Name: Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Apprenez à isoler des cellules T double négatives du rein de souris par digestion à la collagénase et sélection magnétique. Cette méthode permet d'obtenir une population pure pour étudier leur rôle dans les pathologies rénales.

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Ce travail est soutenu par le NIH PBS (R21 AI095484). Nous remercions l&#39;installation centrale de tétramère INSA de CD1d tétramère.

1. Préparation des instruments, de la culture des médias et réactifs <ol><li> Instruments: Préparer les réactifs dans des conditions stériles et utiliser sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Préparer 1 litre de milieu de culture RPMI tissulaire, ajouter 5% de sérum fœtal bovin, 2,1 g de bicarbonate, de 10 ml de glutamate 100x, 10 mg d&#39;HEPES, du pyruvate de sodium à 1 mg et de 10 ml de 100x de la pénicilline / streptomycine. Note: le milieu de culture tissulaire recommandé, RPMI, est interchangeable avec DMEM. </li><li> Préparer une solution à 5% de collagénase &quot;D&quot; (5 ml de collagénase &quot;D&quot; à 9 ml de milieu de culture de tissu). </li><li> Ajoutez la solution de Percoll à trois concentrations différentes: 100%, 80% et 40%. Les concentrations suivantes sont calculées pour 1 échantillon. Conserver les solutions à la température ambiante. <ol><li> Solution de Percoll: ajouter 9 ml de Percoll (non dilué de solution mère); ajouter 1 ml de PBS 10x. </li><li> Solution de Percoll: ajouter 8 ml de Percoll 100%; ajouter 2 ml de PBS 1x. </li><li> Solution de Percoll:ajouter 4 ml de Percoll 80%; ajouter 4 ml de PBS 1x. </li></ol></li><li> Ajoutez 1 L de cellules activé par fluorescence (FACS) tampon; ajouter 5 ml 10% de BSA (BSA à 0,1%), l&#39;azoture de sodium 1 ml de 10% (0,1%), l&#39;agent 2 ml d&#39;EDTA, faire jusqu&#39;à 1000 ml avec PBS 1x. </li></ol> 2. Préparation du rein Digestion <ol><li> Ayant acquis une approbation institutionnel nécessaire, sacrifier et être exsangue la souris avec les méthodes standard et en suivant les réglementations en vigueur et des directives de protection des animaux. <ol><li> Anesthésier les souris avec du pentobarbital (0,07 mg / kg). </li><li> Passez à la saignée. </li><li> Placez la souris dans une position couchée sur une table d&#39;opération. </li><li> Pulvériser la zone abdominale avec 70% d&#39;éthanol. </li></ol></li><li> Ajouter 10 ml de solution de collagénase D de la boîte de Pétri. </li><li> Retirez et décapsuler les deux reins de chaque souris. <ol><li> Ouvrir la cavité de abdomimal en faisant une incision médiane abdominale à travers la peau et du péritoine du sternum aule pubis. </li><li> Exposer le rein gauche en déplaçant l&#39;intestin latéralement sur le côté. </li><li> Séparez délicatement la capsule gauche avec la pince. Remarque: La capsule apparaît comme une couche transparente qui entoure le rein et partiellement recouvert par le tissu adipeux périrénal. </li><li> Retirez le rein gauche en coupant les vaisseaux pédiculaires en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux. </li><li> Répétez cette procédure pour le rein droit. Remarque: Le rein droit est plus crânienne et plus proche de la ligne médiane (pédicelles sont plus courts). </li></ol></li><li> Placez le rein dans la boîte de Pétri. </li><li> Couper le tissu rénal en petits morceaux (1 à 2 mm en dimension) en utilisant une lame de mise en forme régulière de métal et placer les morceaux dans la solution de collagénase pendant 30 à 45 min dans un incubateur à 37 ° C (figure 1). </li></ol> 3. Préparation des cellules mononucléées du rein (KMNC) à partir de la digestion du rein <ol><li> Obtenir une suspension de cellules du reindigestion par perturbant mécaniquement le tissu à l&#39;aide d&#39;une passoire (70 um) et remettre en suspension dans 25 ml de milieu de culture de tissus et mélanger. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter la suspension cellulaire. </li><li> Re-suspendre le culot dans 4 ml d&#39;une solution de Percoll à 40% et doucement superposer à 4 ml d&#39;une solution de Percoll à 80% avec une pipette de transfert de matière plastique, très lentement et avec précaution. Cela se traduira en deux phases nettement séparées par une couche translucide. Sur le sommet sera une couche jaune correspondant aux lipides. </li><li> Centrifuger à 1500 g pendant 30 min à température ambiante avec la centrifugeuse dans le mode frein. </li><li> Retirer par aspiration de la couche supérieure jaune et épaisse (environ 1-2 ml). </li><li> Ne recueillir que la légère couche translucide blanchâtre de l&#39;interface des deux phases avec une pipette de transfert. Transférer très soigneusement cette suspension dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de milieu de culture tissulaire, puis ajouter 13 ml de milieu pour obtenir un volume total de15 ml. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les échantillons dans 1 ml de milieu. </li><li> Comptez le nombre de KMNC utilisant exclusion au bleu trypan sur un hématimètre et exprimer les résultats sous forme de nombres de KMNC par ml par rein. </li><li> Laver une fois comme ci-dessus. </li></ol> 4. Isolation de hématopoïétiques (CD45 +) Les cellules de KMNC (étape I) <ol><li> Remettre en suspension les cellules jusqu&#39;à 10 7 dans 90 ul de tampon de migration. </li><li> Ajouter 10 ul de microbilles CD45 et incuber pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon courante pour arrêter la réaction. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de tampon de migration. </li><li> Préparer la colonne magnétique en plaçant à l&#39;aimant et rincer avec 3 ml de tampon de migration. </li><li> Faire passer la suspension de cellules à travers la colonne magnétique et de recueillir les cellules non marquées qui passent à travers la colonne. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 3 ml de runntion tampon. Ramassez ensuite l&#39;effluent. </li><li> Supprimez la colonne du séparateur et la pipette 5 ml de tampon fonctionnant sur les colonnes et débusquer la fraction marqué immédiatement. Cette fraction contient des cellules CD45 +. Compter les cellules. </li><li> Pour calculer le nombre absolu de cellules T différents sous-ensembles dans les reins de multiplier le nombre total de KMNC par le pourcentage de cellules positives déterminé par cytométrie de flux (Figure 2). </li></ol> 5. L&#39;isolement de cellules T DN CD45 + de préparation par une sélection négative (étape II) <ol><li> Ajouter 2,5 pi (0,5 mg / ml, 1,25 ug) de chacun des anticorps biotinylés suivants: anti-CD4, anti-CD8, anti-récepteur Fc (CD16/32), anti-CMH de classe II (I-Ab), anti- CD1d PBS-57 tétramère pour 10 cellules hématopoïétiques 7. </li><li> Incuber les cellules pendant 30 min dans une chambre froide. </li><li> Ajouter 1 ml microbilles anti-biotine. </li><li> Incuber pendant 30 min dans une chambre froide. </li><li> Placer le tube dans til aimant et procéder à l&#39;épuisement. </li><li> Compter le nombre de cellules viables pour déterminer le nombre total de cellules T DN dans la fraction négative en utilisant un hématimètre. </li><li> Vérifiez la pureté des cellules T DN cytométrie de flux en suivant cette stratégie de déclenchement: première porte CD45 +, deuxième porte TCRaß +. Exclure CD1d cellules +. Terrain CD4 + CD8 + contre pour identifier les cellules T DN (Figure 3). </li><li> Multipliez le nombre total par le pourcentage déterminé en pureté. Note: L&#39;utilisation de ce protocole pour résultat une population de plus de 90% de cellules T DN pures. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Il ya un intérêt croissant dans les cellules T DN car ils sont impliqués dans différentes pathologies telles que les troubles auto-immunes, le cancer, la tolérance du greffon, et les maladies primaires du rein, y compris insuffisance rénale aiguë (IRA), la glomérulonéphrite 8, 13. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre et caractériser les fonctions physiopathologiques de cellules T DN. Toutefois, actuellement, il ya un manque de compréhension de la fonction de ces cellules par rapport aux cellu...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Périphérique αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double négatif cellules (DN) T sont divisés en différents sous-ensembles qui possèdent des phénotypes et des fonctions distinctes 1-4. Cellules T DN sont mal compris, mais de plus en plus impliqués dans les réponses immunitaires physiopathologiques dans différents modèles de maladies 4-6. Cellules DN T sont un type de cellule immunitaire unique qui est de plus en plus impliqué dans la régulation de diverses réponses immunitaires et auto-immunes et la modulation de la tolérance allogreffe. 4-6, 9 Ils sont rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions de la rate et des ganglions lymphatiques ). Cependant, ils sont les principaux habitants du rein et de l&#39;intestin épithélium normal 10-12. On sait très peu sur leur fonction 7 dans le rein à l&#39;état stationnaire et dans des conditions pathologiques telles que l&#39;insuffisance rénale aiguë (IRA) associée à rein transplfourmi. En raison des rôles complexes de cellules immunitaires différentes dans la régulation des réponses immunitaires, y compris alloresponses, définissant le rôle de chaque joueur est critique dans la compréhension alloresponses et la conception de nouveaux produits thérapeutiques. Étant donné le nombre important de cellules T DN présents dans le rein dans des conditions physiologiques et pathologiques différentes, les cellules T DN sont susceptibles de jouer un rôle critique dans la régulation des réponses immunitaires et auto-immunes chez la souris et chez l&#39;homme, et alloresponses chez les greffés. Accumuler si la preuve encore dispersés implique cellules T DN dans les deux fonctions pathogènes et immunosuppresseurs, mais il est mal compris pourquoi et comment ils présentent une fonction nuisible ou suppressive spécifique et comment l&#39;environnement influe sur leurs décisions. En raison de leur faible abondance dans le rein, l&#39;amélioration des méthodes d&#39;isolement sont nécessaires. Il n&#39;existe actuellement aucun protocole standard pour l&#39;isolement de cellules de T DN Tes tissus non lymphoïdes. Notre protocole décrit un nouveau procédé pour l&#39;isolement de cellules provenant du rein DN T; Cependant, le procédé peut également être utilisé pour divers tissus non lymphoïdes.

<table><tbody><tr><td>Hotte à flux laminaire&nbsp ;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>Ou équipement équivalent&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Ou équipement équivalent&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à atmosphère contrôlée</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp ;( 37 &deg ; C avec 5 % de CO2)</td></tr><tr><td>Cytomètre analytique</td><td>en flux LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium à 0,1 % (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tampon salin tamponné au phosphate (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Tampon EDTA&nbsp ;</td><td>Colonnes Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp ;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles CD45+</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles de biotine&nbsp ;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone : 30-F11)&nbsp ; PerCP&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone : 30-F11)&nbsp ; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR Pacific Blue&nbsp ; (ab-chain, clone : H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biotinylé (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 biotinylé&nbsp ; (clone 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-CMH classe II (I-A b) biotinylé</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer&nbsp ;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J souris</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Reins - Ganglions lymphatiques Boîte de</td></tr><tr><td>Pétri&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956 ; Filtre M&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Plunger&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Ou équipement équivalent&nbsp ;</td></tr><tr><td>GeneMate Tubes 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>Ou équipement équivalent&nbsp ;</td></tr><tr><td>GeneMate Tubes 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>Ou équipement équivalent&nbsp ;</td></tr><tr><td>CD1d &#945 ;-galcer tétramère</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation de double negative αβ cellules t du rein

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Il n&#39;existe actuellement aucun protocole standard pour l&#39;isolement de cellules T DN à partir des tissus non lymphoïdes, malgré leur implication de plus en plus rapportée dans diverses réponses immunitaires. DN cellules T sont un type de cellule immunitaire unique qui a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires et de la tolérance aux allogreffes et auto-immunes 6.1. Cellules T DN sont cependant rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions rate et les ganglions), mais sont des résidents du rein normal. On sait très peu sur leur fonction physiopathologique 7 en raison de leur rareté dans la périphérie. Nous avons récemment décrit une analyse phénotypique et fonctionnelle complète de cette population dans le rein 8 dans l&#39;état d&#39;équilibre et pendant les lésions de reperfusion de l&#39;ischémie. Analyse de la fonction des cellules T DN sera grandement améliorée par l&#39;élaboration d&#39;un protocole pour l&#39;isolement du rein. Ici, nous décrivons un nouveau protocole qui permet isolation de cellules hautement purs ab CD4 + CD8 + T et les cellules T DN du rein murin. En bref, nous digérer le tissu rénal en utilisant de la collagénase et d&#39;isoler les cellules mononucléaires (rein) KMNC par gradient de densité. Ceci est suivi par deux étapes pour enrichir les cellules T hématopoïétiques de 3% à 70% de KMNC. La première étape consiste en une sélection positive des cellules hématopoïétiques CD45 + en utilisant un kit d&#39;isolement. Dans la seconde étape, les cellules T sont isolées à DN négativement par élimination des cellules non désirées à l&#39;aide de CD4, CD8, CMH de classe II et les anticorps monoclonaux et CD1d α-GalCer tétramère. Cette stratégie conduit à une population de plus de 90% de cellules T DN purs. la coloration de la surface avec les anticorps mentionnés ci-dessus, suivie par une analyse FACS est utilisée pour confirmer la pureté.

Type sauvage C57BL / 6 (B6) rein contient environ 1.5 à 2.1 x 10 6 cellules mononucléées par les reins. Environ moins de 10% de CD45 + des cellules hématopoïétiques. Pour la préparation de cellules mononucléaires (rein KMNC), les reins sont découpés en petits morceaux comme le montre la figure 1, suivie par la digestion à l&#39;aide de 5% de la collagénase. Ceci est suivi par l&#39;exécution d&#39;une centrifugation en gradient de densité à collecter KM...

Cellules DNabT sont rares chez les cellules T périphériques; cependant, ils sont abondants dans certains tissus non lymphoïdes. Difficulté d&#39;isoler les cellules T DN à partir de tissus non lymphoïdes entrave leur analyse fonctionnelle malgré l&#39;augmentation reconnu l&#39;importance physiopathologique. Nous décrivons un nouveau protocole pour l&#39;isolement de cellules T DN hautement purifiés à partir de rein de souris.

Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

L'objectif général de cette procédure est de décrire comment isoler des cellules T pures et doubles négatives à partir du rein de souris. Cette isolation est réalisée en digérant d'abord le rein dans une solution de collagénase. Ensuite, les cellules mononucléées sont séparées par gradient de densité, et les cellules hématopoïétiques positives pour CD45 sont récupérées par sélection positive.En fin de compte, les cellules T doubles négatives peuvent alors être isolées par sélection négative. En 1998, notre équipe a découvert que les cellules immunitaires, en particulier les cellules T, contrairement au dogme admis à l’époque, étaient à l’origine d’une atteinte rénale aiguë. Il y avait très peu de ces cellules dans le rein et le cœur à étudier, nous avons donc mis au point une technique pour mieux les étudier.Nous avons été surpris de découvrir une population de cellules, les lymphocytes T double négatif dépourvus de CD quatre ou de CD huit, présentes en nombre élevé, tant dans le rein normal qu’en cas de lésion. La technique détaillée et améliorée permettant d’étudier plus précisément ces cellules et d’explorer leurs mécanismes sera décrite dans la vidéo à venir. Nous étudions les lymphocytes T double négatif depuis 2001, et récemment, nous avons uni nos efforts au laboratoire du Dr. Rob afin de modifier la méthode régionale d’isolement de ces cellules pour obtenir une population pure pouvant être utilisée dans diverses réponses immunitaires biologiques.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les cellules immunitaires présentes dans le rein, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les tissus non lymphatiques. Avant de commencer la chirurgie, ajoutez d'abord 10 millilitres de collagénase D dans une boîte de Pétri destinée à la collecte des tissus. Ensuite, vaporisez la zone abdominale d'une souris euthanasiée avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, pratiquez une incision médiane à travers la peau abdominale et le péritoine, du sternum jusqu'au pubis, puis déplacez latéralement l'intestin afin d'exposer le rein gauche. Identifiez la capsule gauche, qui apparaît comme une couche transparente entourant le rein et est partiellement recouverte par le tissu adipeux péri-rénal, puis séparez-la soigneusement du rein à l’aide de forceps. Coupez ensuite le vaisseau pédiculaire avec des ciseaux chirurgicaux pour retirer le tissu, puis placez le rein dans la boîte de Pétri.Ensuite, après avoir retiré le rein droit, utilisez une lame métallique ordinaire pour découper le tissu rénal en petits morceaux d'un à deux millimètres. Digestez les morceaux dans la solution de collagénase pendant 30 à 45 minutes à 37 degrés Celsius, puis, pour isoler les cellules mononucléées rénales, homogénéisez mécaniquement la suspension rénale à l’aide d’un tamis de 70 microns. Resuspendez la suspension cellulaire dans 25 millilitres de milieu de culture tissulaire.Ensuite, après un mélange doux, centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans quatre millilitres de solution Percoll à 40 %. Puis, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, déposer délicatement la solution cellulaire Percoll sur quatre millilitres de solution Percoll à 80 % afin de former deux phases clairement séparées par une couche translucide. Incuber les cellules pendant 30 minutes à 1500 g et à température ambiante sans frein, puis prélever environ un à deux millilitres de la couche supérieure épaisse et jaune contenant les lipides.Utilisez une nouvelle pipette de transfert pour prélever la couche légèrement blanchâtre et translucide située à l'interface des deux phases, puis transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres contenant deux millilitres de milieu de culture tissulaire. Ajoutez ensuite 13 millilitres de milieu afin d'obtenir un volume total de 15 millilitres. Après lavage et comptage, diluez les cellules à une fois 10 puissance sept dans 90 microlitres de tampon de migration.Incubez ensuite les cellules dans 10 microlitres de microbilles CD45 à quatre degrés Celsius. Après 15 minutes, ajoutez un millilitre de tampon de lavage pour arrêter la réaction. Ensuite, centrifugez les cellules et resuspendez-les.Suspendez le culot dans 500 microlitres de tampon de migration frais. Ensuite, placez une colonne dans un aimant de séparation des billes et rincez la colonne avec trois millilitres de tampon de migration. Puis faites passer la suspension cellulaire à travers la colonne magnétique, en recueillant les cellules non marquées qui traversent la colonne.Lavez le tube contenant les cellules trois fois avec trois millilitres de tampon de lavage, en récupérant à chaque fois l'effluent, puis retirez la colonne de l'aimant. Ajoutez cinq millilitres de tampon de lavage sur la colonne à l’aide d’une pipette et éluisez immédiatement la fraction marquée contenant les cellules positives pour le CD 45. Ensuite, après avoir dénombré les cellules, incubez-les avec 2,5 microlitres de chacun de ces anticorps biotinylés par 1 × 10⁷ cellules hématopoïétiques, à quatre degrés Celsius.Après 30 minutes, incuber les cellules pendant une autre demi-heure à quatre degrés Celsius dans un millilitre de microbilles anti-biotine. Placer une nouvelle colonne dans l'aimant, puis charger les cellules sur la colonne comme vient de l'être démontré, en récupérant cette fois la fraction négative. Enfin, dénombrer les cellules viables afin de déterminer le nombre total de cellules T doublement négatives dans la fraction négative, puis multiplier ce nombre par le pourcentage de pureté déterminé par analyse cytométrique en flux.Tandis que les reins de souris C57, type black six, contiennent environ 1,5 à 2,1 × 10⁶ cellules mononucléées par rein, moins de 10 % sont des cellules hématopoïétiques positives pour CD45. Après centrifugation sur gradient de densité permettant de récupérer la couche de cellules mononucléées rénales, les cellules positives pour CD45 peuvent être davantage purifiées à hauteur de 80 à 95 % par séparation magnétique à l’aide de billes magnétiques positives pour CD45. Parmi les cellules hématopoïétiques enrichies positives pour CD45, environ 30 à 60 % sont des lymphocytes T double négatif.Sélection négative des cellules CD45 positives pour éliminer les cellules positives pour CD4, CD8, pour le CMH de classe II et les cellules tétramères positives, ce qui donne des cellules T doublement négatives hautement purifiées, avec une pureté de 90 à 95 %. À l’aide de ce protocole, il est possible d’obtenir jusqu’à 0,5 × 10⁶ cellules hématopoïétiques CD45 positives marquées magnétiquement par souris. Cette procédure permettra une meilleure compréhension des fonctions biologiques et des mécanismes d’action des fractions de cellules T doublement négatives dans diverses pathologies.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

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