Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

L'objectif général de cette procédure est de créer, tester et valider des facteurs de transcription artificiels inducibles, ou ATF, codés génétiquement et dotés d'une spécificité souhaitée. Cette étape est réalisée en premier lieu en créant l'ATF par une simple transformation levure au cours de laquelle l'inclusion d'un produit PCR d'un domaine de liaison à l'ADN conduit à une fusion en phase avec un récepteur d'œstrogène humain et VP16. La deuxième étape de la procédure consiste à créer un plasmide rapporteur GFP pour l'ATF en remplaçant les sites de liaison du plasmide PMN8 par des séquences cibles du facteur de transcription.

La troisième étape de la procédure consiste à tester la capacité des ATF à activer le rapporteur GFP et à évaluer leur effet sur la physiologie de la levure en mesurant la vitesse de croissance. La dernière étape de la procédure consiste à utiliser un facteur de transcription validé pour exprimer de façon conditionnelle une cible génomique native. En définitive, tout gène cible d'intérêt peut être rendu conditionnellement actif.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'induction médiée par le galactose de l'expression génique, est que l'induction sélective peut être obtenue dans diverses conditions nutritionnelles et physiologiques sans effets pléiotropes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des levures grâce à l'introduction rapide et réversible de produits géniques souhaités, permettant l'étude des effets de gain comme de perte de fonction. Pour commencer, amplifier par PCR le domaine de liaison à l'ADN ou DVD d'intérêt en utilisant une polymérase de haute fidélité.

Transformer plus d'un microgramme du produit PCR purifié dans des cellules de levure en utilisant la méthode de l'acétate de lithium. Après la transformation, centrifuger les cellules à vitesse maximale pendant 15 secondes dans une microcentrifugeuse, éliminer le mélange de transformation et resuspendre les cellules dans environ 200 microlitres d'eau stérile avant de les ensemencer sur du milieu extrait de levure, peptone, dextrose ou milieu YPD. Le jour suivant, réaliser une repiquage de YPD sur cinq plaques contenant de l'acide 5-fluororacétique.

Après une croissance de deux à quatre jours, repiquer au moins cinq à 10 colonies sur YPD. Ensuite, réaliser une PCR sur colonies en utilisant les amorces décrites dans le protocole et séquencer pour vérifier l'insertion. Diluer les oligonucléotides de la région de liaison souhaitée à des concentrations équimolaires.

Phosphorylez la région de liaison à l'aide de la polynucléotide kinase T4, puis utilisez un thermocycleur néo selon les conditions de réaction décrites dans le protocole. Ensuite, digérez environ un à deux microgrammes de PMN8 avec NotI-HF et XbaI pendant une heure à 37 degrés Celsius sur gel.

Purifiez la bande du squelette et diluez le squelette purifié à 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, diluez le site de liaison phosphorylé double brin à cinq fois la concentration molaire du squelette par microlitre. À l’aide de la ligase T4 ADN, liguez les sites de liaison dans le squelette digéré à température ambiante pendant 30 minutes.

Réaliser la transformation en ajoutant la moitié de la réaction de ligation à 50 microlitres de cellules EIA coli chimiquement compétentes standard, puis suivre la procédure indiquée dans le protocole écrit. Après récupération des cellules, ajouter de 100 à 200 microlitres de cellules par plaque luria berti ou plaque lb plus ampicilline, et incuber toute la nuit. Le jour suivant, cultiver les e coli dans un milieu liquide lb plus ampicilline, puis extraire l'ADN plasmidique selon la méthode décrite dans le protocole écrit.

Ensuite, séquencer et vérifier le nouveau plasmide rapporteur à partir des colonies de ligation. Enfin, transformer le nouveau plasmide rapporteur dans la souche E contenant le facteur de transcription (A TF) en utilisant la transformation par acétate de lithium. Pour commencer, faire croître une souche contenant le facteur de transcription et le rapporteur pendant la nuit dans cinq millilitres de milieu synthétique complet dépourvu d'uracile.

Se procurer 9 flacons de 250 millilitres et ajouter 25 millilitres de SC privé d'URA à chacun. Préparer ensuite sept de ces flacons avec différentes dilutions de bêta-estradiol, comme indiqué dans le protocole textuel, à partir d'une dilution sérielle au dixième d'une solution mère de bêta-estradiol à 25 millimolaire, en ajoutant 125 microlitres des cultures de nuit à ces sept flacons ; pour les deux flacons restants, réaliser l'inoculation avec une souche produisant de la GFP de façon constitutive et une souche dépourvue de GFP. Ces dernières sont nécessaires pour l'étalonnage du cytomètre en flux.

Agiter le flacon à 200 tr/min et à 30 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures. Ensuite, prélever 500 microlitres de chaque culture et centrifuger dans des tubes Eppendorf de 1,7 millilitre séparés. Après avoir aspiré le surnageant, laver les cellules pelletées une fois avec du tampon de cytométrie en flux, puis resuspendre les cellules dans un millilitre du même tampon.

Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de cytométrie en flux à neuf falcons deux. Ajoutez les cellules resuspendues aux tubes falcon contenant le tampon, pour un volume final égal à deux millilitres. Enfin, effectuez la cytométrie en flux.

Utilisez la diffusion directe et la diffusion latérale pour identifier les cellules de levure. Réglez le débit d'écoulement à environ 3000 cellules par seconde. Mesurez la GFP à l’aide du canal 50 et procédez comme indiqué dans le protocole écrit : à partir de stocks congelés, étaler à la fois une souche contenant un A TF et une souche dépourvue d’A TF sur du YPD. Après deux jours de croissance, ensemencez séparément des tubes de culture contenant cinq millilitres de milieu liquide YPD et faites croître chaque souche durant la nuit à 30 degrés Celsius.

Effectuez des dilutions sérielles dix fois d'une solution mère de bêta-estradiol à 0,25 millimolaire jusqu'à 10 000 fois, dans de l'éthanol à 100 %. Ajoutez 40 microlitres de chaque culture ensemencée la nuit précédente à 10 millilitres de milieu liquide YPD. Pour chaque souche, ajoutez 96 microlitres des cellules diluées dans 18 puits d'une plaque de 96 puits.

Ensuite, ajoutez quatre microlitres de bêta-estradiol aux cellules. Un point essentiel est de s'assurer que chaque puits contient la même quantité totale d'éthanol. Effectuez un tripliqué avec trois puits pour chaque souche, contenant uniquement de l'éthanol.

Les témoins recouvrent la plaque de 96 puits d'une membrane perméable aux gaz. Surveillez la croissance à une densité optique de 600 nanomètres à l'aide d'un lecteur de plaques. Quantifiez les taux de croissance à l'aide de diverses méthodes, telles que la détermination de la pente maximale.

Après avoir préparé le plasmide selon les instructions du protocole textuel de PCR, amplifier le cassette promoteur can MX. Transformer le produit de PCR dans une souche exprimant A TF en utilisant la méthode au chlorure de lithium, ensemencer les cellules transformées sur YPD et réaliser une plaque de réplica sur YPD additionné de l'antibiotique G quatre 18 le lendemain. Enfin, confirmer l'insertion correcte du promoteur à l'aide d'une amorce directe et d'une amorce inverse interne au gène dont le promoteur a été remplacé.

Le produit final de PCR est d’environ 1,2 KB. On observe ici l’induction de la GFP par trois paires différentes de promoteurs de TF : Z quatre EVZ, trois EV ou GEV, au cours du temps en réponse à une concentration d’un micromolaire de bêta-estradiol. Remarquez l’augmentation de la production de GFP en réponse aux ATF contenant des domaines de liaison à l’ADN non issus de levure. Ceci pourrait résulter du fait que ces facteurs atteignent une spécificité monocellulaire dans le génome de la levure.

L'induction par le GEV seule entraîne l'activation ou la répression de centaines de gènes, tandis que Z trois EV et Z quatre EV n'activent l'expression que d'un gène cible placé en aval d'un promoteur synthétique contenant des sites de fixation appropriés. Ici, l'induction de la GFP par Z trois EV en réponse à zéro nanomolaire de bêta-estradiol, et à un micromolaire de bêta-estradiol après 18 heures d'induction est illustrée. La fluorescence a également été mesurée à partir de cellules dépourvues de GFP afin de montrer la régulation stricte du système Z trois EV. La capacité de Z trois EV à induire la GFP sur une gamme de concentrations de bêta-estradiol est présentée ici.

La fluorescence moyenne des distributions révèle que la relation entre la concentration de l'inducteur et le niveau d'expression est progressive, avec un coefficient de Hill d'environ un, indiquant une liaison indépendante de Z trois EV. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que les puces à ADN pour l'expression génique pourraient être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont la modification de l'expression d'un seul gène affecte les profils génomiques d'expression génique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, tester et valider l'efficacité de facteurs de transcription artificiels. Ces facteurs de transcription artificiels contrôlent de façon conditionnelle l'expression des gènes placés en aval de séquences cibles d'ADN appropriées.