Name: Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes dEAE chronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T18:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Découvrez l'injection systémique de cellules souches neurales chez des souris atteintes d'EAE chronique, un modèle de sclérose en plaques. Cette méthode minimalement invasive permet d'évaluer la survie et l'intégration des cellules dans le système nerveux central inflammatoire.

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Les auteurs remercient Jayden Smith pour l&#39;examen critique et l&#39;édition de la preuve du manuscrit. Ce travail a reçu le soutien de la National Multiple Sclerosis Society (MNSD, subventions partielles RG-4001-A1), l&#39;Association italienne de la sclérose en plaques (AISM, accorder 2010/R/31), le ministère italien de la Santé (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), le Conseil européen de la recherche (CER) au titre de l&#39;accord ERC-2010-StG Grant ne le 7ème programme-cadre de la Communauté européenne (CE) 260511-SEM_SEM et (FP7/2007-2013) cadre de l&#39;Accord de don n * °; 280772 - Ione.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Thérapies à base de cellules souches somatiques sont en train de devenir l&#39;une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement des troubles du système nerveux central inflammatoires chroniques telles que le MS2 11. Bien que les mécanismes soutenant leurs effets thérapeutiques doivent encore être complètement élucidé, l&#39;impact significatif des PNJ transplantation dans différents modèles expérimentaux de maladies neurodégénératives a donné lieu à la croyance un peu provocateur que les cellules s...

Des preuves solides ont surgi de in vivo attestant de l&#39;efficacité thérapeutique de la transplantation de cellules somatiques neurales souches / précurseurs (PNJ) dans des modèles animaux de troubles du SNC 1-8. Néanmoins, un certain nombre de questions relatives à la livraison de cellules souches dans l&#39;hôte nécessite un examen attentif avant ces résultats expérimentaux peuvent être convertis en applications cliniques. Un obstacle particulier important vers le développement de (non-hématopoïétiques) réparatrice thérapies de cellules souches pour les maladies inflammatoires chroniques multifocales, cerveau est l&#39;identification de l&#39;itinéraire idéal d&#39;injection PNJ. Une bonne compréhension de la physiopathologie de la maladie ciblée (focale ou multifocale; dégénérative inflammatoire ou primaire primaire), et une analyse prudente des questions de faisabilité et des risques associés aux techniques de livraison sont en identifiant le protocole optimal pour la livraison de cellules souches. Bien que la focale ( <em&gt; Par exemple. dans le parenchyme du système nerveux) transplantation de cellules souches est une approche logique pour le traitement des maladies du système nerveux central caractérisée par des zones spatialement confinés de dommages (par exemple la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington, le cerveau et la moelle épinière des blessures traumatiques, et accident vasculaire cérébral), la même approche peut s&#39;avérer être pratiquement impossible dans des conditions telles que MS, où un dommage multifocale, chronique, et dans l&#39;espace diffusées CNS s&#39;accumule au fil du temps. Dans ce dernier cas, le ciblage des injections de cellules focales de lésions individuelles est également entravé par la capacité limitée des PNJ transplantés à migrer sur de longues distances dans le parenchyme du SNC, incitant ainsi l&#39;identification de méthodes alternatives, plus appropriés de SNC visant avec greffes NPC moins invasives . Grande promesse émergé des observations que les PNJ ciblent une tumeur intracrânienne (par exemple. Gliome) chez la souris lorsqu&#39;il est injecté par voie intravasculaire en dehors de la CNS9. Suite à cette séminaldes preuves in vivo de la pathotrophism de cellules souches 10, de nombreuses données ont été accumulées concernant la faisabilité et l&#39;efficacité thérapeutique de la transplantation systémique des PNJ dans les animaux de laboratoire avec l&#39;encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), comme un modèle de lésions inflammatoires du système nerveux central, soit par voie intraveineuse (iv) ou intracérébroventriculaire (ICV). d&#39;injection PNJ 1,2,5,6,8 .. Nous avons tout d&#39;abord montré que cela dépend de la capacité des PNJ transplantés à cibler et à entrer dans le système nerveux central enflammée, et d&#39;engager ensuite intercellulaire multiple programmes de communication au sein de micro-environnements spécifiques in vivo 11. Afin de cibler spécifiquement le système nerveux central, les PNJ sont livrés directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de circulation par injection icv, ou dans la circulation sanguine par injection intraveineuse. Une fois entré dans la circulation sanguine soit ou CSF, PNJ transplantées interagissent activement avecle cerveau (BHE) ou du sang liquide céphalo-rachidien (BCSFB) des barrières et entrer dans le parenchyme du SNC. Cette interaction entre le greffon NPC et le Bureau (ou BCSFB) est régie par ensemble spécifique de molécules d&#39;adhésion cellulaire de surface PNJ (CAMs) et facilitée par l&#39;expression de niveaux élevés de MCP contre-ligands sur endothéliales / cellules épendymaires activées 12-14. Des exemples de ces cames comprennent le récepteur de l&#39;acide hyaluronique, CD44, et la molécule d&#39;adhésion intercellulaire (ICAM) -1 ligand antigène très tardif (VLA) -4 5,15,16 (qui, dans les leucocytes, sont responsables de l&#39;interaction avec épendymaire activé et des cellules endothéliales), et à un antigène des lymphocytes beaucoup plus faible de mesure associé aux fonctions (LFA) -1 et la glycoprotéine P-sélectine ligand (PSGL) -1. NPC expriment également une large gamme de récepteurs de chimiokine, y compris CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, et CXCR4 (mais n&#39;expriment pas CCR3 et CCR7), qui sont fonctionnellement actifs, à la fois in vitro et in vivo 5,16. Ainsi, SystemicaNPC lly injectés utilisent ces CAMs, avec G-protein coupled receptor (GPCR), à s&#39;accumuler au niveau de l&#39;inflammation du système nerveux central. Inversement, les PNJ injecté par voie systémique chez des souris en bonne santé ne pas entrer dans le système nerveux central via vasculaire ou des routes spatiales liquide céphalo-rachidien 2. L&#39;inflammation du système nerveux central, ou endothéliale / activation des cellules épendymaires suivante cytokine systémique ou lypopolisaccharide (LPS) injection comme un modèle d&#39;encéphalite induite chimiquement, est donc nécessaire pour l&#39;accumulation de PNJ systémique injectées dans le cerveau et la moelle épinière 2. Ainsi, le ciblage réussi de la CNS avec les thérapies systémiques NPC dépend de l&#39;identification d&#39;une fenêtre spécifique de la maladie de chances (WoO) dont le cerveau et l&#39;environnement de la moelle épinière sont propices à l&#39;accumulation et la migration trans de PNJ. De telles conditions se présentent généralement, dans le contexte de l&#39;inflammation aiguë et subaiguë 17. Une fois après avoir entré le CNS, transplanté PNJ indifférenciéesse sont révélés améliorer les caractéristiques clinico-pathologiques de la souris ainsi que de plus grands primates non humains, atteintes d&#39;EAE. Ceci a été décrit comme dépendant de minime remplacement des cellules 2 et remarquable sécrétion de facteurs immunitaires paracrines réglementaires et neuroprotecteurs dans périvasculaire CNS 2,5,6,18 vs non-SNC zones enflammées 19,20 (par exemple les ganglions lymphatiques) en réponse à la signalisation cellulaire inflammatoire provoquée par l&#39;infiltration des cellules immunitaires 5. Nous décrivons ici les aspects méthodologiques de l&#39;injection systémique de PNJ somatiques dans un modèle de souris de l&#39;EAE chronique. Plus précisément, nous définissons les protocoles que nous avons établies pour (i) résultent, développer et préparer transplantation PNJ somatiques de la zone sous-ventriculaire (SVZ) des adultes C57BL / 6; (Ii) induire l&#39;EAE chronique chez ces souris et (iii) effectuer thérapeutiquement efficace systémique (iv ou icv) PNJ transplantation isouris nto EAE.

<table><tbody><tr><td>Culture cellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma</td><td>E2888</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>30H11965</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0700/50</td><td></td></tr><tr><td>Souris NeuroCult milieu basal</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>Suppléments de prolifération NeuroCult</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes de base</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1000</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>1514012</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (solution d’enrobage)</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult&reg ; Kit de différenciation (souris)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05704</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>eBioscience</td><td>00-4666-56</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco (DPBS) (10x) sans Ca et Mg</td><td>Laboratoires PAA</td><td>H15-011</td><td></td></tr><tr><td>Myco trace</td><td>Laboratoires PAA</td><td>Q052-020</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td><fort> Immunofluorescence</forte></td>normale sérum de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chèvre</td><td>PAA Laboratories</td><td>B11-035</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol p-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)-phényléther</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab11306</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti GFAP</td><td>DAKO</td><td>203344</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti histone H3 (phospho S10)&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab14955</td><td></td></tr><tr><td>Lapin anti MAP-2</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti MBP</td><td>AbD SEROTEC</td><td>MCA409S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-O4, clone 81 | MAB345</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Solution de montage</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>EAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund’s Adjuvant Incomplete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>DIFCO</td><td>H37Ra</td><td></td></tr><tr><td>MOG(35&ndash ; 55)&nbsp ;</td><td>Espikem</td><td></td><td></td></tr> Liste des <tr><td>toxines coqueluches</td><td>Laboratoires biologiques</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>Processing tissulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris ciseaux droits</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée/courbée</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Trancheuse de cerveau</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Lames chirurgicales</td><td>Swann-Morton</td><td>324</td><td></td></tr><tr><td>P200, P1000 Pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (Vetalar)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>01LC0030</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>32371</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>KOPF</td><td>Modèle 900</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td></td><td>7762-04</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr></tbody></table>

injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d&#39;eae chronique

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Cellules souches / précurseurs neurales (PNJ) sont une source de cellules souches prometteuses pour les approches de transplantation visant à la réparation du cerveau ou de la restauration en neurologie régénérative. Cette directive a surgi de nombreux éléments de preuve que la réparation du cerveau est atteint après la transplantation PNJ focale ou systémique dans plusieurs modèles précliniques de maladies neurologiques. Ces données expérimentales ont identifié l&#39;itinéraire de livraison de cellule comme l&#39;un des principaux obstacles de thérapies de cellules souches réparatrices pour les maladies du cerveau qui nécessite une évaluation urgente. Intraparenchymateuse greffe de cellules souches représente une approche logique de ces pathologies caractérisées par des lésions cérébrales isolées et accessibles tels que les blessures de la moelle épinière et la maladie de Parkinson. Malheureusement, ce principe est applicable à mal des conditions caractérisées par une nature multifocale, inflammatoire et disséminée (dans le temps et dans l&#39;espace), y compris la sclérose en plaques (MS). En tant que tel, le cerveau ciblage par systlivraison PNJ émique est devenu un peu protocole thérapeutique invasive et efficace pour fournir des cellules du cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central (SNC). Cette méthode alternative de livraison de cellule repose sur la pathotropism PNJ, en particulier leur capacité innée à (i) détecter l&#39;environnement via des molécules d&#39;adhésion cellulaire fonctionnels et cytokines et chimiokines inflammatoires récepteurs; (Ii) franchir les barrières anatomiques fuite après administration intraveineuse (iv). Ou intracérébroventriculaire (icv) injection; (Iii) s&#39;accumulent au niveau du site de périvasculaire multiple (s) de inflammatoire cerveau et la moelle épinière des dommages; et (iv) exercer trophique de tissu remarquable et des effets régulateurs immunitaires sur différentes cellules cibles de l&#39;hôte in vivo. Nous décrivons ici les méthodes que nous avons développées pour la iv. et &lt;em&gt; livraison icv de PNJ syngéniques chez la souris avec l&#39;encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), comme modèle de démyélinisation inflammatoire chronique du système nerveux central, et envisager la livraison de cellules souches systémique comme une technique utile pour le ciblage sélectif du cerveau enflammé en neurologie régénérative.

NPC dérivation et la caractérisation Dissections SVZ sont effectuées sur les piscines (n = 5-7 souris / pool) de vieux 6-8 semaines souris C57BL / 6 par le biais de dissociation mécanique et enzymatique (figure 1A). Après quelques jours de culture dans CGM, neurosphères flottants commencent à se former (Figures 1A et 1B). Sphères primaires sont recueillies et mécaniquement des passages tous les 4-5 DIV. Après repiquage, les nombres de cellules vivantes et mortes ...

La transplantation de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) détient de grandes promesses en neurologie régénérative. L&#39;administration systémique de PNJ est devenu faible invasive, et thérapeutique très efficace protocole efficace, pour fournir des cellules souches dans le cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central.

Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d&#39;EAE chronique

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

L'objectif général de ce protocole est d'administrer des cellules souches progénitrices neuronales au système nerveux central par injection intraveineuse chez des souris atteintes d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle de maladie qui imite la sclérose en plaques. Cette procédure consiste d'abord à obtenir des cellules souches progénitrices neuronales, ou NPCs, à partir de la zone sous-ventriculaire du cerveau de souris adultes. La deuxième étape consiste à marquer génétiquement les NPCs à l'aide d'une technologie de vecteur viral afin d'identifier et de suivre les cellules in vivo.Ensuite, les neurosphères en prolifération sont dissociées en une suspension monocellulaire, resuspendues à la densité souhaitée et injectées dans la veine caudale de souris EAE au pic de la maladie. Finalement, une analyse histopathologique post-mortem des organes et tissus, ainsi qu'une immunohistochimie, sont réalisées afin d'identifier et de caractériser la distribution de survie et l'intégration des cellules souches injectées. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre une méthode peu invasive, sûre et efficace pour transplanter des cellules souches et des cellules pr

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Certaines souches de souris sont capables de résister à l'induction de l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) de myéline de base des protéines. Décrit ici est un protocole de vaccination simple qui renverse l'insensibilité et induit la maladie paralytique dans plusieurs types de souris EAE taches résistantes.

Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

Cette vidéo montre la méthode d’induction expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune (EAE) en injectant des peptides dérivés de la myéline avec un adjuvant pour activer les lymphocytes T autoréactifs, qui migrent vers le cerveau. La toxine coquelucheuse est administrée pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant à ces lymphocytes T et à d’autres cellules immunitaires de pénétrer dans le cerveau. Ces cellules immunitaires provoquent une démyélinisation,...

Génération d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Dans cette vidéo, un modèle murin de sclérose en plaques est établi à l’aide d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). On injecte à la souris une émulsion contenant un peptide neuronal et un adjuvant, déclenchant une réponse immunitaire qui active les lymphocytes T autoréactifs. Ceci est suivi d’une injection de toxine coquelucheuse (PTX) pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant aux lymphocytes T autoréactifs d’infiltrer le cerveau. Cette...

Induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Nous décrivons une méthode d’implantation et de maintien de fenêtres en verre sur les moelles épinières exposées de souris adultes pour l’étude expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune. Ces fenêtres fournissent un accès optique chronique à la moelle épinière pour surveiller la dynamique cellulaire au niveau subcellulaire chez les animaux vivants à l’aide de la microscopie à deux photons.

Implantation de fenêtres de moelle épinière en verre chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal établi de la sclérose en plaques. Souris C57BL / 6 sont immunisées avec la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), entraînant une paralysie flasque ascendante causée par des cellules immunitaires auto-réactifs dans le système nerveux central. Protocoles pour l'induction et la surveillance des maladies seront discutés.

Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induit encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) dans C57BL / 6

Ce manuscrit décrit les méthodes d’induction et de notation du modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE), ainsi que l’évaluation de la distribution des cellules immunitaires et des niveaux de cytokines à ARNm dans les ganglions lymphatiques, la rate, le sang et la moelle épinière à l’aide de la cytométrie en flux et de la PCR quantitative, respectivement, à diverses phases de la maladie.

Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l&#39;évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Ce protocole décrit comment déterminer si les traitements pharmacologiques de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale présentent une protection du SNC à la suite de la suppression de l’infiltration des cellules immunitaires ou s’ils sont neuroprotecteurs lors de l’assaut de l’infiltration des cellules immunitaires.

Détermination Suppression du système immunitaire contre la protection du système nerveux central pour les interventions pharmacologiques dans démyélinisation autoimmune

Nous montrons une technique de bioluminescence direct in vivo et l' imagerie dans l'infrarouge proche de la névrite optique et l' encéphalite dans le modèle expérimental d' encéphalomyélite auto - immune (EAE) pour la sclérose en plaques chez les souris SJL / J.

Bioluminescence et proche infrarouge Imaging de névrite optique et inflammation du cerveau dans le modèle EAE de la sclérose en plaques chez des souris

Nous présentons ici les protocoles pour enquêter sur la dépréciation de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo. Nous abordons plus précisément comment déterminer la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique et activité de gélatinase impliquée dans la migration des leucocytes à travers la glia limitans.

Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) sert de modèle animal de la sclérose en plaques. Cet article décrit une approche permettant d’évaluer l’inflammation, la démyélinisation et les lésions axonales de la moelle épinière dans l’EAE. De plus, une méthode permettant de quantifier les niveaux de lumière des neurofilaments solubles dans le sérum de souris est présentée, facilitant l’évaluation des lésions axonales chez les souris vivantes.

Évaluation de l’inflammation, de la démyélinisation et des lésions axonales du système nerveux central dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Découvrez l'injection systémique de cellules souches neurales chez des souris atteintes d'EAE chronique, un modèle de sclérose en plaques. Cette méthode minimalement invasive permet d'évaluer la survie et l'intégration des cellules dans le système nerveux central inflammatoire.

Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d'EAE chronique

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