Name: Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez un modèle de brûlure alcaline pour étudier la néovascularisation cornéenne chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des thérapies anti-angiogéniques et de quantifier la réduction de la néovascularisation.

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Nous sommes reconnaissants de l&#39;aide du Dr Li Xinyu dans la préparation du manuscrit. SW a été soutenue par un fonds de démarrage de la Tulane University, New Investigator Award Conseil de recherches du président de l&#39;UT Southwestern Medical Center, NIH Grant EY021862, une bourse de développement de carrière de la recherche visant à prévenir fondation cécité, et un prix brillant Focus à l&#39;âge Dégénérescence Maculaire Liée à la recherche .

Remarque: Le protocole suivant et les résultats représentatifs utiliser l&#39;inhibiteur de HDAC SAHA comme un composé d&#39;exemple. Toutefois, ce protocole n&#39;est en aucun cas limitée à l&#39;utilisation de SAHA, et est recommandée en tant que méthode générale pour tester les effets des composés solubles sur la néovascularisation de la cornée. Des modifications mineures doivent être pris pour que le degré de dilution ainsi que la fréquence et la durée d&#39;application. En outre, des composés qui sont facilement solubles dans l&#39;eau pourront être administrées en l&#39;absence de DMSO. Engagement éthique: Tous les expériences sur les animaux ne doivent être effectuées en conformité avec la législation nationale et les règlements institutionnels. Ce protocole a été approuvé pour une utilisation par l&#39;Université de Tulane institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. Une. Préparation du matériel (dans l&#39;ordre d&#39;utilisation) <ol><li> Couper un morceau de papier filtre de cellulose (11 um) en deux cercles mm. </li><li> Préparer une solution à 1 M de NaOH pardissolvant 20 g de NaOH dans 500 ml d&#39;eau distillée H 2 O. Stocker à température ambiante. ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures alcalins. </li><li> Préparer un cocktail anesthésiant en diluant 10 ml de 100 mg / ml de kétamine et de 2,5 ml de 20 mg / ml de xylazine dans 37,5 ml de 1 x PBS pour obtenir une concentration finale de 20 mg / ml de kétamine et de 4 mg / ml de xylazine. </li><li> Préparer une solution à 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne (pour une analgésie topique) en dissolvant 500 mg de chlorhydrate de proparacaïne dans 100 ml de PBS filtré. </li><li> Préparer 1x PBS en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,23 g de NaH 2 PO 4 dans 900 ml d&#39;H 2 O. distillée Ajuster à pH 7,4. Porter la solution à un volume final de 1000 ml avec de l&#39;H 2 O distillée et de filtrage pour assurer la stérilité. </li><li> Préparer 1000 x solutions de stockage de SAHA à ~ 100 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) en dissolvant 26,4 mg de SAHA dans 1 ml de DMSO. Diluer à un 1x (~ 10 M)solution dans du PBS filtré à chaque utilisation. Conserver la solution stock à -20 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le DMSO est une toxine et mutagène connu. </li><li> Préparer une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation. Sous une hotte chimique, dissoudre 4 g de PFA dans 90 ml de PBS. Porter le mélange à 65 ° C et titrer jusqu&#39;à un pH de 7,4. Une fois que le PFA est dissous, porter la solution à un volume final de 100 ml. Stocker à 4 ° C pendant un mois. ATTENTION: Le PFA est un allergénique connue, cancérigènes et toxiques. </li><li> Préparer du tampon de blocage 1x par dilution de 5 ml de sérum de chèvre et de 500 ul de Triton X-100 dans 94,5 ml de PBS. </li><li> Préparer le tampon de lavage en diluant 1 x 500 ul de Triton X-100 dans 99,5 ml de PBS. </li></ol> 2. Alkali-Burn traitement des blessures et composé <ol><li> Faire tremper un morceau rond de papier filtre, ~ 2 mm de diamètre, dans une solution de 1 M de NaOH. </li><li> Anesthésier les souris avec une injection de 100 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine, which est ~ 100 pi de cocktail anesthésie de l&#39;étape 1.3 par 25 g souris. Anesthésie devrait prendre ~ 1-2 min à mettre po profondeur de l&#39;anesthésie peut être déterminée en pinçant doucement la pointe ou de la queue de l&#39;animal, si l&#39;anesthésie est suffisante il devrait y avoir aucune réponse. Remarque: Il faut veiller à assurer la souris ne succombe pas à l&#39;anesthésie hypothermie induite. </li><li> En utilisant une pipette, appliquer localement une baisse de 0,5% de chlorhydrate de proparacaïne à la surface de la cornée pour l&#39;analgésie locale. </li><li> En utilisant des pinces stériles, ramasser un morceau de papier filtre imbibé NaOH. Si vous remarquez un excès de NaOH accroché à ou s&#39;égoutte par le papier filtre, appuyez brièvement sur le papier filtre imbibé sur un morceau sec de papier filtre pour absorber l&#39;excès. Placer le morceau de papier filtre imbibé de NaOH sur la cornée centrale. Laissez-le pendant 30 secondes pour produire un alcali-brûlure aiguë de ~ 2 x 2 mm 2 de surface. Un microscope d&#39;opération est utile pour placer correctement le papier filtre. Remarque: Seul un œil de la souris should se blesser avec l&#39;autre servant de témoin. </li><li> Retirez le papier filtre. En utilisant une seringue de 10 ml, rincer doucement l&#39;œil avec 10 ml de PBS 1x deux fois pour laver résiduelle NaOH 1. </li><li> Appliquer immédiatement une goutte de solution de travail 1x SAHA (ou un contrôle de véhicule constitué de PBS dilué DMSO contenant pas SAHA) par voie topique à la cornée. Répétez l&#39;application 3 fois par jour pendant 14 jours. Remarque: au cours de cette période, un onguent antibiotique topique n&#39;est pas recommandé car il peut interférer avec le développement de la blessure et la livraison du composé. Utilisez une solution antibiotique liquide, solution de gentamicine tels que de 3%, à la place. </li><li> Passez directement à l&#39;évaluation clinique (protocole n ° 3 ci-dessous) ou de sacrifier la souris et énucléer les yeux pour la cornée montage plat (protocole n ° 4 ci-dessous) ou de la paraffine / histologie conventionnelle congelé. </li></ol> 3. Évaluation clinique <ol><li> Procéder à un examen quotidien de la souris à l&#39;aveugle sous un microscope chirurgical et marquer corneal NV basée sur l&#39;opacité de la cornée, NV, et la taille du navire. Utiliser au moins deux observateurs, et enregistrer un résultat final qui est la moyenne des deux. <ol><li> Note opacité de la cornée sur une échelle de 0-4. 0 = pas du tout claires; 1 = légèrement brumeux, iris et la pupille facilement visible; 2 = légèrement opaques, iris et la pupille encore détectable; 3 = opaques, des élèves à peine détectables; et 4 = complètement opaques sans vue de l&#39;élève. </li><li> Note NV sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux au limbe cornéen; 2 = néovaisseaux enjambant le limbe cornéen et s&#39;approchent du centre de la cornée; 3 = néovaisseaux couvrant le centre de la cornée. </li><li> Note taille du navire sur une échelle de 0-3. 0 = pas de néovaisseaux; 1 = néovaisseaux détectables au microscope chirurgical; 2 = néovaisseaux facilement vu sous microscope chirurgical; 3 = néovaisseaux facilement vus sans microscope. </li></ol></li><li> L&#39;utilisation d&#39;un appareil photo numérique, prendre des images représentatives de l&#39;œil à 7 jours et 14 jours. </li></ol> 4.Cornée coloration et supports plats <ol><li> Corrigez les yeux énucléés dans 4% PFA pendant au moins 1 heure à 4 ° C. </li><li> Transfert à l&#39;œil de 1x PBS et utiliser une pince pour retirer soigneusement l&#39;excès de tissu. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un microscope chirurgical, utiliser une aiguille (calibre 18) ou micro-couteau pour perforer la région péricornéenne de l&#39;oeil (note: cela devrait libérer le fluide de l&#39;oeil). <ol><li> De la perforation réalisée dans la section 4.3.1 en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux pour couper la partie antérieure de l&#39;oeil (cornée) de la partie postérieure. </li></ol></li><li> Transférer la cornée de retour dans 4% PFA pour la fixation nuit à 4 ° C. </li><li> Jeter la PFA 4% (ATTENTION: PFA est dangereux et doit être éliminé conformément à la réglementation institutionnels) et rincer la cornée trois fois avec PBS 1x pour enlever tout résidu PFA. </li><li> Incuber dans du tampon de blocage 1x pendant au moins 2 heures à la température ambiante pour perméabiliser le tissu et empêcher la liaison non spécifique de l&#39;anticorps primaire. <ol><li> Appliquer un anticorps primaire dans un tampon de blocage 1x, à une dilution 100-500. (Par exemple de rat anti-souris-PECAM-1 pour détecter les vaisseaux sanguins à 1:100, de lapin anti-souris-LYVE-1 pour détecter des vaisseaux lymphatiques à 1:500, et / ou de rat anti-mouse-F4/80 pour détecter les macrophages à 1:100). Incuber à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Laver six fois avec 1x tampon de lavage pendant 1 heure à chaque fois à la température ambiante pour éliminer totalement anticorps primaire non lié. </li><li> Appliquer un anticorps secondaire en 1x tampon de blocage à une dilution 500-1000. (Par exemple, une lampe fluorescente de 488 nm marqué de chèvre anti-rat-IgG à 1:800 ou une lampe fluorescente de 594 nm marqué de chèvre anti-lapin IgG à 1:800). Incuber à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Laver trois fois avec PBS 1x pendant 1 heure chacun à la température ambiante à supprimer complètement anticorps secondaire non lié. </li></ol></li><li> Transférer la cornée en frais 1x PBS et, à l&#39;aide d&#39;un microscope chirurgical, faire attention quatre incisions de la périphérie vers le center. Cela devrait diviser la cornée en quatre quadrants de taille à peu près égale (la forme résultante devrait ressembler un peu comme un papillon) et lui permettre de reposer à plat sur une diapositive. </li><li> Monter avec un milieu approprié de montage pour l&#39;imagerie de fluorescence. Pour de meilleurs résultats, les échantillons doivent être visualisés immédiatement et photographies numériques prises, mais peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à l&#39;abri de la lumière à 4 ° C. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le protocole présenté ici résulte des niveaux reproductibles de hemangiogenesis, lymphangiogenèse, et l&#39;inflammation, ce qui en fait un système idéal pour étudier ces trois processus interdépendants (). Bien que cette méthode produit NV cornée centralisée, plusieurs méthodes ont été développées pour provoquer plus dirigé NV, à savoir la suture de la cornée 17 et implantés facteur de croissance exprimer pastilles 18, pourrait également être d&#39;intérêt. Notre protocole est conçu pour être util...

Cécité cornéenne est la quatrième cause la plus fréquente de cécité, responsable d&#39;environ 4% de tous les cas 1. Néovascularisation de la cornée (NV) joue un rôle important dans bon nombre de ces pathologies, y compris la kératite herpétique (le leader de cause infectieuse de cécité dans l&#39;Ouest) et le trachome (la principale cause de cécité infectieuse dans le monde) 2. Les traitements actuels comprennent des stéroïdes, des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), des thérapies anti-VEGF, et la cyclosporine A, ainsi que les techniques chirurgicales conventionnelles ou laser 3. Cependant, la nature débilitante de NV basée pathologies de la cornée, la rareté des installations chirurgicales capables de traiter NV cornée, et l&#39;absence d&#39;une option pharmacologique fortement d&#39;effectuer mené une table ronde d&#39;experts récente de conclure que, malgré les traitements existants, la nécessité médicale fondamentale présenté par ces pathologies reste insatisfait 4. La cornée humainese compose de 5 couches, 3 couches cellulaires (épithélial, stromales et endothéliales) et 2 interface (membrane de Bowman et de la membrane de Descemet). Il fonctionne comme une barrière mécanique et de la surface de réfraction de l&#39;oeil. Sa transparence est la conséquence d&#39;un équilibre délicat de ses composantes et fait partie intégrante de sa fonction 5. Normalement avasculaire, la cornée reçoit le sang à partir de micro-vaisseaux qui courent le long de son bord extérieur, qui sont alimentés à partir de la ciliaire et des artères ophtalmiques. NV cornéenne se produit quand un stimulus favorise l&#39;angiogenèse de ces vaisseaux ce qui leur permet de se développer vers le centre de la cornée et donc de limiter vision 6. L&#39;angiogenèse cornéenne comprend hemangiogenesis et la lymphangiogenèse, qui donnent lieu à la croissance de vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques à partir de l&#39;arcade vasculaire limbique vers le centre de la cornée. Cela conduit à une rupture de la cornée &quot;privilège angiogénique&quot;, une augmentation de l&#39;opacité de la cornée et de la fibrose, la perturbation de la cornée layers, et œdème 7. Les déclencheurs précis de la SA de la cornée sont nombreux, allant d&#39;une réponse aux maladies infectieuses telles que le trachome à un état induit chimiquement provoqué médicaments traditionnels, les produits chimiques industriels, ou des agents de guerre chimiques même. Les mécanismes moléculaires de ce processus ne sont pas, encore, entièrement caractérisés; Cependant, quelques joueurs clés ont été identifiés. Dans des conditions normales la cornée possède un «privilège angiogénique» unique maintenu par un réseau redondant de facteurs anti-angiogéniques (tels que VEGF-R1 soluble) 8. Toutefois, en réponse à un stimulus externe (par exemple une blessure), il y aura une régulation à la hausse locale de facteurs pro-angiogéniques (par exemple, VEGF-A). Cette pencher la balance de facteurs pro-et anti-angiogéniques qui sous-tend le privilège angiogénique de la cornée, et conduit à hemangiogenesis, lymphangeogenesis, et l&#39;inflammation, provoquant ainsi une pathologie cornéenne et même la cécité 9. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Compte tenu de l&#39;besoins médicaux non satisfaits de cette pathologie très invalidante, il est de l&#39;intérêt sur le terrain pour avoir un modèle animal fiable de la SA de la cornée. Ici, nous présentons un tel modèle: contrôlé blessure alcali-brûlure. Différents modèles œil blessures basés sur l&#39;utilisation des anneaux de papier filtre ont été utilisés depuis les années 1970 10. En 1989, un groupe d&#39;ophtalmologistes Harvard Medical School caractérisé un modèle standard d&#39;une blessure en milieu alcalin de combustion centrale de la cornée du lapin sur la base de tremper une feuille de papier filtre circulaire avec de l&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) et de l&#39;appliquer à la cornée à une gamme spécifique de 11 concentrations. Depuis lors, cette technique a été adaptée pour une utilisation dans le 12-14 de la souris. Récemment, le laboratoire Wang a étudié les effets thérapeutiques de l&#39;histone déacétylase (HDAC) SAHA dans la pathogenèse de la NV cornéenne à l&#39;aide d&#39;un modèle de lésion de la cornée dans les alcalis brûlure souris 15. La méthodologie de la cornée modèle de lésion alcali-brûlure souris présentée ici a été construitprincipalement sur ​​le travail préalable de deux autres documents 14,16.

<table><tbody><tr><td>Seringue 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille BD 18 G</td><td></td><td>305918</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 ml</td><td>BD</td><td>306575</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille BD 25 G</td><td></td><td></td> 305916 <td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (anti-rat anti-souris)</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA497RT</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LYVE-1 (anti-souris lapin)</td><td>Abcam</td><td>ab14917</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (anti-rat anti-souris)</td><td>BD</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG Alexa 488 (chèvre anti-rat)</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG Alexa 594 (chèvre anti-lapin)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Caméra</td><td>Tucsen</td><td>TCC 5.0 ICE</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540-1L</td><td>Attention : Mutagènes, Pinces toxiques</td></tr><tr><td>(contondantes), Iris</td><td>WPI</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (tranchantes), Dumont #4</td><td>WPI</td><td>500340</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine Solution</td><td>MedVet</td><td>RXKETAMINE</td><td>Substance contrôlée, licence appropriée requise pour l’utilisation.</td></tr><tr><td>Source lumineuse pour microscope</td><td>Microscope</td><td>AmScope LED-14M-YA</td><td></td></tr><tr><td>(Stéréo 7X-45X)</td><td>AmScope</td><td>SM-1B</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage, VECTASHIELD</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Attention :</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td></td> corrosif <td>P6148-500G</td><td>Attention : Allergène, cancérogène, toxique</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de proparacaïne</td><td>Sigma</td><td>P4554-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (lame de 5 mm), Vanas</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>MPBio</td><td>92939249</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1 Papier filtre</td><td>Whatman</td><td>1001-6508</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine Solution</td><td>MedVet</td><td>RXANASED-20</td><td></td></tr></tbody></table>

un alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Dans des conditions normales, la cornée est avasculaire, et cette transparence est essentielle pour maintenir une bonne acuité visuelle. La néovascularisation (NV) de la cornée, qui peut être causée par un traumatisme, une maladie infectieuse ou kératoplastie, se décompose de la soi-disant «privilège angiogénique &#39;de la cornée et forme la base de plusieurs pathologies visuelles qui peuvent même conduire à la cécité. Bien qu&#39;il existe plusieurs options de traitement disponibles, les besoins médicaux fondamentaux présentés par des pathologies de la cornée néovasculaire reste insatisfait. Afin de développer des thérapies sûres, efficaces et ciblés, un modèle fiable de la SA de la cornée et une intervention pharmacologique est nécessaire. Ici, nous décrivons un modèle de néovascularisation cornéenne blessures en milieu alcalin de brûlure dans la souris. Ce protocole fournit un procédé pour l&#39;application d&#39;une blessure en milieu alcalin combustion contrôlée de la cornée, de l&#39;administration d&#39;un composé d&#39;intérêt pharmacologique, et la visualisation du résultat. Cette méthode pourrait s&#39;avérer instrumentationtal pour étudier les mécanismes et les possibilités d&#39;intervention dans NV cornée et d&#39;autres troubles néovasculaire.

Après une blessure en milieu alcalin brûlure, NV cornéenne se produit dans un mode dépendant du temps prévisible. Figure 1 montre la différence rigide à la fois dans la néovascularisation et l&#39;opacité de la cornée entre un animal non traité (figure 1A) et un animal traité avec l&#39;inhibiteur de HDAC SAHA (Figure 1B ) au point de temps de 7 jours. Les figures 2A et 2B montrent un support plat de la corn...

Néovascularisation (NV) de la cornée peut compliquer multiples pathologies visuelles. Utilisant un modèle de lésion alcalin brûlage dirigé, un niveau quantifiable de la SA de la cornée peut être produite pour l&#39;étude mécaniste de la SA de la cornée et l&#39;évaluation des thérapies potentielles pour les troubles néovasculaire.

Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

L'objectif général de l'expérience est d'observer l'effet d'une thérapie anti-angiogénique dans un modèle murin de néovascularisation cornéenne. Cela est réalisé en appliquant brièvement une solution un molaire d'hydroxyde de sodium sur l'œil de la souris afin d'induire un niveau contrôlé de néovascularisation cornéenne. Dans un deuxième temps, le composé anti-angiogénique est administré quotidiennement, ce qui inhibe la croissance de nouveaux vaisseaux vers la cornée lésée.Ensuite, la souris est euthanasiée et l’œil lésé est prélevé, disséqué et soumis à une coloration immunohistochimique. Afin de quantifier le degré de néovascularisation et d'inflammation, les résultats montrent une réduction mesurable de la néovascularisation, basée à la fois sur l'observation clinique et la coloration immunohistochimique. Les implications de cette technique s'étendent à de nouveaux traitements contre la cécité cornéenne, car elle fournit un niveau reproductible de néovascularisation contre lequel il est possible de tester de nouveaux composés et thérapies.Ainsi, cette méthode peut fournir des informations sur la néovascularisation pathologique de la cornée. Elle peut également servir de modèle pour explorer les mécanismes d'angiogenèse et d'inflammation en général. La démonstration de la procédure sera présentée par un affichiste dans mon laboratoire afin de se préparer à la lésion par brûlure alcaline.Commencez par imbiber un morceau circulaire de papier filtre, d’environ deux millimètres de diamètre, dans une solution d’hydroxyde de sodium à un molaire. Ensuite, anesthésiez une souris par injection de 100 milligrammes par kilogramme de kétamine et de cinq milligrammes par kilogramme de xylazine. Après une à deux minutes, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant doucement l’orteil ou la queue de l’animal afin de vous assurer qu’il n’y a aucune réaction.À l’aide d’un compte-gouttes, appliquer une goutte de chlorhydrate de propané 0,5 % sur la surface cornéenne de l’œil pour une analgésie locale, puis placer la souris sous un microscope chirurgical. Ensuite, utiliser une pince stérile pour prendre le morceau de papier-filtre imprégné d’hydroxyde de sodium tout en regardant à travers le microscope. Placer le papier-filtre au centre de la cornée.Laisser agir pendant 30 secondes afin de provoquer une brûlure alcaline aiguë d’environ deux millimètres sur deux millimètres carrés. Le deuxième œil de la souris n’est pas endommagé et sert donc de témoin interne. Après avoir retiré le papier filtre, utiliser une seringue pour rincer doucement l’œil avec 10 millilitres de PBS 1X deux fois, afin d’éliminer tout excès d’hydroxyde de sodium à 1 molaire.Après le rinçage, appliquer immédiatement une goutte de la solution working à 1 X de Saha localement sur la cornée. Répéter cette application trois fois par jour pendant 14 jours chez les souris témoins. Après la brûlure alcaline et un double rinçage au PBS, appliquer quotidiennement du DMSO dilué dans le PBS ne contenant pas de saha pendant 14 jours. Pendant cette période de deux semaines, administrer une solution liquide de Gentamycine à 3 % quotidiennement aux souris traitées au saha ainsi qu'aux souris témoins.L'évaluation clinique consiste en un examen quotidien des souris de manière aveugle au microscope chirurgical. Au moins deux observateurs effectuent cet examen et enregistrent un score final correspondant à la moyenne des scores attribués par les deux observateurs. Évaluer l'opacité cornéenne sur une échelle de zéro à quatre, où zéro correspond à une transparence totale et un à une légère opacité avec iris et pupille visibles.Facilement visible, deux égale légèrement opaque avec l'iris et la pupille encore détectables. Trois égale opaque avec la pupille à peine détectable, et quatre égale complètement opaque sans vision de la pupille. Une comparaison de la notation de l'opacité cornéenne est présentée ici.Évaluez également la néovascularisation sur une échelle de zéro à trois. Notez que tous les yeux possèdent un anneau de vaisseaux normaux non pathogènes autour de la cornée. Ainsi, un score de néovascularisation de zéro signifie l'absence de nouveaux vaisseaux.Un score de un signifie la présence de néovaisseaux au limbe cornéen. Deux indique des néovaisseaux s'étendant depuis le limbe cornéen et progressant vers le centre de la cornée. Trois correspond à des néovaisseaux qui s'étendent jusqu'au centre cornéen.Une comparaison de la notation de la néovascularisation est présentée ici. Ajoutez un score supplémentaire pour la taille des vaisseaux sur une échelle de zéro à trois, où zéro correspond à l'absence de néovaisseaux. Un correspond à des néovaisseaux à peine détectables au microscope chirurgical.Deux correspond à de nouveaux vaisseaux facilement visibles au microscope chirurgical, et trois correspond à de nouveaux vaisseaux facilement visibles sans le microscope. Une comparaison des scores de taille des vaisseaux est présentée ici à sept jours et à 14 jours. Utilisez un appareil photo numérique pour prendre des images représentatives de l'œil.Après avoir euthanasié une souris, fixer l’œil énucléé dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius, puis transférer l’œil dans un XPBS et utiliser une pince pour retirer soigneusement les tissus excédentaires. À l’aide d’un microscope chirurgical, utiliser un microcouteau pour perforer la région péri-cornéenne de l’œil. Cela doit permettre l’écoulement du liquide intraoculaire ; à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux, élargir la perforation et sectionner la partie antérieure de l’œil.C'est la cornée provenant de la partie postérieure. Transférez la cornée dans du paraformaldéhyde à 4 % pour une fixation durant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain.Éliminer le paraformaldéhyde à 4 % conformément à la réglementation et rincer la cornée trois fois avec un PBS 1x pour éliminer tout résidu de paraformaldéhyde. Incuber ensuite la cornée dans un tampon de blocage 1x pendant au moins deux heures à température ambiante afin de permettre la pénétration du tissu et d'éviter la liaison non spécifique de l'anticorps primaire. Appliquer l'anticorps primaire dans un tampon de blocage 1x à une dilution de 100 à 500 fois et incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit le jour suivant.Lavez la cornée six fois avec un volume de tampon de lavage pendant une heure à chaque fois. Afin d'éliminer complètement tout anticorps primaire non lié, cette étape est réalisée à température ambiante. Appliquez un anticorps secondaire dans un volume de tampon de blocage dilué de 500 à 1000 fois et incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit.Le lendemain, effectuez trois lavages avec un XPBS pendant une heure chacun à température ambiante afin d'éliminer complètement tout anticorps secondaire non lié. Après avoir transféré la cornée dans un XPBS frais, utilisez un microscope chirurgical pour réaliser soigneusement quatre incisions partant de la périphérie vers le centre. Cela doit diviser la cornée en quatre quadrants de taille approximativement égale.La forme obtenue doit ressembler davantage à un papillon et permettre de la poser à plat sur une lame. Transférez la cornée sur une lame et montez-la avec un milieu de montage adapté à l'imagerie fluorescente pour de meilleurs résultats. Les échantillons doivent être photographiés immédiatement, mais ils peuvent être conservés plusieurs semaines à l'abri de la lumière à quatre degrés Celsius.Sept jours après la br&ucirc;lure alcaline, la progression de la n&eacute;ovascularisation corn&eacute;enne peut &ecirc;tre clairement observ&eacute;e. Cette image montre une n&eacute;ovascularisation dans un œil qui n'a pas &eacute;t&eacute; trait&eacute; avec du saha. En revanche, cet œil a &eacute;t&eacute; trait&eacute; trois fois par jour avec l'inhibiteur de l'histone d&eacute;ac&eacute;tylase.Saha.Remarquez la différence d'opacité cornéenne et de néovascularisation entre les deux yeux présentés ici, qui sont des préparations plates cornéennes une semaine après une brûlure alcaline. Ces cornées ont été traitées avec le véhicule contrôle P-B-S-D-M-S-O durant cette semaine. Ces prochaines images proviennent de cornées traitées avec du saha après la brûlure alcaline.La coloration verte montre la coloration des cellules endothéliales vasculaires avec PE camm un et la coloration rouge montre la coloration des cellules endothéliales lymphatiques avec LYVE un. Le traitement saha a entraîné une diminution spectaculaire de l'angiogenèse et de la lymphangiogenèse sur les montages plats. La cornée permet la coloration avec PE camm un, qui sert de marqueur pour les vaisseaux sanguins, et avec LYVE un, qui se lie spécifiquement aux vaisseaux lymphatiques.Cette image montre la superposition de la coloration PE-camm-1 et LYVE-1, permettant de comparer l'angiogenèse et la lymphangiogenèse, ainsi que de comparer les morphologies cellulaires différentes. Des coupes sagittales utilisant F4/80. Coloration des macrophages et dpi.La coloration des noyaux cellulaires est montrée ici. Cette image fusionnée F four 80 et DPI montre l'infiltration de macrophages dans la cornée d'un œil brûlé par un produit alcalin après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'ophtalmologie pour explorer la néovascularisation cornéenne dans des modèles murins.

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Ce protocole décrit une méthode pour infliger une abrasion de la surface oculaire de la souris et de suivre la processus de cicatrisation par la suite. Le protocole profite d’une bavure oculaire pour éliminer partiellement l’épithélium de surface de le œil chez les souris anesthésiés.

Abrasion épithéliale cornéenne avec oculaire Burr comme modèle pour la cornée, la cicatrisation

Ici, des modèles animaux basés sur la souris et le lapin sont développés pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen afin de cribler de nouveaux traitements et le mécanisme sous-jacent.

Modèles animaux ex vivo et in vivo pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen

Ce protocole se concentre sur la néovascularisation cornéenne induite par les brûlures alcalines chez la souris. La méthode génère un modèle de maladie cornéenne reproductible et contrôlable pour étudier l’angiogenèse pathologique et les mécanismes moléculaires associés et pour tester de nouveaux agents pharmacologiques pour prévenir la néovascularisation cornéenne.

Un modèle murin pour la néovascularisation cornéenne par brûlure alcaline

Ce protocole décrit une méthode permettant d’induire une lésion alcaline cornéenne et limbique précise et reproductible dans un modèle murin. Le protocole est avantageux car il permet une lésion uniformément répartie sur la cornée et le limbe de la souris, très incurvés.

Induction de lésions alcalines cornéennes et limbiques à l’aide d’une technique de poinçonnage-tréphine dans un modèle murin

Le modèle murin de lésion de reperfusion de l’ischémie rénale décrit ici comprend une néphrectomie droite qui fournit un tissu témoin et un clampage du pédicule rénal gauche pour induire une ischémie entraînant une lésion rénale aiguë. Ce modèle utilise une approche de laparotomie médiane avec toutes les étapes effectuées via une incision.

Rénale ischémie reperfusion: un modèle de souris de la blessure et de la régénération

Ici, nous présentons le protocole de néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) de souris, un modèle expérimental qui recrée les caractéristiques vasculaires de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) néovasculaire. Une fois maîtrisé, il peut induire de manière fiable et efficace la CNV en tant que système modèle pour tester diverses mesures expérimentales.

Un modèle de souris pour induite par laser néovascularisation choroïdienne

Les athlètes absorbent plusieurs centaines de blessures cérébrales traumatiques légères (mTBI) / commotions cérébrales chaque année; Cependant, la conséquence de ces derniers sur le cerveau est mal comprise. Par conséquent, un modèle animal de mTBI unique et répétitif qui réplique constamment des symptômes cliniquement pertinents fournit les moyens de faire avancer l'étude de mTBI et de commotion cérébrale.

Un modèle de souris de blessures cérébrales traumatiques légères et répétitives légères

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Induite par la ponction de néovascularisation Iris comme un modèle de souris de Rubeosis Iridis

La technique de myographe fil est utilisée pour étudier les fonctions des muscles lisses vasculaires et les nouveaux médicaments écran. Nous rapportons un protocole détaillé permettant de mesurer la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris et de dépistage des nouveaux décontractants de muscle lisse vasculaire.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

Cette étude présente un protocole permettant de mesurer la microcirculation dans la muqueuse buccale humaine par imagerie de contraste de speckle laser. La surveillance de la cicatrisation après que vestibuloplasty combiné avec un greffon de collagène xénogène est présenté sur un cas clinique.

Une nouvelle approche pour la surveillance de néovascularisation de la greffe dans la gencive humaine

Découvrez un modèle de brûlure alcaline pour étudier la néovascularisation cornéenne chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des thérapies anti-angiogéniques et de quantifier la réduction de la néovascularisation.

Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

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