Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

L’objectif général de cette procédure est d’observer et de caractériser les mouvements de l’arc pharyngé dans la tête du poisson zèbre en développement. Ceci est accompli en intégrant d’abord un embryon de poisson zèbre transgénique dans un gel anesthésique. La deuxième étape consiste à monter l’embryon incrusté dans l’agarose dans une goutte de méthylcellulose sur une lame de microscope.

Ensuite, l’embryon est scellé entre deux lames de microscope avec de la graisse sous vide. En fin de compte, la microscopie confocale time-lapse est utilisée pour montrer les différences entre le poisson zèbre de type sauvage et le poisson zèbre mutant et les mouvements morphogénétiques des arcs pharyngés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes d’imagerie statique est qu’elle capture le développement de l’arc pharyngé en temps réel, ce qui permet à un chercheur d’observer directement les mouvements tissulaires qui sont essentiels à la morphogenèse.

Pour faire une lamelle de recouvrement pontée, appliquez de la super colle, un verre de couverture de 22 par 22 à chaque extrémité d’un verre de couverture de 24 par 60. Laisser le milieu libre. Faites des singles pour les embryons de moins d’un jour.

Double pour les embryons âgés d’un à quatre jours ou triple pour les embryons de cinq jours ou plus. Et pour chaque spécimen, utilisez deux lamelles pontées. Remplissez maintenant une seringue de 10 millilitres de graisse sous vide poussé.

Préparez un anesthésique frais dans des aros liquides à 0,2 % et maintenez-le dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius. Pour décomposer manuellement les embryons transgéniques non éclos, déchirez lentement le Corian jusqu’à ce que l’embryon soit libéré. Transférez maintenant les embryons enrobés dans un milieu propre contenant MS 2 22 et esthétique.

Pour préparer une lamelle pontée, poussez lentement la graisse sous vide hors de la seringue, en formant un cordon continu lisse qui se trouve à côté et à l’intérieur des ponts et du bord de la lamelle. Étalez un cercle de 4 % de méthylcellulose au milieu du pont pour couvrir le glissement. Lorsque l’embryon est anesthésié, aspirez-le dans une pipette en verre.

Tenez la pipette verticalement pour permettre à l’embryon de couler au fond du liquide dans la pipette. Ensuite, déplacez la pipette dans la solution agricole et laissez l’embryon tomber dans l’aros sans expulser le liquide. Aspirez un peu de solution agricole et l’embryon dans la pipette.

Expulsez ensuite l’embryon dans une goutte de solution aro. Sur le dessus de la méthylcellulose. Poussez l’embryon vers le bas sur la méthylcellulose et orientez l’embryon comme vous le souhaitez pour l’imagerie afin de sceller l’échantillon.

Placez une lamelle de recouvrement pontée sur celle montée vers le bas. Appliquez une pression uniforme des deux côtés des lamelles de recouvrement prises en sandwich jusqu’à ce que les ponts entrent en contact direct et que l’agros drop se scelle sur les deux lamelles. Vérifiez que l’embryon est correctement orienté.

Frottez un applicateur en bois le long du verre pour lisser les fissures et les espaces dans la vitesse de la graisse sous vide. Essuyez tout excès de graisse sur les bords. Activez le microscope confocal et tout appareil laser externe.

Allumez également l’ordinateur connecté au microscope confocal et sélectionnez Démarrer le système et le logiciel d’imagerie confocale. Ensuite, abaissez la plate-forme de mise en scène du microscope confocal et déplacez les lentilles de l’objectif hors de leur position. Remplacez l’étage par défaut par un étage chauffé électroniquement.

Allumez le contrôleur de l’étape chauffée et réglez la température sur 29.5 degrés Celsius. Placez l’échantillon monté sur la platine chauffée. Déplacez l’objectif 20x en position et soulevez la plate-forme de mise en scène.

Activez ensuite l’émetteur de lumière visible et centrez la tête de l’embryon dans le champ de vision. Pour activer les canaux de fluorescence, sélectionnez la longueur d’onde fluorescente à détecter et choisissez des tables de correspondance de couleurs pour chaque canal. Pour chaque canal de fluorescence, réglez l’intensité du laser sur 10,0 et la tension du photomultiplicateur entre 600 et 700.

Pour réduire l’arrière-plan et augmenter les informations fluorescentes collectées, réglez la moyenne sur deux ou quatre et la profondeur de bits sur 16 bits. Activez les modules de pile ZS et de séries chronologiques. Ajustez le sténopé si nécessaire.

Définissez l’intervalle de temps et la durée de l’expérience. Mettez l’appareil photo en mode direct. Ajustez la mise au point et augmentez l’intensité du laser si nécessaire.

Pour voir la fluorescence. Réglez le zoom numérique sur 0,6 pour une vue plus large. Si vous le souhaitez.

Positionnez la scène de manière à ce que toutes les structures d’intérêt soient visibles et qu’il y ait de la place dans le champ de vision pour la croissance. Focalisation dorsale et antérieure à travers l’embryon jusqu’aux limites supérieure et inférieure de la fluorescence. Réglez la première et la dernière position de la tranche Zack à au moins 100 micromètres ou plus au-delà de ces limites.

Ensuite, réglez la table de correspondance de l’affichage sur les indicateurs de portée afin que les structures fluorescentes apparaissent d’une nuance de gris et que le reste du champ soit bleu ou noir. Si nécessaire, augmentez la tension du multiplicateur de photo à un niveau juste en dessous de l’endroit où les pixels rouges saturés apparaissent. Si les structures fluorescentes apparaissent en rouge, réduisez l’intensité et/ou le gain du laser jusqu’à ce qu’elles deviennent une nuance de gris.

Si nécessaire, ajustez le décalage. Ainsi, les zones à l’extérieur de l’échantillon sont bleues. Réglez le pour le plus petit diamètre qui permet de collecter les images en temps opportun.

L’intervalle Z doit toujours être réglé à la distance optimale suggérée pour le diamètre du sténopé, effectuer de courts balayages pour tester les paramètres, en utilisant toujours l’intensité laser la plus faible possible. Exécutez maintenant l’expérience pendant la durée souhaitée. Ensuite, retirez l’embryon de la phase chauffée et séparez lentement les lamelles de couverture, immergez le couvercle, glissez et embryonnez dans em dans une boîte de Pétri de 30 millimètres.

À l’aide d’une pipette en verre, lavez délicatement l’embryon de la lamelle et retirez la lamelle de la boîte de Pétri. Placez l’embryon dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pour continuer à se développer. À la fin des expériences, prenez des images individuelles de Zack d’embryons de frères et sœurs montés en agros qui étaient similaires à ceux du spécimen au début des expériences, mais qui ont été élevés dans un EM et un incubateur à 28,5 degrés Celsius.

Mesurez les arcs pharyngés au besoin à l’aide d’un logiciel confocal ou d’un autre logiciel de traitement d’imagerie chez des embryons de type sauvage. Après la population de la crête neurologique, les arcs pharyngiens s’allongent le long des EA ventrales antérieurs, postérieurs et dorsaux tout en se déplaçant dans une direction rostrale. À son extrémité antérieure, le premier arc pharyngé forme les domaines maxillaire et mandibulaire séparés par l’ectoderme buccal

Ici, le septième arc pharyngé ne parvient pas à migrer vers le rovers pour se chevaucher avec des arcs plus antérieurs 48 heures après la fécondation. Les cinq mutants du poisson-zèbre ont de nombreux défauts faciaux crâniens. Dans ces images confocales statiques.

Les fusions dans les domaines ventraux des deuxième et troisième arcs sont apparentes 32 heures après la fécondation. À l’aide de la microscopie confocale time-lapse, nous analysons la morphogenèse des arcs pharyngés. Dans Smad, les fusions de cinq mutants entre les deuxième et troisième arcs apparaissent pour la première fois 32 heures après la fécondation.

Cohérent avec l’analyse statique. Bien que l’expression des membres de la famille PDGF suggère qu’il pourrait être largement impliqué dans la morphogenèse de l’arc pharyngé, le mouvement des arcs postérieurs semble normal. Chez les mutants P-D-G-F-R-A, c’est la morphogenèse du premier arc pharyngé qui apparaît spécifiquement perturbée.

Cette procédure se prête à d’autres techniques couramment utilisées par le poisson-zèbre telles que l’injection de morpho ou la génération de mosaïques génétiques. Les analyses en accéléré permettent d’analyser directement les conséquences de ces manipulations. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une imagerie in vivo en accéléré d’embryons de poisson-zèbre transgénique en anesthésant et en montant correctement les échantillons et en réglant les paramètres idéaux pour la microscopie confocale.