Name: Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez l'imagerie confocale 4D pour étudier la morphogenèse craniofaciale chez Danio rerio. Cette méthode permet d'observer en temps réel les mouvements des arcs pharyngés et de comparer les embryons sauvages et mutants.

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Nous remercions Melissa Griffin et Jenna Rozacky pour leurs soins de poissons d&#39;experts. PDM grâce EGN pour aide à la rédaction, la générosité et la patience. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR R01DE020884 à JKE.

Une. Elevage et Mutant allèles <ol><li> Élever du poisson zèbre comme décrit 21. </li><li> Allèles mutants de poisson zèbre utilisés dans cette étude étaient PDGFRA b1059 16, B1100 Smad5 22, et SMO b577 23. Sources de ces souches de poisson zèbre comprennent ZIRC. </li></ol> 2. Préparation des solutions et met en œuvre Remarque: Toutes les solutions et les outils peuvent être faites à l&#39;avance et stockés pour une utilisation future. <ol><li> Sensibiliser les médias de l&#39;embryon (EM) comme décrit précédemment 21. </li><li> Faire 4 g / L MS-222 (Tricaine). Dissoudre 4 g de phosphate disodique (Na 2 HPO 4) dans 450 ml d&#39;eau stérile. Ajouter 2 g de MS-222 à la solution. Ajuster le pH à l&#39;intérieur de 7,0 à 7,2. Ajouter de l&#39;eau stérile pour obtenir un volume total de 500 ml. </li><li> Facultatif: Faire 4 g / L d&#39;huile de clou de girofle. Peser 0,2 g de l&#39;huile de girofle pure dans un tube conique de 50 ml. Ajouter EM pour un volume total de 50 ml. Stocker à 4 ° C. </li><li> Faire 3% methylcellulose. Apportez 50 ml de EM + 0,1 M HEPES à ébullition. Retirer du feu. Incorporer 1,5 g méthylcellulose jusqu&#39;à ce que la solution est homogène. Stocker à 4 ° C. </li><li> Faire 0,2% d&#39;agarose. Ajouter 0,1 g d&#39;agarose à 50 ml EM. EM apporter à ébullition dans le four micro-ondes ou sur une plaque chauffante et de vérifier que l&#39;agarose soit dissous. Aliquote dans 500 volumes ul dans des microtubes et conserver à 4 ° C. Remarque: Les volumes peuvent être ajustés au besoin. </li><li> Assurez-pokers capillaires. Déposer une goutte de super glue intérieur d&#39;un tube capillaire 0,9 mm d&#39;identité. Insérez une longueur de 4-5 cm de 6 ligne de pêche monofilament de livres test à l&#39;intérieur du tube capillaire de telle sorte que d&#39;environ 3-4 mm de la ligne s&#39;étend au-delà de la fin du tube. </li><li> Faire deux lamelles pontés par spécimen. Super-colle 22 x 22-1 couvercle verre à chaque extrémité d&#39;un couvercle en verre 24 x 60-1 quitter le milieu libre. Faire simple (1 petit verre de couverture par la fin) pour les embryons de moins d&#39;un jour vieux, double (deux petits verres de couverture sur le dessus de l&#39;autre par la fin) pour les embryons de une à quatre days vieux, ou triples (3 petits verres de couverture sur le dessus de l&#39;autre par la fin) pour les embryons de cinq jours ou plus âgés. </li><li> Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé. Remarque: de la graisse à vide sert de matériau d&#39;étanchéité pour prévenir la déshydratation des échantillons sur de longues périodes de temps, et a une faible toxicité potentielle par rapport à des produits d&#39;étanchéité plus volatils. </li></ol> 3. Montage embryons de poisson zèbre pour la microscopie confocale (voir la figure 1) <ol><li> Préparer milieu anesthésique. Faire fondre une aliquote de 0,2% d&#39;agarose par micro-ondes dans toutes les 20 secondes jusqu&#39;à ce que complètement liquide. Mélanger 8 pi de MS-222 dans 192 ul de 0,2% d&#39;agarose ou de 5 pi de 4 g / L de l&#39;essence de girofle dans 195 ul de 0,2% d&#39;agarose. Maintenir dans un bloc de chauffage à 42 ° C. Remarque: Une longue exposition au MS-222 provoque des retards de développement plus fort que l&#39;huile de clou de girofle fait chez le poisson zèbre embryonnaire 24. </li><li> Si nécessaire: dechorionate manuellement embryons transgéniques non éclos à analyser juste avant l&#39;analyse. En utilisant des pinces, lentement tear le chorion ouvert jusqu&#39;à l&#39;embryon est libéré. </li><li> Anesthésier les embryons de poisson zèbre. Ajouter 1 ml d&#39;une 4 g / L stock de MS-222 24 ml de médias de l&#39;embryon. Sinon, ajouter 390 ul de 4 g / L d&#39;huile de clou de girofle pour 24 ml d&#39;eau du poisson 24. Remarque: les actes de l&#39;huile de girofle lentement pour effectuer cette étape au moins 15-20 minutes avant la microscopie time-lapse. </li><li> Placer un cordon de graisse à vide autour de l&#39;espace central d&#39;une lamelle couvre-ponté orientée vers le haut. Pousser lentement la graisse à vide hors de la seringue, ce qui rend, d&#39;un cordon lisse continue qui est adjacent à et à l&#39;intérieur des ponts et le bord de la lamelle. </li><li> Etaler un cercle de 4% de méthylcellulose dans le milieu de la lamelle couvre-objet en utilisant un applicateur à pont en bois. </li><li> Transférer l&#39;embryon à imager. Lorsque l&#39;embryon est anesthésié tirer vers le haut dans une pipette en verre. Maintenir la pipette à la verticale afin de permettre à l&#39;embryon de couler au fond du liquide dans la pipette. Déplacer la pipette dans la solution d&#39;agarose et permettre à l&#39;embryon de tomberdans l&#39;agarose. Ne pas expulser le liquide. </li><li> Placer l&#39;échantillon. Dessiner une partie de la solution d&#39;agarose et l&#39;embryon dans la pipette. Expulser l&#39;embryon dans une goutte de solution d&#39;agarose sur le dessus de la méthylcellulose. Utilisez un tisonnier capillaire pour pousser l&#39;embryon à la baisse sur la méthylcellulose et orienter l&#39;embryon comme on le souhaite pour l&#39;imagerie. </li><li> Sceller l&#39;échantillon. <ol><li> Placez une lamelle pont au-dessus d&#39;une montée, vers le bas. Appliquer une pression uniforme sur les deux côtés des lamelles en sandwich jusqu&#39;à ce que les ponts sont en contact direct et les joints d&#39;abandon agarose à deux lamelles. Vérifiez que l&#39;embryon est correctement orienté. </li><li> Frottez un applicateur en bois le long de la vitre pour lisser les fissures et les lacunes dans le bourrelet de graisse à vide. Essuyez l&#39;excès de graisse à partir des bords. </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse imagerie confocale de poisson zèbre transgénique embryons (Ce protocole a été optimisé pour un Zeiss LSM 710 microscope confocal nousment logiciel d&#39;imagerie ZEN, et peuvent être modifiés pour être utilisés avec d&#39;autres systèmes.) <ol><li> Activer équipement. Allumez le microscope confocal et des dispositifs laser externes. Allumer l&#39;ordinateur connecté au microscope confocal. Logiciel d&#39;imagerie confocale Open et sélectionnez &quot;Système Start&quot; pour activer les commandes d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Préparer stade chauffé. Abaissez la plate-forme de mise en scène du microscope confocal et déplacer les lentilles de l&#39;objectif hors de position. Remplacer la scène par défaut avec une scène électronique chauffée. Allumez le contrôleur de la platine chauffante et régler la température de 29,5 ° C. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans le champ de vision. Placer l&#39;échantillon montés sur la scène. Déplacez la lentille de l&#39;objectif 20X en position et soulever la plate-forme de mise en scène. Activer l&#39;émetteur de lumière visible et de regarder à travers les oculaires. Centrer la tête de l&#39;embryon dans le champ de vision. </li><li> Définir les paramètres du test. <ol><li> Activer les canaux de fluorescence en sélectionnantla longueur d&#39;onde de fluorescence à détecter et choisissez tables des couleurs (LUT) pour chaque canal. Si nécessaire, utiliser les commandes manuelles dans le logiciel pour activer les lasers nécessaires (par exemple 561 nm pour DP). Pour chaque canal de fluorescence, réglez l&#39;intensité du laser à 10,0 et la tension photomultiplicateur (HV ou le gain) entre 600-700. Réglez le calcul de la moyenne de quatre et la profondeur de bits à 16 bits. </li><li> Activer les modules de la série Z-stack et time. Réglez le trou pour un Z-résolution 5 pm ou moins, et définir le Z-intervalle à la distance optimale suggéré. Remarque: En général, 5 um Z-résolution permet chaque image Z-stack à collecter assez rapidement pour un «instantané» de l&#39;embryon à un point de temps particulier, tout en la résolution des cellules individuelles. L&#39;abaissement de la moyenne réduit également la quantité de temps par image. </li><li> Définir l&#39;intervalle de temps désiré entre les images (généralement 10 à 20 mn) et la durée totale de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Définir positioninformation. <ol><li> Mettez l&#39;appareil photo en mode direct. Réglez la mise et augmenter l&#39;intensité laser si nécessaire pour voir fluorescence. Réglez le zoom numérique à 0,6 pour une vue plus large, si désiré. </li><li> Placez la scène de telle sorte que toutes les structures d&#39;intérêt sont visibles et il ya de la place dans le champ de vision pour le dos prolongement et en avant. Concentrer l&#39;embryon à travers les limites supérieure et inférieure de la fluorescence. Définissez les première et dernière positions Z-stack tranche d&#39;au moins 100 um ou plus au-delà de ces limites. </li></ol></li><li> Optimiser l&#39;intensité de la fluorescence. <ol><li> Réglez le LUT d&#39;affichage à aller indicateur. Structures fluorescentes doivent maintenant apparaissent en blanc, et le reste du champ de vision doivent être bleues (pas de détection) ou noir. </li><li> Augmenter HT / le gain à un niveau juste en dessous saturé (rouge) pixels apparaissent. Si nécessaire, régler le décalage si une majorité de l&#39;arrière-plan n&#39;est pas détecté (bleu). Remarque: diamètre du trou microscopique petit et augmentation de l&#39;intensité du laser à la fois d&#39;améliorer l&#39;image defnition, mais intensité du laser doit être faible pour préserver les tissus vivants. Augmentation HT / gain et diamètre du trou microscopique (&lt;5 um) sont généralement préférable d&#39;augmentation de l&#39;intensité du laser. </li><li> Gardez le diamètre de trou d&#39;épingle assez large pour recueillir des images en temps opportun, la moyenne des jeux à 4. Le Z-intervalle doit toujours être réglé à la distance optimale suggérée pour le diamètre de trou d&#39;épingle. Effectuer des analyses de courte durée (moyenne = 1) avec des paramètres différents, et d&#39;utiliser l&#39;intensité du laser minimum qui permet d&#39;atteindre la résolution désirée. </li></ol></li><li> Exécutez l&#39;expérience pour la durée souhaitée. Ensuite, retirez embryon du stade chauffée et séparer lentement les lamelles. Immerger la lamelle et l&#39;embryon dans EM dans une boîte de Pétri de 30 mm. En utilisant une pipette en verre laver doucement l&#39;embryon hors de la lamelle et enlever la lamelle de la boîte de Pétri. Placez l&#39;embryon dans un incubateur à 28,5 ° C pour continuer à se développer. </li><li> Comparer la croissance. A la fin de l&#39;expérience, prendre individu Zsimages de selleries d&#39;embryons de frères agarose monté qui ont été mis en scène de manière similaire à l&#39;échantillon au début de l&#39;expérience, mais ont été soulevées dans EM dans un incubateur à 28,5 ° C. </li><li> Mesurer arcs pharyngiens, au besoin. Les mesures peuvent être effectuées dans certaines suites logicielles confocale. Mesures trouvés ici ont été réalisées à l&#39;aide Fiji25 par l&#39;importation et Z saillie fichiers. LSM de cadres individuels. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Time-lapse microscopie confocale est un outil puissant pour l&#39;analyse du développement. Ici, nous démontrons l&#39;utilité de la méthode dans l&#39;étude de la morphogenèse arc branchial chez le poisson zèbre qui sont mutantes pour voies de signalisation importantes en utilisant un transgéniques qui marque les cellules de la crête neurale. En plus du niveau des tissus analyses, des analyses de déchéance de temps sont également applicables à des analyses à l&#39;échelle cellulaire 28. De nombreuses méthode...

Morphogenèse craniofaciale est un processus multi-étapes complexe qui nécessite des interactions coordonnées entre plusieurs types de cellules. La majorité du squelette cranio-facial est dérivé de cellules de la crête neurale, dont beaucoup doivent migrer du tube neural dorsal dans des structures appelées transitoires arcs branchiaux 1. Comme avec de nombreux tissus, la morphogenèse du squelette cranio-facial est plus complexe que ce qui peut être compris par des images statiques d&#39;embryons à des points spécifiques de temps de développement. Bien que cela prend beaucoup de temps pour réaliser, in vivo microscopie time-lapse donnent un aspect continu à des cellules et des tissus d&#39;un embryon en développement. Chaque image dans une série time-lapse prête contexte aux autres, et permet un mouvement d&#39;enquêteur vers déduire pourquoi un phénomène se produit plutôt que de déduire ce qui se passe à ce moment-là. L&#39;imagerie in vivo est donc un outil descriptif puissant pour des approches expérimentales dedéconstruire les voies qui guident la morphogenèse. Le Danio rerio est un modèle génétique populaire du développement embryonnaire des vertébrés, et est particulièrement bien adapté pour l&#39;imagerie in vivo de la morphogenèse. Moderne, des méthodes pratiques pour la transgenèse et la modification génomique sont progressent rapidement le nombre d&#39;outils disponibles pour les chercheurs de poisson zèbre. Ces outils améliorent les méthodes déjà robustes pour la manipulation génétique et la microscopie. L&#39;imagerie in vivo de presque n&#39;importe quel tissu dans presque n&#39;importe quel contexte génétique désiré est plus proche de la réalité que l&#39;imagination. Mouvements morphogénétiques des arcs branchiaux sont guidés par les interactions entre la crête neurale et l&#39;épithélium adjacent, à la fois l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme de signalisation. Il existe de nombreuses molécules de signalisation exprimés par l&#39;épithélium qui sont nécessaires pour conduire la morphogenèse des éléments du squelette cranio-faciales. Parmi ces molécules de signalisation, Sonic Hedgehog (Shh) est d&#39;une importance cruciale fou développement cranio-facial 2-8. Shh est exprimé à la fois par l&#39;ectoderme bouche et du pharynx endoderme 2,6,9,10. L&#39;expression de Shh dans l&#39;endoderme régule les mouvements morphogénétiques des arceaux 10, la structuration de la crête neurale dans les arches 10, et la croissance du squelette cranio-facial 11. Signalisation BMP est également d&#39;une importance cruciale pour le développement cranio-facial 12 et peut modifier la morphogenèse des arcs branchiaux. Signalisation de la Bmp régule dorsale / ventrale structuration de crête dans les arcs branchiaux 13,14. Perturbation des Smad5 chez le poisson zèbre provoque des malformations graves palatines et un échec des cartilages de Meckel à fusionner de manière appropriée à la ligne médiane 15. En outre, les mutants présentent également des réductions et de la fusion des éléments du cartilage ventrale, avec le 2 ème, 3 ème et 4 ème éléments parfois pharyngée arc soudés à la ligne médiane 15. Ces fusions suggèrent fortement que la signalisation BMP dirige la morphogenèse de ces éléments du pharynx. Signalisation PDGF est nécessaire pour le développement cranio-facial, mais a des rôles inconnus en arc branchial morphogenèse. La souris et le poisson zèbre ont mutants PDGFRA profonde clefting midfacial 16-18. Au moins chez le poisson zèbre ce clefting midfacial est due à un échec de la migration des cellules de la crête neurale bon 16. Cellules de la crête neurale continuent d&#39;exprimer PDGFRA après qu&#39;ils ont pénétré dans les arcs branchiaux. En outre, les ligands de PDGF sont exprimés par l&#39;épithélium du visage et dans les arcs branchiaux 16,19,20, ainsi signalisation Pdgf pourraient également jouer un rôle dans la morphogenèse des arcs pharyngiens après la migration. Toutefois, les analyses de la morphogenèse des arcs pharyngiens dans des mutants de PDGFRA n&#39;ont pas été effectuées. Ici, nous démontrons dans la microscopie confocale in vivo de pharyngulune étape de poisson zèbre transgénique et décrire la morphogenèse des arcs pharyngiens dans ce délai. Nous démontrons en outre les comportements de tissus qui sont touchés par des mutations qui perturbent le BMP, le PDGF, et les voies de signalisation de Shh.

<table><tbody><tr><td>6 lb Ligne monofilament d’essai</td><td>Cortland Line Company</td><td>SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>Laser à argon</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire, 100 mm, 0,9 mm ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>Huile de clou de girofle</td><td>Hilltech Canada, Inc.</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide poussé</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à bain sec Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à balayage laser</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope, 24 x 60-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre utilisation de 4d microscopie confocale

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Imagerie time-lapse est une technique qui permet l&#39;observation directe du processus de morphogenèse, ou la génération de forme. En raison de leur clarté optique et la susceptibilité à la manipulation génétique, la embryon de poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire avec laquelle effectuer l&#39;analyse time-lapse de la morphogenèse des embryons vivants. L&#39;imagerie confocale d&#39;un embryon de poisson zèbre direct requiert qu&#39;un tissu d&#39;intérêt est constamment marqué avec un marqueur fluorescent, comme un transgène ou d&#39;un colorant injecté. Le processus exige que l&#39;embryon est anesthésié et maintenu en place de manière à ce que le développement sain se déroule normalement. Paramètres pour l&#39;imagerie doivent être définis pour tenir compte de la croissance en trois dimensions et à concilier les exigences de la résolution des cellules individuelles tout en obtenant des clichés de développement. Nos résultats démontrent la possibilité d&#39;effectuer à long terme dans l&#39;imagerie in vivo d&#39;embryons de poisson zèbre de marquées par fluorescence et de détecter des comportements de tissus variés dansla crête neurale crânienne qui causent des anomalies cranio-faciales. Les retards de développement causés par l&#39;anesthésie et le montage sont minimes, et les embryons sont sains et saufs par le processus. Embryons Time-lapse imagées peuvent être retournés pour un milieu liquide et ensuite imagés ou fixés à des points plus tard dans le développement. Avec une abondance croissante des lignes de poisson zèbre transgénique et cartographie sort bien caractérisé et techniques de transplantation, imagerie n&#39;importe quel tissu désiré est possible. En tant que tel, time-lapse imagerie in vivo combine puissamment avec des méthodes génétiques de poisson zèbre, y compris les analyses des embryons mutants et micro-injection.

Chez les embryons de type sauvage, à la suite de neurones population de crête, les arcs pharyngiens allongés le long des antérieure / postérieure et dorsale / ventrale axes tout en se déplaçant dans une direction rostrale (Film 1). 30 heures après la fécondation (HPF), la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien est comprise entre 1.8 à 1.9 fois sa dorsale / ventrale hauteur. Dorsale / ventrale allongement procède régulièrement, plus rapide que l&#39;extension antérieure / postérieure...

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer et de caractériser les mouvements des arcs pharyngiens dans la tête du poisson zèbre en développement. Cela est réalisé en premier lieu en incorporant un embryon de poisson zèbre transgénique dans un gel d'agarose contenant un anesthésique. La deuxième étape consiste à monter l'embryon inclus dans l'agarose dans une goutte de méthylcellulose sur une lame de microscope.Ensuite, l'embryon est scellé entre deux lames de microscope à l'aide de graisse à vide. Enfin, la microscopie confocale en temps réel est utilisée pour mettre en évidence les différences entre les poissons zèbres de type sauvage et mutants ainsi que les mouvements morphogénétiques des arcs pharyngés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes d'imagerie statiques est qu'elle permet de suivre en temps réel le développement des arcs pharyngés, offrant ainsi à l'expérimentateur la possibilité d'observer directement les mouvements tissulaires essentiels à la morphogenèse.Pour fabriquer un couvre-objet à pont, fixez avec de la colle cyanoacrylate un couvre-objet de 22 par 22 sur chaque extrémité d’un couvre-objet de 24 par 60, en laissant le milie

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Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l'imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

Visualisation des données expérimentales est devenu un élément clé dans la présentation des résultats à la communauté scientifique. Génération de direct enregistrement time-lapse d'embryons croissance contribue à une meilleure présentation et la compréhension des processus de développement complexes. Ce protocole est un guide pour le marquage des cellules par l'intermédiaire de photoconversion de la protéine chez le poisson zèbre kaede étape par étape.

Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l&#39;aide Time-lapse de microscopie confocale

L'organisation des cellules des os cranio-faciales a longtemps été supposé, mais jamais directement visualisées. Marquage des cellules multi-spectrale et en Live in vivo   imagerie permet de visualiser le comportement des cellules dynamique dans la mâchoire inférieure du poisson zèbre. Ici, nous détaillons le protocole de manipuler Zebrabow poissons transgéniques et observons directement intercalation de cellules et les changements morphologiques des chondrocytes dans le cartilage de Meckel.

Visualisation des chondrocytes intercalation et directionnel prolifération clonale via Zebrabow analyse cellulaire dans le cartilage de l&#39;embryonnaire Meckel

Ici, nous présentons une méthode de montage polyvalente qui permet l’imagerie à long terme en accéléré du développement postérieur du corps d’embryons de poisson-zèbre vivants sans perturber le développement normal.

Une méthode de montage polyvalent pour l&#39;imagerie à long terme du développement Zebrafish

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Le protocole décrit ici présente une procédure simple et facile à suivre pour colorer et disséquer les cartilages craniofaciaux d’une larve de poisson-zèbre âgée de 5 jours. Il peut être utilisé pour étudier l’anatomie, la forme et la taille de ces structures dans diverses conditions de développement.

Dissection des tissus craniofaciaux du poisson-zèbre lors de la coloration au bleu d’Alcian

Ce travail décrit un protocole pour quantifier la forme du cartilage craniofacial à l’aide de logiciels libres (tpsDigs2, MorphoJ et PAST) pour mesurer les changements de structure faciale chez les larves de poisson-zèbre.

Analyses morphométriques de la forme : la boîte à outils logicielle d’analyse pour la quantification de la forme craniofaciale chez le poisson-zèbre

Découvrez l'imagerie confocale 4D pour étudier la morphogenèse craniofaciale chez Danio rerio. Cette méthode permet d'observer en temps réel les mouvements des arcs pharyngés et de comparer les embryons sauvages et mutants.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

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