Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

L’objectif général de cette procédure est de mesurer les effets des conditions de stress sur la traduction, l’initiation des cellules et des tissus de mammifères par profilage des polysomes. Ceci est accompli en traitant d’abord les cellules cancéreuses de mammifères avec un médicament anticancéreux, puis en préparant des extraits cellulaires. La deuxième étape consiste à faire du saccharose, des gradients.

Ensuite, les extraits cellulaires sont chargés sur le saccharose, gradients et ultra-centrifugés pour séparer les fractions ribosomiques. En fin de compte, une analyse par western blot à l’aide d’anticorps spécifiques est effectuée pour évaluer l’association des protéines testées avec les polysomes. Le principal avantage de cette technique par rapport à une méthode existante comme le marquage métabolique, est qu’elle nous permet d’évaluer l’effet des conditions de stress sur l’étape d’initiation de la traduction.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine thérapeutique du stress, telles que si et comment les médicaments anticancéreux affectent l’initiation de la traduction. L’implication de cette technique s’étend à la thérapie du cancer car elle aide à révéler de nouvelles voies régulatrices de l’initiation de la traduction. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation de l’initiation de la traduction dans les cultures cellulaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les tissus isolés, y compris le cerveau et les tumeurs.

Pour préparer d’abord le système automatisé de fractionnement par gradient de densité, lavez le système de tuyauterie de l’appareil avec 0,1 % SDS pendant cinq minutes. Ensuite, lavez le système de tuyauterie avec de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes, puis une solution d’ARN Zap pendant cinq minutes. Et enfin, avec DEPC, de l’eau, séchez le système de tuyauterie en pompant de l’air dans le système.

Ensuite, préparez des solutions à 15 % et 55 % de saccharose pour générer le gradient linéaire de 15 à 55 % de saccharose à l’aide d’un modèle ISCO formant un gradient de 60. En suivant les instructions du fabricant, il est important de contrôler soigneusement la vitesse de la pompe trispéristaltique afin d’éviter la création de bulles ou de turbulences dans les gradients pendant la période où le programme gradient maker fonctionne pour refroidir l’ultra centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Maintenez les gradients à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que cette expérience utilise des cellules cancéreuses du col de l’utérus hélicoïdales à faible passage préalablement plaquées pour atteindre 80 % de confluence.

Le jour de l’expérience. Il est important de faire des extractions à partir de cellules fraîches et d’éviter la contamination par l’ARN au cours de cette procédure, 90 minutes avant l’ajout du médicament anticancéreux, remplacez le milieu des cellules par un milieu frais et complet. Pour stimuler la traduction, retournez les cellules dans l’incubateur.

Ajoutez le médicament anticancéreux directement à la culture cellulaire en tant qu’ajout de contrôle. DMSO incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone après quatre heures, placez les plaques sur de la glace et lavez les cellules trois fois avec des cellules de récolte PBS froides dans un millilitre de tampon de lyse pour de meilleurs résultats. Utilisez environ 12 millions de cellules pour chaque condition expérimentale.

Transférez les cellules des plaques grattées dans un tube einor et mélangez bien en les passant 15 fois dans une seringue. Laissez reposer les lysats cellulaires sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, placez quelques gouttes de lysat cellulaire sur une lame et évaluez la lyse cellulaire par microscopie à contraste de phase à l’aide d’un objectif 10x.

Une fois la lyse cellulaire vérifiée, clarifiez le lysat cellulaire par centrifugation à 11 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le lysat soluble contenant les polyribosomes dans un nouveau tube et conservez-le sur de la glace avant de charger les extraits cytoplasmiques sur des gradients de saccharose. Mesurez soigneusement la concentration d’ARN présente à l’aide d’un spectrophotomètre et chargez lentement environ 20 OD deux 60 unités de l’extrait sur le gradient de 15 à 55 % de saccharose.

Assurez-vous qu’il y a deux à trois millimètres d’espace disponible à la surface du tube pour éviter de faire déborder le tube lors de la centrifugation. Chargez les tubes sur le rotor. Placez le rotor sur l’ultra-centrifugeuse et centrifugez les gradients à 230 000 G à quatre degrés Celsius pendant deux heures et 30 minutes.

Lorsque la centrifugation est terminée, retirez les tubes et placez-les avec précaution sur de la glace sans perturber les pentes. Pour commencer le fractionnement des extraits cytoplasmiques, placez les gradients de saccharose sur un système automatisé de fractionnement de la densité et procédez au fractionnement et à la collecte automatisés des fractions comme décrit par le fabricant. Collecter chaque fraction de 0,5 millilitre dans des tubes einor individuels avec surveillance continue de l’absorbance à 250 nanomètres parallèlement à l’opération de fractionnement par gradient, le profil polyribosomique sera édité sur le papier graphique à la fin de chaque passage.

Transférez les tubes d’extrémité avec les fractions collectées sur de la glace. Pour commencer cette procédure, ajoutez deux volumes d’éthanol 100 % froid à chaque fraction collectée et laissez les complexes protéiques d’ARN précipiter à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Pour l’extraction des protéines, centrifugez chaque précipité de protéine d’ARN à 11 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius après lavage avec de l’éthanol à 70 % et remettez le précipité en suspension.

Avant de procéder à l’analyse par transfert Western pour l’extraction de l’ARN Resus, suspendez chaque précipité de protéine d’ARN dans un tampon de lyse contenant 0,1 % de digestion SDS d’un composant protéique du précipité avec deux milligrammes par millilitre de protéinase K pendant 30 minutes. Dans un bain-marie à 55 % Celsius, ajoutez un volume de phénol chloroforme, deux volumes de chloroforme et 0,1 volume de deux molaires d’acétate de sodium pH quatre. Laissez reposer sur de la glace pendant 15 minutes.

Centrifugeuse à 10 000 GS à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Prélevez la phase aqueuse résultante de chaque échantillon en ajoutant un volume d’isopropanol et 0,2 microgramme par microlitre de glycogène et en le laissant à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, faites tourner le précipité à 10 000 G à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Retirez le surnageant et lavez la pastille d’ARN avec de l’éthanol froid à 70 %, remettez la pastille d’ARN en suspension dans un petit volume d’ARN. De l’eau gratuite. Évaluer la quantité et la qualité de l’ARN à l’aide du spectrophotomètre.

Voici des profils polysomptiques représentatifs d’extraits cytoplasmiques. Préparé à partir de cellules hélicoïdales cultivées dans des conditions normales ou après un traitement avec l’inhibiteur de protéasome pendant quatre heures et une centrifugeuse a effectué un gradient linéaire de saccharose de 15 à 55 % de volume à poids. Les positions des ribosomes 40 s 60 s, des ribosomes 80 s, des monos et des polysomes sont indiquées dans chaque profil.

Les fractions du haut vers le bas du gradient sont représentées de gauche à droite. Les fractions ont été recueillies et analysées par Western blot avec des anticorps dirigés contre la grande protéine ribosomique L 28, ainsi que contre la protéine FMRP associée aux polysomes qui servent de témoins de l’intégrité des polysomes dans des conditions de croissance normales. Les complexes d’initiation de traduction sont convertis en poly ribosomes dont la détection par profilage des polysomes atteste d’une initiation de traduction active comme observé ici. Le traitement avec l’inhibiteur du protéasome réduit les pics de polysomes avec une augmentation concomitante d’un DS Monos indiquant une inhibition de l’initiation de la traduction Lors de cette procédure, il est important de travailler dans un environnement exempt de RNASE pour gérer les gradients avec soin et pour contrôler la lyse cellulaire Suite à cette procédure.

D’autres méthodes telles que le sang de l’ouest et le sang du nord peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’association de protéines spécifiques ou de M MNA avec le polysome est affecté par le traitement anticancéreux Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la traduction arytique pour explorer l’impact de la régulation des facteurs d’initiation de la traduction dans les maladies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives.