide rapporteur des colonies de ligature. Enfin, transformer le nouveau plasmide rapporteur en souche A TF contenant E en utilisant la transformation de l’acétate de lithium. Pour commencer, cultivez un TF plus reporter contenant de la souche pendant la nuit dans cinq millilitres de milieu synthétique complet sans uracile.

Obtenez 9 250 millilitres, agitez la fiole et ajoutez 25 millilitres de SC moins URA à chacune. Préparez ensuite sept des fioles avec une dilution différente de bêta-œstradiol comme indiqué dans le protocole de texte, de la dilution en série de dix fois d’un stock de bêta-œstradiol de 25 millimolaires à 125 microlitres des cultures de nuit à ces sept flacons pour les deux flacons restants inoculés avec une souche constitutive productrice de GFP et une souche dépourvue de GFP. Ceux-ci sont nécessaires pour calibrer le cytomètre en flux.

Agitez le ballon à 200 tr/min et 30 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures. Ensuite, retirez 500 microlitres de chaque culture et tournez dans des tubes einor séparés de 1,7 millilitre. Après avoir aspiré le surnageant, rincez une fois les cellules granulées avec un tampon de cytométrie en flux, puis remettez les cellules en suspension dans un millilitre du même tampon.

Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de cytométrie en flux à neuf faucons deux. Ajoutez les cellules remises en suspension dans le tampon contenant des tubes de faucon pour un volume final égal à deux millilitres. Enfin, effectuez une cytométrie en flux.

Utilisez la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale pour identifier les cellules de levure. Réglez le débit sur environ 3000 cellules par seconde. Mesurez la GFP à travers le canal 50 et procédez comme dans le protocole de texte à partir des stocks congelés qui sortent à la fois une souche contenant un TF A et une souche sans souche A TF sur YPD Après deux jours de croissance, inoculez des tubes de culture séparés contenant cinq millilitres de liquide YPD et cultivez chaque souche pendant la nuit à 30 degrés Celsius.

Effectuez des dilutions en série de dix fois d’une solution mère de bêta-œstradiol de 0,25 millimolaire jusqu’à 10 000, pliez dans de l’éthanol à 100 %. Ajouter 40 microlitres de chaque culture de nuit à 10 millilitres de liquide YPD. Pour chaque souche, ajoutez 96 microlitres de cellules diluées dans 18 puits d’une plaque à 96 puits.

Ajoutez ensuite quatre microlitres de bêta-œstradiol aux cellules. Un point essentiel est de s’assurer que chaque puits a la même quantité d’éthanol total. Effectuez un triplet avec trois des puits pour chaque souche étant de l’éthanol uniquement.

Les commandes recouvrent la plaque de 96 puits d’une membrane perméable aux gaz. Surveiller la croissance à une densité optique de 600 nanomètres dans un lecteur de plaques. Quantifiez les taux de croissance à l’aide d’un certain nombre de méthodes, telles que la recherche de la pente maximale.

Après avoir préparé le plasmide comme indiqué dans le protocole de protocole texte PCR, amplifiez la cassette promotrice de la boîte MX. Transformez le produit de PCR en une souche exprimant A TF à l’aide de la plaque de méthode de l’acétate de lithium, transformez les cellules en YPD et répliquez la plaque en YPD plus l’antibiotique G 4 18 le lendemain. Enfin, confirmez l’insertion appropriée du promoteur à l’aide de l’amorce directe et d’une amorce inverse interne au gène dont le promoteur a été remplacé.

Le produit final de la PCR est d’environ 1,2 Ko : l’induction de la GFP par trois paires différentes de promoteurs de TF, Z quatre, EVZ, trois EV, ou GEV au fil du temps en réponse à un bêta-estradiol micromolaire. Notez l’augmentation de la production de GFP en réponse aux ATF contenant des domaines de liaison à l’ADN non liés à la levure. Cela peut résulter du fait que ces facteurs atteignent la spécificité d’un seul gène dans le génome de la levure.

L’induction du GEV à elle seule conduit à l’activation ou à la répression de centaines de gènes, alors que Z trois EV et Z quatre EV n’activent que l’expression d’un gène cible placé en aval d’un promoteur synthétique contenant des sites de liaison appropriés. Ici, l’induction de la GFP par Z trois EV en réponse à zéro nanomolaire bêta-œstradiol et à un micromolaire bêta-œstradiol après 18 heures d’induction est montrée La fluorescence a également été mesurée à partir de cellules dépourvues de GFP pour illustrer la régulation stricte du système Z trois EV. La capacité de Z trois EV à induire la GFP dans une gamme de concentrations de bêta-œstradiol est illustrée ici.

La fluorescence moyenne des distributions révèle que la relation entre la concentration de l’inducteur et la sortie d’expression est graduée avec un coefficient de colline d’environ un indiquant une liaison indépendante de Z trois EV. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les microréseaux d’expression génique pourraient être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont la modification de l’expression d’un seul gène affecte les modèles d’expression génique du vin. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, tester et valider l’efficacité des facteurs de transcription artificiels. Ces facteurs de transcription artificiels contrôlent conditionnellement l’expression des gènes placés en aval des séquences cibles d’ADN appropriées.