Name: Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez le profilage des polysomes pour analyser l'initiation de la traduction sous stress dans les cellules cancéreuses mammaliennes. Cette méthode par ultracentrifugation sur gradient de saccharose permet d'évaluer l'activité ribosomique avec précision.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PA est récipiendaire d&#39;une bourse «Pierre Durand» de la Faculté de médecine de l&#39;Université Laval. Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en génie du Canada (MOP-CG095386) en sciences naturelles et de RM Le fractionnement de polysome a été acquis par une Fondation canadienne pour l&#39;octroi de l&#39;innovation (MOP-GF091050) à RMR M est titulaire d&#39;une bourse de nouveau chercheur des salaires des IRSC. Nous sommes reconnaissants à MM. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco et A. Cammas pour obtenir des conseils utiles.

Le protocole suit les lignes directrices approuvé par la commission d&#39;examen éthique de l&#39;Université Laval. 1. Préparation des cultures de cellules et de manipulation du cerveau <ol><li> Les cellules de mammifères et de Drosophila <ol><li> Cultiver des cellules HeLa du cancer du col et les cellules embryonnaires Schneider drosophile comme recommandé par l&#39;American Type Culture Collection. Travailler avec des cellules à un passage bas. </li><li> Cellules de la plaque afin d&#39;atteindre 80% de confluence le jour de l&#39;expérience. Pour de meilleurs résultats, utilisez ~ 12 x 10 6 cellules pour chaque condition expérimentale. Avant de faire des extraits pour l&#39;analyse de polysomes, stimuler traduction en ajoutant un milieu complet frais pendant au moins 90 min. </li></ol></li><li> l&#39;isolement du cerveau: Isoler les cerveaux de souris âgées entre 9 et 16 jours après la naissance. L&#39;euthanasie consiste inhalation de CO 2 après anesthésie et dislocation cervicale. Après sacrifice, isoler l&#39;ensemble du cerveau et deux endroits it à -80 ° C ou transférer, directement dans PBS froid 1X pour une utilisation immédiate. </li></ol> 2. Préparation de la densité du système de fractionnement de gradient <ol><li> Laver le système de tube avec du SDS 0,1% pendant 5 min. </li><li> Laver le système de tuyauterie avec 70% d&#39;éthanol pendant 5 minutes, puis avec RNaseZAP solution pendant 5 minutes avant de le laver avec de l&#39;eau DEPC. </li><li> Pomper de l&#39;air afin de sécher le système de tuyauterie de l&#39;appareil. </li></ol> 3. Préparation des gradients de saccharose <ol><li> Ajoutez 15% et 55% des solutions de saccharose dans 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, et 1 mM de DTT. </li><li> Générer le gradient linéaire de saccharose à 15-55% en utilisant une Isco Modèle 160 gradient ancien, tel qu&#39;il est décrit dans les instructions du fabricant. Cependant, il est important de bien contrôler la vitesse de la pompe péristaltique TRIS, afin d&#39;éviter la création de bulles ou des turbulences dans les gradients. Maintenir les gradients à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pendant le temps où le gradient de programme machine est en fonctionnement, refroidir la ultracentrifugation à 4 ° C. </li></ol> 4. Préparation de la cellule et de souris Extraits cerveau <ol><li> Préparation des extraits cellulaires <ol><li> Placez la plaque (s) sur les cellules de la glace et de lavage 3x avec PBS 1X froid. </li><li> Récupération des cellules (~ 12 x 10 6) dans 1 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl à pH 7,4, 1,25 mM de MgCl2, 150 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1% Nonidet P40, 5 inhibiteur U / RNase ml, complété avec mini-comprimés complets inhibiteur de la protéase cocktail sans EDTA), les transférer dans un tube Eppendorf, et bien mélanger en les faisant passer 15x par une seringue 1cc U100 de l&#39;insuline 28 G 1/2. Soit le lysat cellulaire reposer sur de la glace pendant 15 min. </li><li> Mettre quelques gouttes de lysat cellulaire sur une lame pour évaluer la lyse cellulaire par l&#39;observation au microscope à contraste de phase en utilisant un objectif 10X. Seuls les noyaux doivent être visibles et aucun membranes cellulaires devraient être visibles pour attester la lyse cellulaire. Comme contrôle, observercellules non lysées. </li><li> Clarifier le lysat cellulaire par centrifugation à 11 000 g pendant 20 min à 4 ° C et garder le lysat soluble contenant les polyribosomes. </li></ol></li><li> Préparation de souris Extraits cerveau <ol><li> Homogénéiser l&#39;ensemble du cerveau isolé (~ 500 mg) par 10 coups dans un homogénéiseur Dounce glacée avec 2 ml de tampon de lyse et de clarifier l&#39;homogénat par centrifugation à 11 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Charger le surnageant obtenu sur un coussin de saccharose à 50% et de procéder à une sédimentation pendant 2 heures à 200 000 x g en utilisant un rotor d&#39;ultracentrifugation TH-641 à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot translucide contenant les polyribosomes dans 1 ml de tampon de lyse et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Laissez la suspension reste sur la glace pendant 30 minutes avant de le charger sur des gradients. </li></ol></li></ol> 5. Chargement des extraits sur saccharose dégradés et Ultracentrifugation <ol><li> Mesurer la concentrationde l&#39;ARN présent dans l&#39;extrait cytoplasmique en utilisant un spectrophotomètre. Prudemment et lentement charger ~ 20 OD 260 unités de l&#39;extrait sur ​​le gradient de sucrose de 15% à 55%. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a 2-3 mm d&#39;espace disponible à la surface du tube pour éviter le débordement des tubes pendant la centrifugation. </li><li> Centrifuger les gradients en utilisant une ultra-centrifugeuse pour 2 h 30 min à 230 000 xg l&#39;aide d&#39;un rotor d&#39;ultracentrifugation TH-641 à 4 ° C. Lorsque la centrifugation est terminé, retirez les tubes et les placer sur la glace soigneusement à ne pas perturber les gradients. </li></ol> 6. Fractionnement des extraits cytoplasmiques de polysomes profilage <ol><li> Placer des gradients de saccharose sur le système de fractionnement de la masse volumique automatisé et procéder à un fractionnement et la collecte automatisée des fractions (0,5 ml chacune), comme décrit par le fabricant. </li><li> Recueillir chaque fraction (~ 500 pi) dans des tubes Eppendorf individuelles avec un suivi continu de l&#39;absorbance à 254 nm. En parallel de l&#39;opération de fractionnement gradient, le profil de polyribosomal sera édite sur la feuille de papier. Vous pouvez également utiliser une unité d&#39;acquisition de données attachée à l&#39;enregistreur d&#39;avoir une électronique d&#39;acquisition du profil de polysome. </li><li> A la fin de chaque terme, transférer eppendorfs recueillies sur glace sèche. A cette époque, soit magasin recueilli fractions à -80 ° C ou précipiter directement complexes protéine-ARN comme suit. </li></ol> 7. Extraction et l&#39;analyse de protéines <ol><li> Pour chaque fraction recueillie de gradient de saccharose, ajouter 2 volumes d&#39;éthanol à 100% froid et de laisser des complexes ARN-protéine précipite à -20 ° C pendant une nuit. </li><li> Centrifugeuse chaque précipité d&#39;ARN-protéine à 11 000 g pendant 20 min à 4 ° C puis laver à l&#39;éthanol à 70%. Sec et remettre en suspension le précipité dans un tampon d&#39;échantillon SDS-PAGE avant de procéder au transfert de type Western en utilisant des anticorps spécifiques (voir la figure 2). </li></ol> 8. Extraction des ARN et Analyse <ol><li> Précipiter les complexes protéines-ARN comme dans la section 7.1. Remettre en suspension chaque précipité d&#39;ARN-protéine dans le tampon de lyse contenant 0,1% de SDS. Digérer le composant de protéine du précipité avec 2 mg / ml de protéinase K pendant 30 min dans un bain-marie à 55 °. </li><li> Extraire les composants de l&#39;ARN du précipité en ajoutant 1 volume de &quot;phénol: chloroforme&quot;, 2 volumes de chloroforme, et 0,1 volume de NaOAc 2 M pH 4 et centrifugation à 10 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Précipité l&#39;ARN de la phase aqueuse résultant de chaque échantillon pendant une nuit à -20 ° C en ajoutant 1 volume d&#39;isopropanol et 0,2 pg / pl de glycogène. Spin le précipité pendant 1 heure à 10 000 g à 4 ° C. Laver le culot d&#39;ARN avec de l&#39;éthanol froid à 70%. </li><li> Remettre en suspension le culot d&#39;ARN dans un petit volume d&#39;eau sans RNase. Évaluer la quantité et la qualité de l&#39;ARN à l&#39;aide du spectrophotomètre. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;analyse de profils de polysomes sur des gradients de saccharose permet la mesure de l&#39;initiation de traduction en analysant la densité de polysomes isolés à partir de cellules ou de tissus 9,11-14. Cette technique est la meilleure (si ce n&#39;est pas l&#39;Unique) approche pour mesurer initiation de la traduction in vivo. Il est utilisé pour surveiller l&#39;état de translation de la croissance de cellules au cours du cycle cellulaire 15, et à évaluer les effets de différents ty...

Les cellules eucaryotes rencontrent constamment une gamme de conditions de stress physiologiques et environnementaux néfastes qui nécessitent une réponse cellulaire adaptative rapide. réponse au stress cellulaire implique un équilibre précis entre anti-survie et pro-survie facteurs agissant. Perturber cet équilibre peut avoir des conséquences irréversibles menant au développement de pathologies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives. Au cours de la première étape de la réaction de stress, les cellules activent des voies pro-survie qui comportent la commande coordonnée des changements dans l&#39;expression génétique au niveau de la traduction de l&#39;ARNm. traduction de l&#39;ARNm chez les eucaryotes est un processus cellulaire complexe qui implique des interactions coordonnées entre les facteurs d&#39;initiation de traduction (SIFE), des protéines de liaison d&#39;ARN spécifique (RBD), et des molécules d&#39;ARN 1. traduction de l&#39;ARNm est divisé en trois phases distinctes: initiation, l&#39;élongation et terminaison. Bien que les trois phases sont soumis à réglemécanismes mentaires, les mécanismes de contrôle de la traduction ciblent principalement la phase d&#39;initiation de la traduction, qui constitue ainsi l&#39;étape de limitation de vitesse de la synthèse des protéines 2. initiation de la traduction est un processus hautement ordonnée qui commence avec la formation de la eIF2a.GTP.Met-ARNt i Met complexe ternaire et sa liaison ultérieure de la sous-unité 40S du ribosome, ce qui conduit à la formation du complexe de pré-initiation. La prochaine étape est le recrutement du complexe de pré-initiation à l&#39;ARNm, ce qui implique l&#39;activité des facteurs d&#39;initiation de traduction tels que eIF4F et eIF3. Le complexe de pré-initiation 48S ainsi formé subit des changements conformationnels spécifiques qui permettent cette machinerie pour commencer la numérisation de la région 5 &#39;non traduite de l&#39;ARNm jusqu&#39;à ce qu&#39;il reconnaît le codon d&#39;initiation août La plupart des facteurs d&#39;initiation de traduction sont alors libérés et sous-unités 60S sont recrutés pour former un ribosome 80S complexe compétente pour la traduction, unt qui la synthèse des protéines point commence (Figure 1). Plus d&#39;un 80S monosome peut être la traduction de l&#39;ARNm même à un moment la production de soi-disant polysomes (ou polyribosomes). La densité des polysomes sur un ARNm reflète l&#39;initiation, l&#39;élongation et les tarifs de terminaison et est une mesure de la transcription d&#39;un Traduisibilité particulier ainsi. Cependant, polysome profil est principalement utilisé pour évaluer les changements dans la traduction de l&#39;ARNm à l&#39;étape d&#39;initiation. Ici, nous avons utilisé un inhibiteur de protéasome comme inhibiteur d&#39;initiation de traduction. Le traitement des cellules cancéreuses avec ce médicament induit une réponse au stress caractérisé par l&#39;activation de la kinase de stress nommé HRI qui phosphoryle le facteur d&#39;initiation de traduction eIF2a 3. La phosphorylation de eIF2a est l&#39;un des principaux événements qui ont conduit à l&#39;inhibition de l&#39;initiation de la traduction dans les cellules de mammifères 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cellules</td></tr><tr><td>HeLa cellules cancéreuses du col de l’utérus</td><td>Collection de cultures de type américain (Manassas, VA ; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila cellules embryonnaires</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA ; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Milieu de culture et suppléments</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-073</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientist Scientist</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions de saccharose</td></tr><tr><td>D-saccharose</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>TNT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>FDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase (Inhibiteur de la ribonucléase recombinante RnaseOUT)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Antiprotéases (complètes, mini, sans EDTA)</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">Extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Phénol :chloroforme</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>²</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life technologies</td><td>10814-010</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Anticorps</td></tr><tr><td>anticorps anti-FMRP</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

analyse de la traduction initiation pendant conditions de stress par polysome profilage

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Un contrôle précis de la traduction des ARNm est fondamentale pour l&#39;homéostasie des cellules eucaryotes, en particulier en réponse à un stress physiologique et pathologique. Des modifications de ce programme peuvent conduire à la croissance des cellules endommagées, une caractéristique de développement de cancer, ou à une mort cellulaire prématurée tel que vu dans les maladies neurodégénératives. Une grande partie de ce qui est connu au sujet de la base moléculaire pour la commande de translation a été obtenue à partir de polysomes analyse en utilisant un système de fractionnement à gradient de densité. Cette technique repose sur des extraits cytoplasmiques ultracentrifugation sur un gradient de saccharose linéaire. Une fois l&#39;essorage est terminé, le système permet le fractionnement et la quantification des zones correspondant à la traduction centrifugés ribosomes populations différentes, conduisant ainsi à un profil de polysomes. Les changements dans le profil de polysomes sont indicatifs de changements ou de défauts dans l&#39;initiation de traduction qui se produisent en réponse à différents types de stress. Cette technique permet également d&#39;évaluer èmee rôle des protéines spécifiques sur initiation de la traduction, et pour mesurer l&#39;activité de traduction des ARNm spécifiques. Nous décrivons ici notre protocole pour effectuer des profils de polysomes, afin d&#39;évaluer l&#39;initiation de traduction de cellules eucaryotes et des tissus dans des conditions de croissance normales, ou soit contrainte.

Comme mentionné précédemment, polysome profil permet l&#39;analyse de l&#39;évolution de l&#39;initiation de traduction dans des conditions de stress. Figure 1 est une vue simplifiée de l&#39;initiation de la traduction qui, comme décrit plus haut est un processus en plusieurs étapes impliquant un assemblage ordonné de complexes d&#39;initiation de traduction. Dans des conditions de croissance normales, les complexes d&#39;initiation de traduction sont convertis en polyribosomes dont la détection par le...

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l&#39;évolution de l&#39;initiation de la traduction de l&#39;ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les effets de conditions de stress sur la traduction et l'initiation dans les cellules et tissus de mammifères par profilage des polysomes. Cela est réalisé en traitant d'abord des cellules cancéreuses de mammifères avec un médicament anticancéreux, puis en préparant des extraits cellulaires. La deuxième étape consiste à préparer des gradients de saccharose.Ensuite, les extraits cellulaires sont chargés sur des gradients de saccharose et soumis à une ultracentrifugation afin de séparer les fractions ribosomiques. Enfin, une analyse par immunotransfert à l'aide d'anticorps spécifiques est réalisée pour évaluer l'association des protéines testées avec les polysomes. Le principal avantage de cette technique par rapport à une méthode existante comme le marquage métabolique est qu'elle nous permet d'évaluer l'effet de conditions de stress sur l'étape d'initiation de la traduction.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine thérapeutique du stress, comme de savoir si et comment les médicaments anticancéreux affectent l'initiation de la traduction. Les implications de cette technique s'étendent vers la théra

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Toeprinting a pour but de mesurer la capacité de in vitro transcrit RNA pour former des complexes initiation traduction de ribosomes dans une variété de conditions. Ce protocole décrit une méthode pour toeprinting ARN chez les mammifères et peut être utilisé pour étudier la traduction fois cap-dépendante et pilotée par l’IRES.

Toeprinting analyse de Translation Initiation complexe formé sur l’ARNm chez les mammifères

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la...

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Le protocole présenté ici implique un profilage polysomal pour isoler le translatome, ARNm associé aux ribosomes, en ARN non polysomiques et polysomiques d’Arabidopsis par centrifugation à gradient de densité de saccharose. Cette méthode démontre l’efficacité de traduction d’Arabidopsis soumis à un stress thermique.

Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Découvrez le profilage des polysomes pour analyser l'initiation de la traduction sous stress dans les cellules cancéreuses mammaliennes. Cette méthode par ultracentrifugation sur gradient de saccharose permet d'évaluer l'activité ribosomique avec précision.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Explorer plus de vidéos