Réduit la concentration et la durée d'itraconazole et efficace dans le traitement

L'objectif général de cette procédure est de traiter les amphibiens infectés par le champignon amphibien Kitt, Bera key tridium, dendro, he ou BD, à l'aide d'une chimiothérapie antifongique à base de triazole. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant des souches de BD et en inoculant les animaux avec l'agent pathogène fongique. La deuxième étape consiste à tester les animaux par extraction d'ADN et QPCR à partir de prélèvements cutanés afin de confirmer l'infection par le BD.

Ensuite, les animaux infectés sont traités en les baignant avec une solution d'éconazole à 0,0025 % pendant cinq minutes par jour durant six jours. La dernière étape consiste à surveiller l'état d'infection des animaux traités en réalisant une analyse de PCR quantitative sur des échantillons de peau pendant un minimum de quatre semaines après la fin du traitement, afin de s'assurer d'une guérison réussie de l'animal. Cette procédure démontre qu'une concentration réduite et une durée de traitement plus courte de l'antifongique itraconazole sont efficaces pour traiter les animaux infectés par Bd. Le principal avantage de ce protocole thérapeutique par rapport à la dose recommandée, qui consiste en une solution d'itraconazole à 0,01 % pendant 11 jours, est qu'une concentration réduite à un quart de la dose recommandée et une durée de traitement raccourcie à six jours restent efficaces pour guérir l'infection à Bd, tout en minimisant les effets secondaires négatifs liés à l'utilisation de la dose recommandée.

Après avoir incubé le BD dans le bouillon au Triton comme décrit dans le protocole écrit et vérifié la mobilité des spores Zo, inondez chaque boîte avec cinq millilitres d'eau du robinet vieillie et attendez 10 minutes pour permettre aux spores ZO d'entrer dans le milieu. Ensuite, versez la suspension de spores ZO dans un récipient portable. Estimez la concentration de spores ZO à l'aide d'un hémocytomètre et diluez le mélange à une concentration de 1 × 10⁶ par trois millilitres avec de l'eau du robinet vieillie afin d'inoculer un animal tel que la *Latoria vei Alpina* illustré ici.

Placez-le au-dessus d'un récipient de 50 millilitres et versez trois millilitres du mélange d'inoculum sur son ventre. Ensuite, placez l'animal dans le récipient avec l'écoulement de l'inoculum. Fermez le récipient avec un couvercle et laissez l'animal dans le récipient d'inoculation pendant 24 heures afin de garantir l'infection.

Pour éviter toute contamination par l'agent pathogène BD, retirez les gants usagés et placez-les en vue de leur stérilisation en autoclave avant élimination. Après avoir mis une nouvelle paire de gants, procédez à l'inoculation de l'animal suivant.

Après 24 heures d'inoculation, remettez les animaux dans leurs terrariums individuels désinfectés pendant deux semaines. N'oubliez pas de désinfecter tous les déchets liquides avant leur élimination en portant la solution à 10 % d'eau de Javel après deux semaines. Vérifiez une infection réussie par la BD en prélevant un prélèvement sur les animaux à l'aide d'un écouvillon stérile.

Effectuer une rotation douce du frottis pendant et entre les passages. Prélever cinq fois sur le ventre de chaque côté, chaque cuisse et chacun des quatre membres, pour un total de 45 passages. Conserver les frottis dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre à moins 20 degrés Celsius.

Extraire l'ADN génomique des écouvillons à l'aide d'un kit commercial d'isolement de l'ADN et réaliser une QPCR comme décrit dans le protocole écrit. Préparer trois bains de traitement, un pour chacune des trois doses d'itraconazole, comme indiqué dans le protocole écrit. Ensuite, placer individuellement les amphibiens dans un milieu désinfecté.

Des récipients en canette de 50 millilitres contenant 35 millilitres de la solution de traitement. En se souvenant de changer de gants entre chaque animal, agiter doucement le récipient de temps en temps afin de garantir que les animaux soient entièrement recouverts pendant cinq minutes. Après cinq minutes, remettre les animaux dans leur zone désinfectée.

Répétez le traitement de cinq minutes chaque jour pendant encore cinq jours. Testez à nouveau les animaux pour une infection à BD une semaine après la fin du traitement, puis une fois par semaine pendant quatre semaines afin de s'assurer que l'infection a disparu. Notez que, même après l'achèvement du traitement, les animaux doivent être manipulés comme s'ils représentaient toujours un risque de contamination.

Les animaux doivent être maintenus dans des zones séparées pendant au moins un mois après l'infection. Si le traitement échoue, il doit être répété. Les différentes espèces et les différents stades de développement réagissent différemment à l'infection et aux régimes thérapeutiques, et le traitement doit donc être testé avant d'être appliqué de façon généralisée.

Étant donné que BD est un agent biologique dangereux, désinfectez chaque terrarium individuellement chaque semaine en immergeant le terrarium et les récipients de traitement dans une solution d'eau de Javel à 10 %. Laissez tremper pendant au moins 30 secondes, rincez l'eau de Javel avec deux rinçages à l'eau et laissez sécher les récipients pendant 24 heures avant de les réutiliser pour la survie des grenouilles. Des résultats après 11 jours de traitement contre BD ou après six jours de traitement contre BD sont présentés ici.

Les flèches noires indiquent le dernier jour du traitement. Les lignes continues indiquent la survie des groupes témoins. Les lignes noires continues concernent les animaux qui étaient positifs au BD mais n'ont pas reçu le traitement au BD.

Et les lignes grises continues représentent les animaux qui étaient négatifs au BD et n'ont pas reçu de traitement au BD. Les lignes pointillées montrent la survie des groupes traités ayant reçu la concentration indiquée d'éconazole. Tous les animaux traités avec 0,0025 % dans un nébuliseur pendant six jours étaient négatifs au BD quatre semaines après la fin du traitement, ce qui signifie que ce traitement a été considéré comme un succès.

En outre, ce dosage de traitement à l'éconazole n'a pas différé significativement en termes de mortalité par rapport aux témoins positifs BD. Notez que les traitements à 0,01 % et 0,005 % d'éconazole pendant 11 jours ont entraîné une augmentation significative de la mortalité par rapport aux témoins positifs BD. N'oubliez pas que l'agent pathogène fongique BD est un risque biologique nécessitant des précautions telles que le port et le changement de gants, l'autoclavage de tous les déchets solides et la désinfection.

Tous les déchets liquides doivent être traités lors de l'exécution de cette procédure.