Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

L’objectif général de la procédure suivante est d’examiner la capacité des progéniteurs hématopoïétiques purifiés à donner naissance à des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de pire intestinale lors du transfert adoptif. Ceci est accompli en effectuant d’abord un transfert de gène hydrodynamique du plasmide, codant pour le facteur de croissance cellulaire dendritique. FLIT trois ligand dans le patch de PI plasmacytoïde cellule dendritique souris altérées.

Dans la deuxième étape, les cellules progénitrices dendritiques communes sont isolées de la moelle osseuse de type sauvage par séparation magnétique des billes et tri par flux. Dans la dernière étape, les cellules progénitrices sont transférées adoptivement par injection intraveineuse dans des souris atteintes de cellules dendritiques plasmacytoïdes de bûchers qui ont été traitées par transfert de gènes hydrodynamiques. En fin de compte, la population de cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch de PI dérivée de la cellule progénitrice hématopoïétique du donneur peut être évaluée par cytométrie en flux.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que l’origine développementale des cellules plasmatiques Cy Dendri qui se localisent dans les patchs pirates. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’origine des cellules dendritiques plasmacytoïdes du champ de bûcher. Il peut également être appliqué à la compréhension de la façon dont les cellules dendritiques plasmacytoïdes affectent les populations de lymphocytes au sein de ces tissus.

Deux jours avant le transfert adoptif, dilatez les vaisseaux sanguins de cinq souris réceptrices du récepteur de l’interféron alpha positif CD 45 2 sous une lampe chauffante pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, pour chaque souris, placez l’animal dans une contention et désinfectez la queue avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 27, injectez cinq microgrammes de plasma et de papier d’enrobage trois ligands et deux millilitres de PBS stérile dans la veine de la queue de chaque animal.

Pour la cohorte témoin, injecter cinq microgrammes de vecteur vide. Après avoir surveillé les souris pendant 15 à 30 minutes, renvoyez-les à leur logement. Le jour de l’expérience, placez le fémur et le tibia disséqués de 10 souris congéniques CD 45 1 positif C 57 noir six souris dans une boîte de culture contenant un milieu complet.

Insérez ensuite une aiguille de calibre 27 dans une extrémité de chaque os et utilisez un milieu complet pour rincer la moelle osseuse dans le plat trois fois par os. Assurez-vous que les cellules de la moelle osseuse sont retirées en confirmant que le milieu expulsé semble trouble. Préparez une suspension unicellulaire en pipetant doucement le milieu de haut en bas trois à cinq fois dans la boîte de culture.

Ensuite, retirez les débris en passant les cellules de la moelle osseuse à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres et perturbez les amas de cellules en appliquant doucement l’extrémité d’un piston de seringue stérile. Sur la passoire, faites tourner les cellules, éliminez les surnageants et les poux des globules rouges dans deux millilitres de tampon de lyse par quatre à six fois 10 à la septième cellule pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon de télécopie aux cellules de la moelle osseuse et tournez pendant quatre minutes à 500 fois G à température ambiante.

Après avoir aspiré doucement le supnatin, lavez la pastille dans 10 millilitres de tampon de télécopie. Ensuite, colorez les cellules avec un marqueur de lignée hématopoïétique reconnaissant les anticorps après la coloration et le lavage des anticorps. Incuber les cellules avec des microbilles magnétiques anti rat de chèvre.

Pendant l’incubation des microbilles, chargez une colonne de LD max sur un séparateur de cellules MIDI max et pré-rincez la colonne avec deux millilitres de tampon de télécopie. Placez ensuite un tube conique de 15 millilitres sous la colonne et chargez jusqu’à cinq fois 10 à la huitième cellule dans 2,5 millilitres de tampon de télécopie sur la colonne. Lavez la colonne trois fois avec deux millilitres de tampon de télécopie par lavage, en recueillant les cellules négatives de lignée qui traversent la colonne dans le tube de 15 millilitres.

Comptez les cellules éludées. Ensuite, après avoir coloré les cellules avec les anticorps conjugués fluorescents appropriés, transférez l’échantillon dans un tube de fax pour trier les progéniteurs dendritiques courants sur la base du profil de marqueur souhaité. Collectez les cellules purifiées du fax dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de support complet, puis à la fin du cycle de télécopie, notez le nombre absolu de cellules triées.

Après avoir tourné, les cellules diluent une fois 10 à un cinquième des progéniteurs dendritiques communs purifiés pour 100 microlitres de volume total de PBS stérile par souris et aspirent les suspensions cellulaires dans une seringue équipée d’aiguilles de calibre 27. Ensuite, injectez les cellules progénitrices CD45 1 positives dans la veine de la queue de chaque souris receveuse receveuse du récepteur de l’interféron alpha CD-45 2 positif, comme cela vient d’être démontré, sept à 10 jours après le transfert adoptif. Retirez les intestins des souris injectées dans les cellules dendritiques communes, en plaçant les tissus sur des serviettes en papier imbibées de PBS.

Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces fines et de ciseaux, rassemblez toutes les taches de bûchers visibles le long de la paroi de l’intestin grêle. Notez que les taches de bûcher sont souvent structurellement distinctes, même au sein d’une seule souris, alors assurez-vous que toutes les taches P sont identifiées et disséquées. Lavez les patchs P’S isolés trois fois dans une boîte de Pétri contenant du PBS à l’aide d’une pince pour retirer les matières fécales.

Ensuite, digérez les patchs P’S avec un milligramme par millilitre, de la collagénase quatre dans 10 millilitres de HBSS dans une fiole de 50 millilitres en agitant vigoureusement à 37 degrés Celsius. Au bout d’une heure, versez les patchs d’IP digérés dans une passoire à cellules de 40 micromètres et utilisez un piston de seringue stérile pour forcer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir fait tourner la suspension cellulaire filtrée, remettez la pastille en suspension dans six millilitres de solution à 37 % par appel et transférez-la dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, placez doucement six millilitres de solution à 70 % par appel en dessous pour former un gradient de pas par appel. Maintenant, séparez les cellules pendant 20 minutes à 800 fois G à température ambiante avec la pause. Collectez ensuite la population de cellules mononucléées à l’interface.

Après avoir granulé les cellules collectées, lavez-les deux fois dans 50 millilitres de milieu complet. Ensuite, colorez-les avec les anticorps appropriés pour détecter le patch PYS positif au CD 45 1. Cellules dendritiques plasmacytoïdes dérivées des progéniteurs positifs de CD 41 transférés par adoption.

Analysez les cellules par cytométrie en flux. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes peuvent être identifiées par leur phénotype CD 11 C positif, clec H positif, PDCA positif un B positif, deux 20 positifs CD 11 B négatif. Enfin, déterminez le nombre absolu de cellules dendritiques plasmacytoïdes à l’aide de cette équation.

Ces diagrammes à points indiquent la stratégie de déclenchement pour l’isolement des progéniteurs dendritiques communs. Pour les cellules de moelle osseuse de souris, comme nous venons de le démontrer, les progéniteurs dendritiques communs représentent environ 0,1 % du total des cellules de la moelle osseuse et environ quatre à six fois 10 à la quatrième. De ces cellules peuvent être isolées à partir d’une souris pour identifier le patch de cellules dendritiques plasmacytoïdes de PI par cytométrie en flux.

Une stratégie initiale de déclenchement vers l’avant et de diffusion latérale est utilisée, suivie d’une stratégie de déclenchement pour les cellules CD 11 C positives clec H. Les souris knock-out du récepteur de l’interféron alpha présentent une réduction significative des cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch pys par rapport aux souris de type sauvage. Les cellules progénitrices dendritiques courantes se différencient également en cellules dendritiques conventionnelles.

Contrairement aux cellules dendritiques plasmacytoïdes, les cellules dendritiques CD, 11 C positives, clec H, les cellules dendritiques conventionnelles négatives sont observées en quantités similaires chez les souris de type sauvage et knock-out. Par conséquent, les souris knock-out du récepteur de l’interféron alpha offrent la possibilité d’examiner la reconstitution des cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch PS sans les effets de l’irradiation létale. Le transfert adoptif de progéniteurs dendritiques communs de type sauvage dans des souris knock-out du récepteur de l’interféron alpha, comme cela vient d’être démontré, stimule une augmentation des cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch PI.

De plus, le prétraitement avec le transfert de gènes hydrodynamiques à trois ligands FL améliore encore l’expansion des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les patchs PIs, ce qui implique que les progéniteurs dendritiques communs transférés et éventuellement les progéniteurs positifs endogènes FL trois répondent au ligand FL trois en induisant des cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch FLUS. Les deux conditions stimulent également la production de cellules dendritiques conventionnelles CD 11 C positives, clec H négative, ce qui correspond à l’origine développementale des cellules dendritiques conventionnelles. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch PYS ont exprimé des marqueurs de cellules dendritiques plasmacytoïdes traditionnels, y compris clec H, PDCA un et B deux 20 et LAC CD 11 B.In outre, l’analyse des patchs PYS de souris knock-out du récepteur de l’interféron alpha qui reçoivent à la fois le transfert de gènes hydrodynamiques à trois ligands FL et les progéniteurs dendritiques communs transférés montre qu’environ 70 % des cellules dendritiques plasmacytoïdes sont dérivées de progéniteurs dendritiques communs positifs au CD 45 1 du donneur.

Collectivement, ces données démontrent que le transfert adoptif de progéniteurs dendritiques communs induit la population de cellules dendritiques plasmacytoïdes du patch PI en réponse à des signaux médiés par trois ligands FL in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’identifier les cellules plasmacytoïdes D pars patch.