Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l'assemblage de la surface à l'initiative Nanostructures Engineered

L'objectif général de cette procédure est de concevoir des nanofibres, des nanostructures et des matrices 2D libres à partir de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples en utilisant un assemblage initié par la surface. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, préparer des matrices en polydiméthylsiloxane (PDMS) en versant le prépolymère PDMS sur un moule maître présentant un motif topographique et en laissant durcir. Deuxièmement, découper les matrices PDMS durcies et les recouvrir d'une solution contenant les protéines de matrice extracellulaire souhaitées.

Ensuite, les matrices sont lavées, séchées et imprimées par microcontact sur une lame de verre recouverte de poly N iso propyl acrylamide, ou pipe PAM. La dernière étape consiste à hydrater la lame avec de l'eau déionisée tiède à 40 degrés Celsius et à laisser refroidir progressivement la solution. Une température inférieure à environ 32 degrés Celsius déclenche la dissolution de la couche de pipe PAM sensible à la température et la libération des nanofibres ou nanostructures protéiques assemblées.

En fin de compte, les nanofibres et les nanostructures assemblées sont libres en solution, comme le confirment la microscopie à contraste de phase et/ou la microscopie de fluorescence, et peuvent être utilisées dans des applications ultérieures telles que des échafaudages pour l'ingénierie tissulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la séparation par face ou l’électrofilage, réside dans la capacité de concevoir des nanofibres de protéines de la matrice extracellulaire à l’aide d’une méthode qui imite véritablement la manière dont les cellules construisent normalement les fibres de la matrice extracellulaire in vivo. La technique d'assemblage initié à la surface présente plusieurs avantages uniques, notamment la possibilité de contrôler la composition protéique, la morphologie des fibres et l'architecture de l'échafaudage.

En outre, nous pouvons concevoir des nanofibres de protéines de la matrice extracellulaire à partir de protéines de la matrice extracellulaire telles que la fibronectine et le collagène de type quatre, ce qui s'est révélé difficile à l'aide d'autres types de méthodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire en permettant aux chercheurs de développer des constructions dotées de signaux physiques et chimiques spécifiques et bien définis afin d'orienter divers comportements cellulaires, tels que l'adhésion et la différenciation. Si vous débutez avec cette technique, vous devez vous souvenir d'inspecter régulièrement la qualité de vos souches ainsi que la fidélité des motifs imprimés par microcontact.

Ceci est essentiel pour obtenir un assemblage adéquat des nanofibres et nanostructures de la MEC. Pour commencer cette procédure, préparez le prépolymère de polydiméthylsiloxane ou PDMS en mélangeant la base d'élastomère et l'agent de réticulation selon un rapport de 10 à 1 en poids par poids ; typiquement, 80 grammes de base et 8 grammes d'agent de réticulation sont utilisés afin de disposer d'une quantité suffisante de PDMS pour recouvrir le moule maître d'une couche d'un centimètre d'épaisseur. Mélangez et dégazez le PDMS à l'aide d'un mélangeur centrifuge réglé comme suit : mélangez à 2000 tr/min pendant deux minutes, dégazez à 2000 tr/min pendant deux minutes. Versez suffisamment.

Déposer le prépolymère de PDMS sur le moule maître pour former une couche d'un centimètre d'épaisseur, puis durcir le PDMS par cuisson à 65 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois durci, utiliser un scalpel pour découper la zone contenant le motif afin de former le tampon en PDMS. Pour distinguer le côté motif du côté arrière du tampon en PDMS.

Découpez une encoche dans l'un des coins de la face arrière du tampon. Commencez cette procédure en nettoyant les lamelles en verre de 25 millimètres de diamètre : plongez les lamelles dans de l'éthanol à 95 % et soumettez-les à une sonication pendant une heure, puis séchez-les dans une étuve à 65 degrés Celsius. Ensuite, préparez la solution de polyacrylamide et d'isopropylacrylamide, ou solution de piam, en dissolvant le piam dans du butanol-1 à une concentration de 10 %. Placez une lamelle en verre propre sur le mandrin sous vide de la centrifugeuse et ajoutez 200 microlitres de la solution de piam sur la surface en verre à l’aide d’une pipette, en veillant à recouvrir entièrement la surface.

Faire tourner la lame à 6 000 tr/min pendant une minute. Nettoyer les tampons en PDMS par sonication dans de l’éthanol à 50 % pendant 30 minutes, puis les sécher sous un flux d’azote ; toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte de sécurité biologique afin de maintenir l’asepsie pour les applications où la matrice extracellulaire ou les nanostructures de la MEC seront utilisées avec des cellules. L’étape de micro-impression par contact est l’aspect le plus délicat de cette procédure.

Il est important d'inspecter les tampons en PDMS à la recherche de défauts visibles avant utilisation. En outre, n'utilisez pas de solution protéique âgée de plus de deux semaines. Placez les lamelles recouvertes de PIAM à l'intérieur d'une boîte de Pétri fermée et stérilisez-les par exposition aux UV.

45 minutes sous lumière UV dans une hotte de sécurité sont suffisantes. Recouvrir la surface gravée de chaque tampon en PDMS avec 200 microlitres de la solution protéique. La fibronectine ou FN est utilisée ici à une concentration de 50 microgrammes par millilitre dans de l’eau distillée stérile.

Incuber pendant une heure à température ambiante, puis laver les tampons en PDMS à l’eau distillée après une heure pour éliminer les protéines en excès et les sécher soigneusement sous un courant d’azote. Il est important d’éliminer complètement l’eau afin d’éviter la dissolution prématurée du canal, un revêtement inadéquat de Pam sur la lamelle et un transfert incorrect des protéines.

Réalisez une impression par microcontact en plaçant le côté structuré du tampon en PDMS en contact avec la lamelle recouverte de PAM, si nécessaire. Utilisez une pince pour tapoter doucement l'arrière du tampon afin d'éliminer les bulles d'air et assurer un contact uniforme après cinq minutes. Détachez délicatement le tampon en PDMS de la lamelle.

À ce stade, selon l'étude, des protéines supplémentaires de la MEC peuvent être dessinées pour créer des structures plus complexes et multi-composantes. Une fois le motif de la MEC imprimé, placez la lamelle recouverte de PAM avec le motif dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et vérifiez la fidélité du motif à l’aide d’une microscopie en contraste de phase.

En fonction du motif, une caméra CCD peut être nécessaire pour distinguer les caractéristiques du motif. Une microscopie en fluorescence peut également être utilisée pour examiner le motif, à condition que les protéines de la matrice extracellulaire soient marquées par fluorescence. Après avoir vérifié la fidélité du motif, ajoutez trois millilitres d'eau distillée à 40 degrés Celsius dans la boîte de Pétri et laissez l'eau refroidir progressivement afin de dissoudre le conduit.

La couche PAM et le relâchement des motifs de protéines de la matrice extracellulaire peuvent être surveillés à l’aide d’une microscopie à contraste de phase. Généralement, afin de s’assurer que les nanostructures de protéines de la matrice extracellulaire ont été libérées, l’eau est refroidie à température ambiante, bien en dessous de la température critique inférieure de dissolution du pipe, pam, qui est de 32 degrés Celsius. Si l’application ne permet pas l’utilisation de techniques optiques, le relâchement peut être surveillé en mesurant la température de la solution.

Des nanofibres et d'autres nanostructures flotteront dans l'eau après le relâchement de la couche de PAM du tube. Pour des applications ultérieures, les nanotissus et autres nanostructures doivent être manipulés, mais l'approche exacte dépendra de l'objectif expérimental. Des résultats représentatifs sont présentés ici afin de démontrer que l'assemblage amorcé en surface, ou SIA, permet de concevoir des nanofibres de protéines de la matrice extracellulaire avec un contrôle précis des dimensions des fibres.

Un réseau de rectangles de fibronectine, de 50 micromètres de longueur et de 20 micromètres de largeur, a été dessiné sur une lame recouverte de piam par ajout d'eau DI à 40 degrés Celsius et refroidissement ultérieur en dessous de la température critique inférieure de la solution. La température du piam a déclenché la dissolution du piam et le relâchement des nanofibres de fibroïne. Les fibres se sont contractées car elles étaient soumises à une précontrainte intrinsèque.

Lorsqu'elles étaient disposées de manière ordonnée sur la surface piam, l'analyse Alice des dimensions des nanofibres de fibronectine avant libération a révélé qu'elles étaient monodisperses, avec une longueur moyenne de 50,19 ± 0,49 micromètres et une largeur moyenne de 19,98 ± 0,17 micromètres. Après libération, les nanofibres se sont contractées de manière notable, mais sont restées monodisperses, avec une longueur moyenne de 14,15 ± 0,92 micromètres et une largeur moyenne de 2,65 ± 0,32 micromètres. La microscopie à force atomique a permis d'obtenir une vue plus détaillée des changements dimensionnels des fibres associés au processus de libération par SIA.

Notamment, les fibres préalables à la libération présentaient une épaisseur uniforme d'environ cinq nanomètres, tandis que les fibres post-libération avaient une épaisseur de l'ordre de plusieurs centaines de nanomètres, alors que leur longueur et leur largeur diminuaient. Grâce au procédé SIA, il est possible de concevoir une variété de nanostructures protéiques de la MEC aux dimensions, formes et compositions ajustables. Par exemple, des nanofibres de fibronectine initialement larges de 20 micromètres et longues d'un centimètre ont été disposées sur un tube.

Le glissement de couverture revêtu de PAM après refroidissement et le tube. La dissolution du PAM a permis le relâchement des nanofibres, formant de longs filaments avec une largeur réduite d'environ trois micromètres. De plus, étant donné que le motif est défini par la topographie de surface du tampon en PDMS utilisé pour l'impression par microcontact, il est possible de concevoir des nanostructures complexes de protéines de la matrice extracellulaire, à titre de preuve de concept.

Des étoiles fibroïnes à plusieurs bras ont été créées. La libération thermique a entraîné la contraction des bras, mais pas de la région centrale de l'étoile où les bras se rejoignent. L'ASI fonctionne également avec d'autres protéines de la MEC, comme la laminine ou LN, et plusieurs protéines de la MEC peuvent être intégrées dans la même structure.

Dans cet exemple, des lignes orthogonales interconnectées, larges de 20 micromètres, de fibronectine représentées en rouge et des lignes larges de 50 micromètres de laminine représentées en vert, intégrées dans un tissu nano-bidimensionnel, ont été structurées puis libérées ; après libération, les deux types de nanofibres se sont contractés, mais l'interconnexion globale et la structure en réseau carré ont été conservées. Ces résultats démontrent que l'ASO peut être utilisée pour concevoir des matériaux de MEC ayant diverses compositions et structures. Enfin, quelques cas d'échec de l'ASO de nanofibres de MEC sont présentés.

Une cause est un relâchement inapproprié d'un motif incomplet dû à un transfert insuffisant de la protéine de la matrice extracellulaire vers la surface de piam. Lors de l'impression par micro-contact, la présence de trous, de bords irréguliers et d'autres défauts crée des nanofibres et des nanostructures incomplètes, sujettes à la rupture et à la fragmentation lors du relâchement. Une dissolution rapide du pipe PAM peut également entraîner une faible fidélité du motif après relâchement.

Par exemple, en utilisant de l'eau à 20 degrés Celsius, une température déjà inférieure à la température critique inférieure de la solution, la piam gonflera rapidement et se dissoudra. Cela peut provoquer un rebondissement et une rupture des nanofibres, comme illustré sur l'image à 32 secondes, et former des configurations aléatoires et désordonnées, comme illustré sur l'image à 52 secondes.

Avant de commencer cette procédure, vérifiez l'état des tiges en PDMS en recherchant d'éventuels défauts et assurez-vous que toutes les surfaces sont exemptes de poussière. Sinon, cela empêchera un transfert adéquat des protéines et entraînera une mauvaise assemblage des structures de CM. Après avoir suivi cette procédure, les nanofibres ou nanostructures libérées peuvent être utilisées à diverses fins, telles que l'analyse des propriétés mécaniques des fibres protéiques, ou comme supports pour l'ingénierie tissulaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de concevoir des nanofibres et des nanostructures de protéines de la matrice extracellulaire (MEC) avec une composition, une géométrie et une architecture ajustables. Plus précisément, vous comprendrez comment imprimer par microcontact des motifs de protéines de la MEC sur des lamelles de verre revêtues de polylysine, puis déclencher thermiquement la dissolution de la surface afin d'assembler les structures de la MEC.