Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l'assemblage de la surface à l'initiative Nanostructures Engineered

L’objectif global de cette procédure est de concevoir des nanofibres, des nanostructures et des matrices 2D autonomes à partir d’une ou plusieurs protéines de matrice extracellulaire en utilisant un assemblage initié en surface. Ceci est accompli en préparant d’abord des tampons de polydiméthyl soane ou PDMS en versant le prépolymère PDMS sur un moule maître à motifs topographiques et en le laissant durcir. La deuxième étape consiste à découper les tampons PDMS durcis et à les enrober d’une solution contenant les protéines de la matrice extracellulaire souhaitées.

Ensuite, les tampons sont lavés, séchés et imprimés par micro-contact sur un poly N iso propyl acrylamide ou une lamelle en verre enduit de PAM. La dernière étape consiste à hydrater la lamelle avec de l’eau déminéralisée chaude à 40 degrés Celsius et à la laisser refroidir progressivement, réduisant ainsi la solution. Une température inférieure à environ 32 degrés Celsius déclenche la dissolution de la couche PAM du tuyau thermosensible et la libération de nanofibres ou de nanostructures protéiques assemblées.

En fin de compte, les nanofibres et les nanostructures assemblées sont autonomes en solution, comme le confirme la microscopie à contraste de phase et/ou à fluorescence, et peuvent être utilisées dans d’autres applications telles que les échafaudages d’ingénierie tissulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la séparation faciale ou l’électro-filage est la possibilité de concevoir des nanofibres de protéines ECM à l’aide d’une technique qui imite vraiment la façon dont les cellules construisent normalement des fibres ECM in vivo. La technique d’assemblage initié en surface présente un certain nombre d’avantages uniques, notamment la capacité de contrôler la composition des protéines, la morphologie des fibres et l’architecture de l’échafaudage.

De plus, nous pouvons concevoir des nanofibres de protéines ECM à partir de protéines de matrice extracellulaire telles que le laminé de fibres et le collagène de type quatre, ce qui s’est avéré difficile avec d’autres types de méthodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire en permettant aux chercheurs de développer des constructions avec des indices physiques et chimiques spécifiques et bien définis pour diriger une variété de comportements cellulaires tels que l’adhésion et la différenciation. Si vous débutez dans cette technique, n’oubliez pas d’inspecter en permanence la qualité de vos tiges ainsi que la fidélité des motifs imprimés par micro-contact.

Ceci est essentiel pour obtenir un bon assemblage des nanofibres et des nanostructures ECM. Pour commencer cette procédure, préparez le poly diméthyl soane ou le prépolymère PDMS en combinant la base d’élastomère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un poids par poids, généralement 80 grammes de base et huit grammes d’agent de durcissement sont utilisés pour s’assurer qu’il y a suffisamment de PDMS pour couvrir le moule maître dans un mélange de couche d’un centimètre d’épaisseur et les DGA le PDMS à l’aide d’un mélangeur centripète réglé sur le mélange suivant à 2000 tr/min pendant deux minutes, DGA à 2000 tr/min pendant deux minutes. Assez pauvre.

Le PDMS prépolymère sur le moule maître pour former une couche d’un centimètre d’épaisseur ici, le PDMS en cuisant à 65 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois durci, utilisez un scalpel pour découper la région contenant le motif afin de former le tampon PDMS. Pour distinguer le côté caractéristique du verso du tampon PDMS.

Découpez une encoche dans l’un des coins au dos du tampon. Commencez cette procédure en nettoyant les lamelles en verre de 25 millimètres de diamètre, sonicez les lamelles dans de l’éthanol à 95 % pendant une heure, puis séchez-les dans un four à 65 degrés Celsius. Ensuite, préparez la solution de poly et d’acrylamide d’isopropyle ou de piam dissoudre le piam dans un butanol à une concentration de 10 %Centrez une lamelle en verre propre sur le mandrin à vide de la spin coer et pipetez 200 microlitres de la solution de tuyau Pam sur la surface en verre pour couvrir entièrement la surface.

Essorez la lamelle à 6 000 tr/min pendant une minute. Nettoyez les tampons PDMS par sonication dans de l’éthanol à 50 % pendant 30 minutes, puis séchez-les sous un courant de séchage à l’azote et toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité pour maintenir la stérilité pour les applications où la matrice extracellulaire ou les nanostructures ECM seront utilisées avec des cellules. L’étape d’impression par micro-contact est l’aspect le plus difficile de cette procédure.

Il est important d’inspecter les tampons PDMS pour détecter tout défaut visible avant de les utiliser. De plus, n’utilisez pas de solution protéinée datant de plus de deux semaines. Le couvercle enduit de PIAM se glisse dans une boîte de Pétri fermée et stérilise en utilisant une exposition aux UV.

45 minutes sous la lumière UV dans une enceinte de biosécurité suffisent. Enduire la surface du motif de chaque tampon PDMS avec 200 microlitres de solution protéique. La fibronectine ou FN est utilisée ici à une concentration de 50 microgrammes par millilitre dans de l’eau distillée stérile.

Incuber pendant une heure à température ambiante après une heure de lavage des tampons PDMS et de l’eau distillée pour éliminer l’excès de protéines et sécher soigneusement sous un jet d’azote. Il est important d’évacuer complètement l’eau pour éviter la dissolution prématurée du tuyau. Revêtement Pam sur la lamelle et transfert inadéquat des protéines.

Effectuez une impression par micro-contact en plaçant le côté caractéristique du tampon PDMS en contact avec la lamelle de recouvrement enduite PAM du tuyau si nécessaire. À l’aide d’une pince, tapotez légèrement sur le dos des tampons pour éliminer les bulles d’air et assurer un contact uniforme après cinq minutes. Décollez le tampon PDMS de la lamelle.

À ce stade. Selon l’étude, des protéines ECM supplémentaires peuvent être modélisées pour créer des structures plus complexes et à plusieurs composants. Une fois le motif ECM imprimé, placez la lamelle recouverte d’un PAM dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et inspectez la fidélité du motif à l’aide de la microscopie à contraste de phase.

Selon le motif, une caméra CCD peut être nécessaire pour résoudre les caractéristiques du motif. La microscopie à fluorescence peut également être utilisée pour inspecter le motif, à condition que les protéines ECM soient marquées par fluorescence. Après avoir vérifié la fidélité du motif, ajoutez trois millilitres d’eau distillée à 40 degrés Celsius dans la boîte de Pétri et laissez l’eau refroidir progressivement la dissolution du tuyau.

La couche PAM et la libération des motifs protéiques ECM peuvent être surveillées à l’aide de la microscopie à contraste de phase. Généralement, pour s’assurer que les nanostructures de protéines ECM ont été libérées, l’eau est refroidie à température ambiante bien en dessous de la température critique inférieure de la solution du tuyau, pam, qui est de 32 degrés Celsius. Si l’application ne permet pas l’utilisation de techniques optiques, le relâchement peut être surveillé en mesurant la température de la solution.

Les nanofibres et autres nanostructures flotteront dans l’eau après la libération de la couche PAM du tuyau. Pour d’autres applications, les nano-tissus et autres nanostructures doivent être manipulés, mais l’approche exacte dépendra de l’objectif expérimental. Des résultats représentatifs sont présentés ici pour démontrer que l’assemblage amorcé en surface, ou SIA, est capable de concevoir des nanofibres de protéines ECM avec un contrôle précis des dimensions des fibres.

Une série de rectangles de fibronectine, de 50 micromètres de longueur et de 20 micromètres de largeur, ont été modelés sur une lamelle recouverte de piam, l’ajout de 40 degrés Celsius d’eau DI et le refroidissement ultérieur sous la solution critique inférieure. La température du piam a déclenché la dissolution du piam et la libération des nanofibres de fibroïne lors de la libération. Les fibres se sont contractées parce qu’elles étaient soumises à une précontrainte inhérente.

Lorsqu’elles ont été modelées sur la surface du piam, l’analyse d’Alice des dimensions des nanofibres de fibronectine avant la libération a révélé qu’elles étaient mono dispersées avec une longueur moyenne de 50,19 plus ou moins 0,49 micromètres et une largeur moyenne de 19,98 plus ou moins 0,17 micromètres. Lors de leur libération, les nanofibres se sont contractées de manière appréciable mais sont restées mono-dispersées avec une longueur moyenne de 14,15 plus ou moins 0,92 micromètre et une largeur moyenne de 2,65 plus ou moins 0,32 micromètre. La microscopie à force atomique a fourni une perspective à plus haute résolution des changements dimensionnels de la fibre associés au processus de libération SIA.

Notamment, les fibres pré-libérées avaient une épaisseur uniforme d’environ cinq nanomètres, tandis que les fibres post-libération avaient une épaisseur de l’ordre de plusieurs centaines de nanomètres tandis que la longueur et la largeur diminuaient. En utilisant le procédé SIA, il est possible de concevoir une variété de nanostructures de protéines ECM avec une taille, une forme et une composition réglables. Par exemple, des nanofibres de fibronectine initialement de 20 micromètres de large et d’un centimètre de long ont été modelées sur un tuyau.

Glissement de recouvrement enduit PAM lors du refroidissement et du tuyau. En se dissolvant, les nanofibres ont été libérées en formant de longs fils d’une largeur réduite d’environ trois micromètres. De plus, étant donné que le motif est défini par la topographie de surface du tampon PDMS utilisé pour l’impression par micro-contact, il est possible de concevoir des nanostructures complexes de protéines ECM comme preuve de concept.

Des étoiles en fibroïne à plusieurs bras ont été créées. La libération thermique a entraîné la contraction des bras, mais pas de la région centrale de l’étoile où les bras se sont rejoints. SIA fonctionne également avec d’autres protéines ECM telles que le laminé ou le LN, et plusieurs protéines ECM peuvent être incorporées dans la même structure.

Dans cet exemple, des lignes orthogonales interconnectées de 20 micromètres de fibronectine montrées en rouge et des lignes de laminine de 50 micromètres de large montrées en vert intégrées dans un nano-tissu 2D ont été modelées puis libérées lors de la libération, les deux types de nanofibres se sont contractés, mais l’interconnectivité globale et la structure carrée du réseau ont été maintenues. Ces résultats démontrent que SIA peut être utilisé pour concevoir des matériaux ECM avec une variété de compositions et de structures. Enfin, quelques cas d’échec SIA de nanofibres ECM sont présentés.

L’une des causes est la libération inadéquate d’un motif incomplet en raison d’un mauvais transfert de la protéine ECM à la surface du piam. Lors de l’impression par micro-contact, la présence de trous, de bords irréguliers et d’autres défauts créera des nanofibres et des nanostructures incomplètes et sujettes à la casse et à la fragmentation lors de la libération. La dissolution rapide du PAM du tuyau peut également entraîner une mauvaise fidélité du motif après la libération.

Par exemple, en utilisant de l’eau à 20 degrés Celsius, une température déjà inférieure à la solution critique inférieure. La température du piam fera gonfler et dissoudre rapidement le piam. Cela peut provoquer la rupture et la rupture des nanofibres, comme illustré dans l’image 32, et former des configurations aléatoires et désorganisées, comme illustré dans l’image de 52 secondes.

Avant de commencer cette procédure, l’état du PDMS est à la recherche de défauts et assurez-vous également que toutes les surfaces sont exemptes de poussière. Sinon, cela empêchera un bon transfert de protéines et entraînera un mauvais assemblage des structures A CM. Ainsi, à la suite de cette procédure, les nanofibres ou nanostructures libérées peuvent être utilisées pour faire un certain nombre de choses telles que l’analyse des propriétés mécaniques des fibres protéiques, ou utilisées comme échafaudages pour l’ingénierie tissulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir des nanofibres et des nanostructures de protéines ECM avec une composition, une géométrie et une architecture réglables. Plus précisément, vous comprendrez comment imprimer par micro-contact des motifs de protéines ECM sur des lamelles de couvercle en verre revêtues de python, puis déclencher thermiquement la dissolution de la surface pour assembler les structures ECM.