Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours C. elegans Embryogenèse

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer les cellules en division dans un tissu en développement au cours de l’embryogenèse de l’élégance C. Afin d’étudier les gènes contrôlant la division cellulaire, cela est réalisé en créant ou en obtenant une souche Celgan qui exprime de manière stable des marqueurs transgéniques qui marquent les cellules d’intérêt. Dans un deuxième temps, il faut éliminer sélectivement un gène d’intérêt en nourrissant D-S-R-N-A à L quatre larves pendant 24 à 48 heures.

Les embryons d’ARNAI sont prélevés sur des hermaphrodites graphiques et transférés sur un bloc aros pour l’imagerie en direct. Ensuite, à l’aide de la microscopie à champ large ou confocale, les embryons sont imagés pour visualiser les phénotypes de division cellulaire. Les résultats montreront comment les neuroblastes se divisent au cours de l’embryogenèse d’Elgin de mer et le rôle des gènes nécessaires à leur division.

Cette méthode peut aider à révéler des questions clés dans le domaine de la biologie du développement et de la biologie cellulaire. Par exemple, cette méthode pourrait révéler des gènes et des mécanismes impliqués dans la régulation de la mitose au cours du développement tissulaire, de la communication cellulaire cellulaire, de la migration cellulaire ou de la polarité cellulaire. Utiliser des vers transgéniques exprimant les marqueurs appropriés conservés sur des plaques de contrôle ou d’ARNI pendant 24 à 48 heures.

Choisissez quatre à six adultes graves et transférez-les dans 20 à 30 microlitres de tampon M nine dans une lame de dépression Pour libérer les embryons, utilisez un scalpel stérile, coupez les vers de chaque côté de la spermathèque ou de la vulve. Ensuite, collectez les embryons à l’aide d’un capillaire tiré, qui est attaché à une poire de pipette et est suffisamment large pour laisser passer les embryons. Transférez les embryons dans un tampon aros fraîchement préparé à l’aide d’un cil collé à un cure-dent.

Créez des groupes de cinq à 10 embryons en poussant les embryons les uns à côté des autres. Couvrez la lame avec une lamelle et ajoutez plus de tampon M nine si nécessaire, puis scellez la lamelle avec du liquide valla préchauffé. Utilisez un microscope épifluorescent à grand champ qui comprend des filtres automatisés.

Des objectifs, une caméra CCD haute résolution et une platine hautement motorisée. Le tout contrôlé par logiciel. Bien que ce système ne les ait pas, l’utilisation de LED et d’un E-M-C-C-D limitera la phototoxicité de l’embryon avec un faible grossissement.

Concentrez-vous manuellement sur les embryons pour imager les neuroblastes. Augmentez le grossissement et choisissez des embryons subissant une intercollation dorsale ou une fermeture ventrale précoce au microscope à grand champ. Choisissez les filtres GFP et Texas rouge et déterminez les plans Z optimaux sur le système à grand champ.

L’utilisation de moins de Zacks et de moins de points temporels réduira la phototoxicité, fermant également l’ouverture à 30 % et, si possible, la diminution de l’intensité lumineuse réduira encore la phototoxicité. Vous pouvez également utiliser un microscope confocal à balayage en direct ou à disque rotatif avec un logiciel contrôlant les objectifs des lasers à balayage, une caméra E-M-C-C-D et une platine hautement motorisée. Maintenant que les paramètres d’acquisition ont été optimisés, imagez les embryons sur le microscope à grand champ.

Il est recommandé de filmer les embryons de contrôle avant les embryons ARN. Avec le système de champ balayé. Réglez les lasers 4 88 et 5 61 100 milliwatts à 40 % de puissance avec une fente de 50 et un temps d’exposition de 300 millisecondes.

Il est important de noter que ces paramètres seront différents pour les autres microscopes. Placez la lame sur la platine du microscope, puis utilisez un objectif à faible grossissement pour trouver les embryons. Passez ensuite à l’objectif à immersion dans l’huile 60 ou 100x.

Une fois concentré, collectez 20 piles Z à 0,2 micron toutes les deux minutes pour un total de 10 minutes. Le temps d’exposition nécessitera probablement des ajustements. La phototoxicité doit être prise en compte lors de l’imagerie d’embryons en direct par microscopie fluorescente, en fermant l’ouverture, en choisissant moins de Zacks ou de points temporels.

La diminution du temps d’exposition peut limiter la phototoxicité si possible. L’utilisation d’un champ SW ou d’un microscope confocal à disque rotatif peut aider à résoudre ce problème. Déterminez votre temps, vos points et vos plans Z d’intérêt à l’aide du logiciel d’acquisition.

Exportez les images souhaitées sous forme de plusieurs tiffs. Ouvrez les plans Z souhaités pour chaque point temporel et canal d’intérêt dans un logiciel de traitement comme Image J et créez un neuroblaste empilé qui ne s’étend souvent que sur quelques plans. Empilez les plans Z pour chaque point temporel et créez des projections d’empilement Z.

Répétez cette opération pour d’autres chaînes. Une fois que toutes les projections Zack pour les points temporels souhaités sont terminées, ouvrez les projections pour créer une séquence temporelle. Faites-le pour chaque canal séparément.

Pour chaque canal, ajustez la luminosité et le contraste si nécessaire. Faites pivoter les images si nécessaire. Sélectionnez ensuite une zone d’intérêt et recadrez les images.

Créez maintenant une image fusionnée à l’aide de la fonction des canaux fusionnés. Sélection d’une couleur différente pour chaque canal. Enregistrez l’image fusionnée en tant que fichier RVB pour visualiser les images plus clairement.

Utilisez les images TIFF 16 bits et sélectionnez la fonction d’inversion sous Modifier pour créer des images en niveaux de gris pour chaque couche. Pour déterminer la taille d’un objet d’intérêt au micron, tracez une ligne et multipliez sa longueur par la taille des pixels, qui est déterminée par les paramètres d’imagerie. Maintenant, faites une barre d’échelle qui représente une proportion de la longueur calculée en microns.

En fin de compte, enregistrez les images finales sous forme de tifs de huit bits. Si vous le souhaitez, convertissez les tiffs en films en utilisant l’image J épidermique. La morphogenèse de l’élégance C se produit en raison d’une combinaison de changements de forme des cellules épidermiques, de migration et d’adhésion avec l’aide des neuroblastes prolifératifs sous-jacents.

Les cellules épidermiques migrent vers la ligne médiane ventrale et forment une seule couche de cellules pour étudier les embryons de division des neuroblastes, exprimant de manière stable le coex et le marqueur spécifique des neuroblastes marqué avec GFP et un marqueur membranaire maternel marqué avec m cherry ont été imagés pendant l’enceinte ventrale à un grossissement accru. Les noyaux des neuroblastes sont indiqués en vert et les membranes environnantes sont indiquées en rouge. Des images en accéléré du neuroblaste en division délimitées avec la sonde membranaire mCherry dans un embryon témoin ont été capturées à l’aide d’un microscope à grand champ pour mieux visualiser le neuroblaste en division dans les embryons témoins. Chaque canal a été conservé en niveaux de gris et les images ont été inversées à l’aide d’embryons témoins de microscopie confocale à champ balayé.

Coex exprimant la GFP de Ham un et le pH de la cerise M ont été imagés dans une région avec des neuroblastes en division. Les mêmes embryons traités avec de l’ARNi pour réduire une expression malade ont été visualisés à l’aide de la microscopie à grand champ. Contrairement aux embryons témoins, de nombreux neuroblastes ont stagné ou régressé pendant la division et sont devenus multinucléés à l’aide de la microscopie à champ balayé.

Il était également clair que de nombreux neuroblastes stagnaient ou régressaient pendant la division et devenaient multinucléés. Cette technique peut également être utilisée pour imager les cellules migratrices lors de la formation des tissus. De plus, si vos Zacks sont utilisés pour permettre une imagerie plus rapide, plus d’informations sur la dynamique subcellulaire peuvent être obtenues.

De plus, avec l’équipement approprié, cette technique pourrait être utilisée pour l’activation de sondes photo-accordables pour effectuer de l’optogénétique. De plus, des techniques de microscopie telles que fret ou fret peuvent être appliquées pour étudier les protéines, les interactions protéiques ou la dynamique des protéines.