Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d'EAE chronique

L’objectif global de ce protocole est d’administrer des cellules progénitrices neurales dans le SNC par injection intraveineuse chez des souris atteintes d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle de maladie qui imite la sclérose en plaques. Ceci est accompli en dérivant d’abord des cellules progénitrices souches neurales, ou NPC, de la zone sous-ventriculaire du cerveau à partir de souris adultes. La deuxième étape consiste à marquer génétiquement les NPC à l’aide de la technologie des vecteurs viraux pour l’identification et le suivi cellulaires in vivo.

Ensuite, les neurosphères en prolifération sont dissociées en une suspension unicellulaire, remises en suspension à la densité souhaitée et injectées dans la veine de la queue des souris EAE au plus fort de la maladie. En fin de compte, une pathologie post-mortem des organes et des tissus et une immunohistochimie sont effectuées pour identifier et caractériser la survie, la distribution et l’intégration des cellules souches injectées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode peu invasive, sûre et efficace pour transplanter des cellules souches et progénitrices dans le système nerveux inflammé.

Cette méthode permet de répondre à trois questions clés liées à l’innocuité et à l’efficacité des cellules souches injectées par voie systémique dans des modèles de maladies inflammatoires du système nerveux. La démonstration visuelle de cette méthode est particulièrement utile pour les jeunes scientifiques, car elle aide à comprendre les étapes expérimentales critiques, de l’isolement des cellules souches cérébrales à la préparation à l’injection systémique dans un modèle murin pour la sclérose en plaques. Utiliser une technique stérile appropriée.

Placez un cerveau fraîchement isolé sur une matrice de trancheuse de cerveaux. Utilisez deux lames de rasoir pour produire des sections coronales, à deux millimètres du pôle antérieur du cerveau, à l’exclusion des pistes optiques et à trois millimètres en arrière de la coupe précédente. Placez les tranches de cerveau sur une boîte de Pétri propre et passez au microscope à dissection pour isoler le tissu de la zone sous-ventriculaire.

Après avoir haché le tissu, ajoutez-le à 30 millilitres de solution de digestion préalablement préparée et filtrée. Agitez doucement et incubez pendant 30 minutes, en secouant toutes les 15 minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de croissance complète.

Medium ou CGM par pipetage. D’abord avec une pipette P 1000, puis avec une pipette P 200. Une fois qu’une suspension à cellule unique est atteinte, amenez-la à cinq millilitres de CGM et transférez-la dans un nouveau flacon.

Placez les cellules dans un incubateur et laissez les neurosphères se former pendant cinq à sept jours. Lorsque vous êtes prêt, récupérez la suspension dans un tube de 15 millilitres et centrifugez. Retirez le surnageant et remettez le palais en suspension dans 200 microlitres de CGM.

Dissocier mécaniquement les neurosphères en les passant 100 à 150 fois dans une pointe de pipette P 200. Amenez la suspension jusqu’à un millilitre avec CGM. Ensuite, diluez avec précision la suspension.

Mélangez le volume approprié avec un colorant vital et remplissez un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules. Remettez les cellules en suspension à la bonne concentration et transférez-les dans une nouvelle fiole. Répétez ces étapes tous les quatre à cinq jours pour faciliter l’identification des cellules transplantées in vivo.

Les NPC sont transduits à l’aide de vecteurs viraux codant pour des gènes rapporteurs 72 heures après la transduction des NPC. L’expression des gènes rapporteurs fluorescents est vérifiable par immunofluorescence ou cytométrie en flux. Lorsque vous êtes prêt, récoltez les neurosphères exprimant la GFP par centrifugation et éliminez le surnageant.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution de dissociation des agrégats cellulaires et incubez pendant 10 minutes. Récupérez les cellules et remettez-les doucement en suspension pour obtenir une suspension de cellule unique. En prenant soin d’éviter les bulles d’air.

Après avoir compté et dilué les cellules, conservez la suspension cellulaire sur de la glace jusqu’au moment de l’utiliser. Une fois que les neurosphères sont prêtes, récupérez les souris qui étaient auparavant préparées pour servir de modèle de souris pour le SNC. Le traitement des dommages doit avoir lieu au moment où la maladie est au plus fort de l’expression.

Commencez par placer les souris dans une boîte chauffante pendant environ 10 minutes pour permettre à la veine de la queue de se dilater. Lorsque vous êtes prêt, transférez une souris de la boîte chauffante vers un dispositif de contention pour souris. Fermez la contention pour limiter les mouvements et isoler la queue.

Stérilisez la zone d’injection sur la queue avec une solution topique appropriée. Remplissez une seringue à insuline d’un millilitre avec 150 microlitres de suspension cellulaire et assurez-vous d’éliminer toutes les bulles. Localisez la veine sur la surface dorsale de la queue et positionnez l’aiguille parallèlement à la veine au milieu de la partie inférieure de la queue.

Ici, la veine est plus proche de la surface de la peau. Facilitant ainsi la procédure. Insérez doucement l’aiguille dans la veine en assurant sa position correcte en prélevant quelques microlitres de sang.

Ensuite, injectez lentement la solution dans la veine de la queue Après l’injection, retirez l’aiguille et appliquez une pression pendant quelques secondes pour ralentir le saignement. Placez la souris dans une cage fraîche et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit récupérée. Répétez la même procédure pour toutes les souris à des moments expérimentaux prédéterminés.

Des échantillons sont prélevés sur des animaux traités et témoins et analysés pour déterminer l’infiltration et l’intégration des NPC dans le SNC et d’autres tissus lors de la prolifération en tant que neurosphères Les NPC expriment des marqueurs de l’activité mitotique tels que le phospho hisone H trois indiqués en vert et des cellules neurales indifférenciées comme le nid en rouge lorsqu’ils sont plaqués dans des conditions de différenciation appropriées, Les NPC expriment des marqueurs typiques des trois lignées neuronales tels que le marqueur astroglia, le GFAP, le marqueur neuronal, la protéine associée micro-tubulaire deux et les marqueurs gliaux oligodyliques O quatre et les noyaux de protéines basiques de myéline sont contre-colorés avec des MPC indifférenciés dpi qui doivent être thérapeutiquement efficaces après la transplantation doivent exprimer des molécules d’adhésion à la surface cellulaire qui comprennent CD 44 et la sous-unité alpha quatre de l’antigène quatre très tardif. Ces exemples montrent que les NPC transduits expriment la GFP, à la fois sous forme de neurosphères proliférantes et lors de la différenciation in vitro lors du retrait du facteur de croissance. Les NPC syngéniques injectés par voie systémique chez les souris EAE se trouvent presque exclusivement dans les zones périvasculaires de lésions du SNC indiquées par les flèches à la fois dans le cerveau et la moelle épinière jusqu’à 45 jours après la transplantation.

Une étape clé de cette procédure est la dissociation cellulaire. En fait, la préparation de la suspension unicellulaire est fondamentale pour éviter les pinces ou les agrégats qui peuvent entraîner une occlusion des vaisseaux après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en médecine régénérative qui exploraient des protocoles mini-invasifs pour une administration efficace de cellules souches non périodiques dans le cerveau de petits animaux de laboratoire et, en perspective, d’humains touchés par des maladies neurologiques inflammatoires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez, espérons-le, une compréhension claire des dépannages liés à l’isolement, à la préparation et à l’injection systémique de positions spécifiques aux tissus chez les animaux de laboratoire atteints de maladies cérébrales.