Name: Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez comment évaluer le développement des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer chez la souris en utilisant le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode permet d'étudier l'origine développementale de ces cellules immunitaires intestinales.

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Nous remercions les Drs. Alex Gelbard et Willem Overwijk pour obtenir des conseils sur le transfert de gène hydrodynamique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (AI098099, SSW), le Centre MD Anderson Cancer de l&#39;épigénétique, le Centre MD Anderson pour l&#39;inflammation et le cancer (SSW), et le Fonds RE Bob Smith éducation (HSL).

Approbation de l&#39;établissement doit être obtenue au préalable pour toutes les manipulations expérimentales décrites ici sur des souris. Ceux-ci comprennent l&#39;utilisation de souris C57BL6 pour l&#39;isolement de cellules progénitrices de la moelle osseuse, IFNAR - / - souris en tant que destinataires pour le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques et l&#39;utilisation de HGT surexpression de cytokines in vivo. Logement approprié et les soins des animaux doivent aussi être fournies par l&#39;enquêteur ou de l&#39;institution. En outre, l&#39;approbation institutionnelle peut être nécessaire pour les plasmides utilisés dans le transfert de gène hydrodynamique (ie l&#39;approbation de l&#39;ADN recombinant). Les études décrites ici ont été approuvés par l&#39;établissement de soins et d&#39;utilisation des animaux Comité à l&#39;UT MD Anderson Cancer Center. Une. Hydrodynamique transfert de gènes (HGT) Cette étape doit être effectuée deux jours avant le transfert adoptif de lecteurs de disques compacts pour induire une circulation de courant continu Flt3L pour l&#39;expansion in vivo 5. Prepare au moins 5 destinataire souris / groupe. <ol><li> Pour atteindre efficace HGT, les vaisseaux sanguins du destinataire IFNAR - / - souris (CD45.2 +) doivent être dilatées en exposant les souris à une lampe chauffante pendant 5 à 10 min. </li><li> Placez la souris dans un dispositif de butées et désinfecter sa queue avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Injecter 5 ug de plasmide codant pour Flt3L dans 2 ml de PBS stérile dans la veine de la queue en utilisant une aiguille 27 G. Pour la cohorte de contrôle, injecter 5 ug de vecteur vide (pORF) via la veine de la queue comme indiqué. </li><li> Surveillance de la souris pendant 15-30 min pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas d&#39;effets délétères de l&#39;injection dans la veine caudale. Souris Retour à l&#39;établissement de logements pour 2 jours. </li></ol> 2. Isolation des progéniteurs hématopoïétiques de moelle osseuse de souris Cette étape doit être réalisée 2 jours après HGT. Utilisation CD45.1 + souris congéniques comme source de progéniteurs de la moelle osseuse pour le transfert adoptif dans destinataire IFNAR - /- les animaux (CD45.2 +). Dans ce protocole, les souches congéniques sont nécessaires pour distinguer les donateurs et pays en développement bénéficiaires dérivés, ainsi que d&#39;éviter l&#39;épuisement immunitaire due au CMH décalage. Environ 10-20 souris seront tenus de fournir un nombre suffisant de cellules souches hématopoïétiques (10 5 cellules / destinataire souris) pour les expériences de transfert. <ol><li> Euthanasier 10 congénique CD45.1 + souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale. </li><li> Placez chaque carcasse sur un plateau de dissection et stériliser l&#39;abdomen et les jambes avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision au milieu de l&#39;abdomen et couper à travers la peau de l&#39;abdomen de chaque jambe, couper la peau sur toute la longueur de la jambe. </li><li> Retirez délicatement la peau de chaque jambe, et couper et enlever les jambes de la carcasse à l&#39;articulation de la hanche à l&#39;aide des ciseaux pointus. </li><li> Retirez délicatement les muscles du fémur et du tibia de chaque jambe à l&#39;aide d&#39;une lame tranchante. </li><li> Supprimerles deux extrémités du fémur et du tibia avec un scalpel tranchant et placent les os dans une boîte de culture contenant du RPMI complet (RPMI avec 10% de sérum inactivé par la chaleur de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, du pyruvate de sodium 1 mM et 50 uM de β-mercaptoéthanol) . </li><li> Préparer une seringue contenant 1 ml de RPMI complet, relié à une aiguille G 27. </li><li> Insérer l&#39;aiguille 27 G dans une extrémité du fémur ou du tibia. Rincer la moelle osseuse du fémur ou du tibia en injectant lentement le milieu RPMI complet dans l&#39;os. Veiller à ce que les cellules de la moelle osseuse sont retirés de l&#39;os, ce qui peut être accompli par la détection visuelle médias expulsés qui apparaît nuageux. </li><li> Répétez le rinçage chaque fémur et le tibia 3x à éliminer complètement les cellules de la moelle osseuse. </li><li> Préparer une suspension cellulaire unique par aspiration en douceur les cellules et en baisse de 3 à 5 fois dans la boîte de culture. </li><li> Éliminer les débris passant par les cellules de moelle osseuse à travers un tamis de 40 uM de cellules, en plaçant les cellules dans un nouveau exsudé cultuAntenne e. Perturber un amas de cellules qui apparaissent sur le tamis par une légère pression avec le bout d&#39;un piston de la seringue stérile. </li><li> Les Lyse des globules rouges (RBC) présentes dans la suspension de cellules de la moelle osseuse totale avec un tampon de lyse RBC du commerce selon les instructions du fabricant. Utiliser 2 ml RBC lyse buffer/4-6 x 10 7 cellules (généralement des cellules provenant d&#39;une souris) et un temps d&#39;incubation de 5 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules de la moelle osseuse par la granulation des cellules par centrifugation pendant 4 min à 500 x g, en aspirant doucement le milieu de culture, remise en suspension dans 10 ml de tampon FACS (PBS 1x + 2 mM d&#39;EDTA + 1% de FBS), des cellules d&#39;enrobage par centrifugation et doucement aspiration lavage tampon. </li><li> Répéter le lavage, comme décrit dans l&#39;étape 2.13, pour un total de deux lavages. </li></ol> 3. cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler CDP Cette étape nécessite l&#39;accès à un séparateur de cellules MidiMACS et colonnes MACS LD pour une procédure initiale négative de sélection,ainsi que d&#39;une machine FACS avec au moins trois lasers à purifier le progéniteur sous-ensemble multicolore après coloration avec des anticorps conjugués par fluorescence. <ol><li> Après le second lavage à l&#39;étape 2.14, compter les cellules de la moelle osseuse. Sédimenter les cellules par centrifugation comme décrit dans l&#39;étape 2.13 et remettre en suspension dans du tampon FACS pour atteindre une concentration finale de 4 x 10 7 cellules par 30 pi de tampon FACS. </li><li> Pour préparer les cellules pour FACS, les cellules de lignée négative sont d&#39;abord enrichis par une technique de sélection négative qui élimine les cellules de lignée positive à partir du mélange de la moelle osseuse en utilisant une Chromatographie sur colonne de billes magnétiques. Pour la procédure de sélection négative, ajouter 1 pg de chacun des anticorps suivants de rat commercial anti-souris (ABS) qui reconnaissent des marqueurs de la lignée hématopoïétiques: CD3, CD19, CD11c, CD11b, et Ter-119 Abs. Les Abs doivent être ajoutées dans un volume de 2 pl / Ab à la suspension de cellules dans 30 ul de tampon FACS. </li><li> Incuber la suspension de cellules à 4 ° C pendant 30min. Suite à l&#39;incubation, laver les cellules deux fois avec 10 ml de tampon FACS, comme décrit à l&#39;étape 2.13. </li><li> Remettre en suspension les cellules pour obtenir une concentration finale de 4 x 10 7 cells/40 pi de tampon FACS. Ajouter 20 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-IgG de rat microbilles magnétiques par 40 ul de chaque suspension cellulaire. Mélanger doucement et incuber à 4 ° C pendant 30 min. Laver les cellules avec 10 ml de tampon FACS, comme décrit à l&#39;étape 2.13. </li><li> Remettre en suspension à 10 8 cellules de la moelle osseuse dans 500 ul de tampon FACS. </li><li> Chargez une colonne MACS LD sur un séparateur de cellules MidiMACS selon les instructions du fabricant et prélavage de la colonne avec le tampon 2 ml FACS. </li><li> Appliquer la suspension de cellules de moelle osseuse de la colonne, en chargeant jusqu&#39;à 5 x 10 8 cellules dans 2,5 ml de tampon FACS. Assurer un tube de collecte (15 ml tube conique) est placé sous la colonne. Laver la colonne avec 3 x 2 ml de tampon FACS / cycle de lavage, et de recueillir les cellules qui passent à travers la colonne, qui sera enrichie encellules de la lignée négative. Compter les cellules dans le matériau élues (laver passage) de la colonne. </li><li> Pour effectuer une sélection positive des sous-ensembles de progéniteurs hématopoïétiques par FACS, les cellules de tache avec la fluorescence Abs conjugué suivant: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, plus un mélange de lignée Abs marqueurs dirigés contre CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 et Ter119 (tous marqués avec PerCP Cy5.5). Utilisation de 0,5 à 1 ul de chaque Ab dans un volume total de 100 pl. Incuber la suspension de cellules à 4 ° C pendant 20 à 30 min. </li><li> Laver les cellules comme indiqué à l&#39;étape 2.13 et remettre en suspension dans un tampon FACS à une concentration de 2-3 x 10 7 cellules / ml. Filtrer cellules dans un tube de 35 uM de bouchon de crépine de cellule pour éliminer amas de cellules. Cette dernière étape est cruciale pour éviter le colmatage de la machine FACS. </li><li> Placez la suspension de cellules dans un tube FACS sur la scène FACS et trier CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) sur labase du profil de marquage indiqué. Recueillir les cellules purifiées dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de RPMI complet. </li><li> Notez le nombre absolu de cellules triées à la fin de la course FACS. Sédimenter les cellules par centrifugation comme indiqué à l&#39;étape 2.13 et remettre en suspension dans du PBS stérile pour des expériences de transfert adoptif. </li></ol> 4. Le transfert adoptif de CDP Cette étape est généralement effectuée dans l&#39;animalerie où les souris receveuses sont logés. Selon l&#39;emplacement de la machine FACS, il peut s&#39;agir de transport des populations de cellules progénitrices purifiés dans l&#39;installation pour animaux avant un transfert adoptif. suspensions de cellules souches doivent être conservés stérile et transportés sur de la glace. <ol><li> Préparer des suspensions de cellules pour l&#39;injection par dilution de 5 à 10 CDPs purifiés dans un volume total de 100 ul de PBS stérile. Placer la suspension de cellules dans une seringue fixée à une aiguille G 27. </li><li> Exposer le receveur IFNAR - / - </sup&gt; souris (CD45.2 +) pour une lampe chauffante pendant 5 à 10 min pour réaliser une injection efficace dans la veine caudale. </li><li> Placez la souris dans un dispositif de butées et désinfecter sa queue avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Injecter 10 5 purifiées par FACS CDPs dans 100 ul de PBS dans la veine de la queue en utilisant une aiguille 27 G. </li><li> Surveillance de la souris pendant 15-30 min pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas d&#39;effets délétères de l&#39;injection dans la veine caudale. Souris Retour à l&#39;établissement de logements. </li></ol> 5. Isolation de PP et de mesure des pDC Montants <ol><li> À 7-10 jours suivants le transfert adoptif, euthanasier les souris receveuses. Ouvrez doucement la souris par la dissection et exposer l&#39;intestin. </li><li> Retirer tout l&#39;intestin et le placer sur du papier absorbant PBS-imbibés. Collecter toutes les PP visibles le long de la paroi de l&#39;intestin grêle à l&#39;aide de pinces fines et des ciseaux. C57BL6 et IFNAR - / - souris ont typiquement 5-10 PP / souris, qui sont différentes de follicules lymphoïdes isolées trouvésle long de l&#39;intestin grêle 18. Notez que les PP sont souvent structurellement distincts, même au sein d&#39;un simple clic de souris, assurez-vous si soigneusement tous les PP sont identifiés et disséqués. </li><li> Placez PP dans une boîte de Pétri contenant du PBS, et utiliser une pince pour enlever les matières fécales. Répétez cette procédure à deux reprises pour nettoyer PP. </li><li> Digest PP avec 1 mg / ml de collagénase IV dans 10 ml de solution saline équilibrée de 1x Hank (HBSS) dans une fiole de 50 ml avec une agitation vigoureuse pendant 1 h à 37 ° C. </li><li> Placez le PP digéré dans le compartiment supérieur d&#39;une 40 um cellules tamis cellulaire et de la force par la crépine avec un piston de la seringue stérile. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube PP conique de 15 ml. </li><li> Sédimenter les cellules PP tendues par centrifugation à 500 xg pendant 5 min et remis en suspension dans 6 ml d&#39;une solution de Percoll à 37% (37% de Percoll dans du milieu RPMI). Placer délicatement 6 ml d&#39;une solution de Percoll à 70% (70% de Percoll dans du milieu RPMI) en dessous de la suspension de cellules, pour former un gradient de Percoll étape. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 20 minutes unet 800 xg avec la centrifugeuse rompre. Les cellules mononucléaires vont migrer vers l&#39;interface 37/70% d&#39;. Après centrifugation, la population de cellules mononucléaires devraient être collectées par pipetage soigneux à la région d&#39;interface. Pellet les cellules recueillies par centrifugation et lavage à deux reprises dans 50 ml de RPMI complet / cycle de lavage. Un grand volume est utilisé pour assurer une élimination complète de Percoll. </li><li> Colorer les cellules PP recueillies avec les anticorps suivants pour détecter les pDC murines qui dérivent des progéniteurs adoptive transférés (CD45.1 +) ou des souris receveuses (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) et PDCA-1 (FITC) Abs. Effectuer cytométrie en flux des cellules PP comme indiqué dans les étapes 3.9 et 3.10. Identifier les pDC par leur CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + phénotype. Nombres absolus pDC peuvent être déterminées par l&#39;équation suivante:% pDCs x ànombre de cellules tal PP = PP pDC. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

La technique du transfert adoptif décrit ici a évalué la contribution de la population de CDP PP pDC dans des souris receveuses qui sont déficientes en PP pDC (par exemple IFNAR - / - souris). Dans les expériences à venir, il sera important d&#39;évaluer le potentiel d&#39;autres sous-ensembles de souches à générer pDCs PP, en particulier si les pDC PP proviennent de Flt3 + PLC. Cette question est importante, car on ne sait pas pourquoi pDCs PP sont particulièrement sensibles aux signaux I...

Ici, nous démontrons un protocole pour évaluer si progéniteurs des cellules dendritiques communes (CDPS) sont capables de donner naissance à la cellule dendritiques plasmacytoïdes (pDC) de la population dans les plaques de Peyer (PP). L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;évaluer la régulation du développement des pDC dans les plaques de Peyer (PP pDC). La raison pour cela est important, c&#39;est que les pDC PP diffèrent de pDC trouvés dans d&#39;autres tissus, y compris la moelle osseuse, du sang et de la rate, et il est donc difficile de savoir si les pDC PP et d&#39;autres populations PDC sont de développement et / ou fonctionnellement liés. Plus précisément, les pDC sont largement connus pour être le principal type I interféron (IFN) producteurs dans le système hématopoïétique, répondant au récepteur Toll-like 7 et 9 (TLR7 / 9) par stimulation rapide sécrétion d&#39;IFN 1-3. Toutefois, les pDC PP sont déficientes dans la production de IFN de type I en réponse à la stimulation agoniste TLR 4,5. En outre, PP pDCs diffèrent également des pDC présentes dans la moelle osseuse et la rate dansnécessitant des signaux provenant du interféron de type I (IFN) récepteur (IFNAR1) ou l&#39;IFN de signalisation STAT1 molécule pour leur développement et / ou l&#39;accumulation 5. Ces données ont suggéré la possibilité que des mécanismes de régulation distincts contrôlent pDCs PP contre pDC dans d&#39;autres organes (par exemple, la moelle osseuse, la rate) 5. Le raisonnement qui a conduit à la mise au point de ce procédé a été basé sur les avancées récentes dans la compréhension de cellule dendritique (DC) de la biologie. La plupart, sinon la totalité, des sous-ensembles DC dérivent de progéniteurs hématopoïétiques qui expriment le récepteur de tyrosine kinase 3 de type fms (Flt3) 6-10, mais le développement à courant continu n&#39;est pas limitée à l&#39;myéloïde voies classique et lymphoïdes. Par exemple, Flt3 + progéniteurs myéloïdes communs (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FCyR lo / -) donner lieu à CDP (lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +), which différencier davantage dans les pDC et DC classiques (CDCS) 9,10. En revanche, Flt3 + progéniteurs lymphoïdes communs (SPDP, lin - + Sca-1 lo c-kit IL-7R lo) se développent principalement dans les pDC 11. Par conséquent, des études antérieures indiquent pDCs proviennent d&#39;au moins deux populations de cellules progénitrices hématopoïétiques distincts en vertu de la réglementation des Flt3L, bien que l&#39;analyse typique a été limitée à la moelle osseuse, la rate et / ou des sous-ensembles de PDC sang. Ainsi, la population (s) de l&#39;ancêtre qui génère PP pDCs requis enquête. Comprendre les origines de la PP pDCs fera la lumière sur si ils partagent les voies de développement communs avec d&#39;autres populations pDC, ou utiliser des mécanismes distincts au cours de leur génération en PP. Un avantage unique de l&#39;approche décrite ici est l&#39;utilisation de souris qui présentent un déficit sévère en PP pDCs que les destinataires du transfert adoptif progéniteurs hématopoïétiques de. Les souris avec le gènetic deletion dans le gène codant pour IFNAR1 (IFNAR - / - souris) ou STAT1 (Stat1 - / -) a révélé une diminution frappante dans les pDC PP 5. Par conséquent, ces souches fournissent un environnement dans lequel les pDC PP sont réduites, ce qui permet des études de transfert adoptif à effectuer en l&#39;absence de régimes d&#39;ablation de cellules puissants tels que l&#39;irradiation létale. Une résistance supplémentaire de la méthode présentée ici consiste à utiliser du transfert de gène hydrodynamique (HGT) pour stimuler des quantités circulantes élevées de Flt3L. Ceci fournit une approche rentable pour induire Flt3L in vivo, par rapport à l&#39;injection de la protéine recombinante. De nombreuses études, y compris celles de notre laboratoire, ont utilisé HGT pour induire des quantités de cytokines dans une variété de conditions expérimentales 5,12,13. La division du travail et les fonctions immunitaires précises pour les PED est d&#39;un intérêt majeur en immunologie. En particulier, les pDC sont des médiateurs importants de la tolérance orale et systémique anti-viraleréponses, pourtant ils semblent également contribuer au développement et la persistance de l&#39;auto-immunité et le cancer de 14 à 17. Le protocole décrit ici permettra les mécanismes de développement de régulation PP pDCs d&#39;être étudiées plus en détail. En outre, cette approche peut permettre des études pour évaluer la fonction PP pDC, et peut être étendu à la compréhension de la régulation et la fonction des autres populations immunitaires dans les PP.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL</td><td>JAX</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes coniques</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler chirurgicale stérile Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>stériles <td></td><td></td><td></td><td>à petite paire Ciseaux</td></tr><tr><td>stériles à grande paire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; crépine à cellules m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu ; m cellules tubes de capuchon de filtre</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RBC</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> FACS <td>PBS, 2 mM EDTA, 1 % FCS, filtre stérilisé</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089102</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles IgG anti-rat de chèvre</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-048-501</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LD</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-D3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553783</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>553799</tr><tr><td>Rat anti-Ter119</td><td>BD Biosciences</td><td>553671</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 ( PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-4801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-5921</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca-1 (PE. Cy7)</td><td>eBiosciences</td><td>25-5981</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>17-1152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-kit (APC. Cy7)&nbsp ;</td><td>eBiosciences</td><td>47-1171</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL-7R (Bleu Pacifique)</td><td>eBiosciences</td><td>48-1271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flt3 (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-1351</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.1 (APC. Cy7)</td><td>BD Biosciences</td><td>560579</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 (PE. Cy7)</td><td>Biolegend</td><td>109830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-B220 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>25-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-0333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDCA-1 (FITC)</td><td>eBiosciences</td><td>Nov-72</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>, par exemple BD Fortessa</td></tr><tr><td>Lampe</td><td></td><td></td><td></td>chauffante</tr><tr><td>Souris restrictive</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringues</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12 ; Aiguilles G (stériles)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de peyer utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Ce protocole détaille une méthode pour analyser la capacité des progéniteurs hématopoïétiques purifiées pour produire des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans le patch de Peyer intestinale (PP). Progéniteurs des cellules dendritiques communes (CDPS, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) ont été purifiés à partir de la moelle osseuse de souris C57BL6 par FACS et transférés à des souris receveuses qui n&#39;ont pas une population pDC significative en PP, dans ce cas, IFNAR - / - souris ont été utilisés comme les bénéficiaires de transferts. Chez certaines souris, la surexpression du facteur de croissance dendritique des cellules ligand Flt3 (Flt3L) a été appliqué avant le transfert adoptive de lecteurs de disques compacts, en utilisant le transfert de gène hydrodynamique (HGT) de Flt3L plasmide codant. Flt3L surexpression augmente populations de DC provenant de transférés (ou endogènes) progéniteurs hématopoïétiques. À 7-10 jours après le transfert de l&#39;ancêtre, pDCs qui découlent des progéniteurs adoptive transférés ont été distinguées des cellules réceptrices sur labase de l&#39;expression du marqueur CD45, avec pDCs du CDP transférés étant CD45.1 + et les bénéficiaires étant CD45.2 +. La capacité des lecteurs de disques compacts transférés à contribuer à la population pDC en PP et de répondre à Flt3L a été évaluée par cytométrie de flux de PP suspensions de cellules isolées à partir de souris receveuses. Cette méthode peut être utilisée pour tester si d&#39;autres populations de cellules progénitrices sont capables de générer PP pDC. En outre, cette approche pourrait être utilisée pour examiner le rôle des facteurs qui sont prévus pour affecter le développement pDC en PP, en transférant des sous-ensembles de souches avec un effet de choc, coup de grâce ou la surexpression appropriée du facteur et / ou de développement putatif en manipulant cytokines circulantes par HGT . Cette méthode peut également permettre une analyse de la façon dont les pDC PP affectent la fréquence ou la fonction de sous-ensembles d&#39;autres immunitaires en PP. Une caractéristique unique de cette méthode est l&#39;utilisation de IFNAR souris - / -, qui montrent gravement appauvri PP pDC par rapport à des animaux de type sauvage, ainsi allowing reconstitution de PP pDC en l&#39;absence d&#39;effets confondants de l&#39;irradiation mortelle.

Nos résultats démontrent la stratégie de déclenchement pour l&#39;isolement des lecteurs de disques compacts à partir de cellules de moelle osseuse de souris (Figure 1), tel que décrit dans les protocoles 2 et 3. CDPs représentent environ 0,1% des cellules totales de la moelle osseuse, et environ 6.4 x 10 4 CDPs peuvent être isolés à partir de l&#39;une souris. Lors du transfert adoptif, lecteurs de disques compacts se différencient en pDC et CDC 10. <p class="jove_content" fo:...

Ce protocole décrit les procédures expérimentales pour évaluer la différenciation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer de progéniteurs de cellules dendritiques ordinaires, en utilisant des techniques impliquant l&#39;isolement FACS à médiation cellulaire, le transfert de gène hydrodynamique, et l&#39;analyse des flux de sous-ensembles immuns dans les plaques de Peyer.

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

L'objectif général de la procédure suivante est d'examiner la capacité de progéniteurs hématopoïétiques purifiés à donner naissance à des cellules dendritiques plasmocytoïdes dans les plaques de Peyer intestinales après un transfert adoptif. Ceci est réalisé en effectuant d'abord un transfert génique hydrodynamique du plasmide codant pour le facteur de croissance des cellules dendritiques, le ligand FLIT3, chez des souris présentant une déficience en cellules dendritiques plasmocytoïdes dans les plaques de Peyer.Dans la deuxième étape, des cellules progénitrices dendritiques communes sont isolées à partir de moelle osseuse de type sauvage par séparation magnétique à l’aide de billes et tri en flux. Dans la dernière étape, les cellules progénitrices sont transférées de façon adoptive par injection intraveineuse chez des souris présentant un déficit en cellules dendritiques plasmocytoïdes de la plaque de Peyer, après traitement par transfert génique hydrodynamique. Enfin, la population de cellules dendritiques plasmocytoïdes dérivée des cellules progénitrices hématopoïétiques du donneur dans la plaque de Peyer peut être évaluée par cytométrie en flux.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, comme quelle est l'origine développementale des cellules dendritiques plasmacytoïdes Cy D du plasma qui se localisent au sein des plaques piratées. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'origine des cellules dendritiques plasmacytoïdes des plaques pyrénées, elle peut également être utilisée pour comprendre comment les cellules dendritiques plasmacytoïdes influencent les populations de lymphocytes au sein de ces tissus.Deux jours avant le transfert adoptif, dilater les vaisseaux sanguins de cinq souris receveuses CD45.2 positives, déficientes pour le récepteur de l'interféron alpha, sous une lampe chauffante pendant cinq à dix minutes. Ensuite, pour chaque souris, placer l'animal dans un dispositif de contention et désinfecter la queue avec de l'éthanol à 70 %. Puis, utiliser une aiguille de calibre 27 pour injecter cinq microgrammes de plasma et de ligands de revêtement flit trois ainsi que deux millilitres de PBS stérile dans la veine de la queue de chaque animal.Pour le groupe témoin, injecter cinq microgrammes de vecteur vide. Après avoir surveillé les souris pendant 15 à 30 minutes, les ramener à leur lieu d'hébergement. Le jour de l'expérience, placer le fémur et le tibia disséqués provenant de 10 souris C57BL/6 CD45.1 positives congéniques dans une boîte de culture contenant un milieu complet.Insérez ensuite une aiguille de calibre 27 dans une extrémité de chaque os et utilisez le milieu complet pour rincer la moelle osseuse dans la boîte, trois fois par os. Vérifiez que les cellules de la moelle osseuse sont bien éliminées en contrôlant que le milieu expulsé apparaît trouble. Préparez une suspension monocellulaire en pipetant doucement le milieu de haut en bas trois à cinq fois dans la boîte de culture.Ensuite, éliminer les débris en faisant passer les cellules de la moelle osseuse à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres et disperser tout agrégat cellulaire en appliquant doucement l'extrémité du piston d'une seringue stérile sur le tamis. Centrifuger les cellules sur le tamis, éliminer les surnageants et lyser les globules rouges dans deux millilitres de tampon de lyse par quatre à six fois 10 puissance 7 cellules, pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter ensuite 10 millilitres de tampon fax aux cellules de la moelle osseuse et centrifuger pendant quatre minutes à 500 × g à température ambiante.Après avoir aspiré délicatement le surnageant, laver le culot dans 10 millilitres de tampon fax. Ensuite, colorer les cellules avec des anticorps reconnaissant les marqueurs de lignage hématopoïétique selon le protocole de coloration par anticorps et lavage. Incuber les cellules avec des microbilles magnétiques anti-rat de chèvre.Pendant l'incubation avec les microbilles, placez une colonne LD max sur un séparateur cellulaire MIDI max et rincez préalablement la colonne avec deux millilitres de tampon fax. Ensuite, positionnez un tube conique de 15 millilitres sous la colonne et appliquez jusqu'à cinq fois 10 à la puissance 8 cellules dans 2,5 millilitres de tampon fax sur la colonne. Lavez la colonne trois fois avec deux millilitres de tampon fax par lavage, en récupérant les cellules négatives pour la lignée qui traversent la colonne dans le tube de 15 millilitres.Compter les cellules éluées. Ensuite, après avoir marqué les cellules avec les anticorps conjugués à une fluorochrome appropriée, transférer l'échantillon dans un tube de tri pour trier les progéniteurs dendritiques communs en fonction du profil de marqueurs souhaité. Récupérer les cellules purifiées par tri dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu complet, puis à la fin du tri, enregistrer le nombre absolu de cellules triées.Après centrifugation, diluer les cellules à raison d'une fois dix puissance cinq progéniteurs dendritiques communs purifiés par 100 microlitres de volume total de PBS stérile par souris, puis aspirer les suspensions cellulaires dans des seringues munies d'aiguilles de calibre 27. Ensuite, injecter les cellules progénitrices positives pour CD45.1 dans la veine caudale de chaque souris receveuse positive pour CD45.2 et déficiente pour le récepteur de l'interféron alpha, comme vient de l'être démontré, de sept à dix jours après le transfert adoptif. Retirer les intestins des souris ayant reçu une injection de progéniteurs de cellules dendritiques communes en plaçant les tissus sur des essuie-tout imprégnés de PBS.Ensuite, utilisez une paire de pinces fines et de ciseaux pour prélever toutes les plaques de Peyer visibles le long de la paroi de l'intestin grêle. Notez que les plaques de Peyer présentent souvent une structure distincte, même chez une seule souris ; veillez donc à identifier et à disséquer toutes les plaques de Peyer. Lavez les plaques de Peyer isolées trois fois dans une boîte de Pétri contenant du PBS, à l’aide de pinces, afin d’éliminer les matières fécales.Ensuite, digérer les greffons P'S avec un milligramme par millilitre de collagénase IV dans 10 millilitres de HBSS dans un flacon de 50 millilitres sous agitation vigoureuse à 37 degrés Celsius. Après une heure, verser les greffons PIs digérés dans un tamis cellulaire de 40 micromètres et utiliser le piston d'une seringue stérile pour faire passer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire filtrée, resuspendre le culot dans six millilitres de solution 37 % per call et transférer dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, déposez délicatement six millilitres de solution de Percoll à 70 % en dessous pour former un gradient par étape de Percoll. Séparez maintenant les cellules pendant 20 minutes à 800 × g à température ambiante avec frein désactivé. Puis recueillez la population de cellules mononucléées à l'interface.Après avoir mis en pellet les cellules recueillies, lavez-les deux fois dans 50 millilitres de milieu complet. Ensuite, soumettez-les à une coloration avec les anticorps appropriés afin de détecter la zone PYS positive pour le CD 45 1. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes provenant des précurseurs CD 41 positifs transférés de façon adoptive.Analyser les cellules par cytométrie en flux. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes peuvent être identifiées par leur phénotype CD11c positif, ClecH positif, PDCA-1 positif, B220 positif et CD11b négatif. Enfin, déterminer le nombre absolu de cellules dendritiques plasmacytoïdes à l’aide de cette équation.Ces diagrammes en points illustrent la stratégie de sélection pour l'isolement des progéniteurs dendritiques communs. Chez la moelle osseuse de souris, comme vient de l'être montré, les progéniteurs dendritiques communs représentent environ 0,1 % des cellules totales de la moelle osseuse et approximativement quatre à six fois 10 à la puissance 4. Ces cellules peuvent être isolées à partir d'une souris afin d'identifier par cytométrie en flux les cellules dendritiques plasmacytoïdes productrices de type I.Une stratégie initiale de sélection basée sur la diffusion avant et latérale est utilisée, suivie d'une sélection des cellules positives pour CD11c et ClecH. Les souris déficientes pour le récepteur de l'interféron alpha présentent une réduction significative des cellules dendritiques plasmacytoïdes pys patch par rapport aux souris de type sauvage. Les cellules progénitrices dendritiques communes se différencient également en cellules dendritiques conventionnelles.Contrairement aux cellules dendritiques plasmacytoïdes CD11c positives et ClecH négatives, les cellules dendritiques conventionnelles sont observées en quantités similaires chez les souris de type sauvage et chez les souris invalidées. Ainsi, les souris invalidées pour le récepteur de l'interféron alpha offrent la possibilité d'examiner la reconstitution des cellules dendritiques plasmacytoïdes PS patch sans les effets d'une irradiation létale. Le transfert adoptif de progéniteurs dendritiques communs de type sauvage chez des souris invalidées pour le récepteur de l'interféron alpha, comme vient de l'être démontré, stimule une augmentation des cellules dendritiques plasmacytoïdes PIs patch.En outre, un prétraitement par transfert génique hydrodynamique du ligand FL trois améliore davantage l'expansion des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les zones PIS, ce qui suggère que les progéniteurs dendritiques communs transférés ainsi que probablement les progéniteurs endogènes positifs pour FL trois répondent au ligand FL trois en induisant des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les zones PYRUS. Ces deux conditions stimulent également la production de cellules dendritiques conventionnelles positives pour CD 11 C et négatives pour CLEC H, en accord avec l'origine développementale des cellules dendritiques conventionnelles. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes des zones PYS expriment des marqueurs classiques des cellules dendritiques plasmacytoïdes, notamment CLEC H, PDCA un, B deux 20 et LAC CD 11 B. De plus, l'analyse des zones PYS provenant de souris invalidées pour le récepteur de l'interféron alpha ayant reçu à la fois le transfert génique hydrodynamique du ligand FL trois et des progéniteurs dendritiques communs transférés montre qu'environ 70 % des cellules dendritiques plasmacytoïdes proviennent de progéniteurs dendritiques communs donneurs positifs pour CD 45 1.Collectivement, ces données démontrent que le transfert adoptif de progéniteurs dendritiques communs induit la population de cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch PI en réponse à des signaux médiés par le ligand FL trois in vivo. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et d'identifier les cellules D plasmacytoïdes du patch pars.

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Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

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